昆虫病原线虫共生菌菌株S1与果蝇imd信号途径2种突变体的互作研究
昆虫病原线虫共生菌菌株S1与果蝇imd信号途径2种突变体的互作研究[20200614171649]
摘 要： 4
关键词 4
Abstract 4
Key words 5
1引 言 5
1．1 昆虫病原线虫共生菌 5
1.1.1昆虫病原线虫介绍 5
1.1.2 昆虫病原线虫共生菌介绍 5
1.2 Serratia nematodiphila 介绍及研究意义 6
2 实验材料与方法 7
2.1 前期准备 7
2.1.1 实验器材 7
2.1.2 实验需要的培养基的配制 7
2.2 实验步骤 8
2.2.1 实验准备步骤 8
2.2.2 果蝇肠道侵染实验步骤 8
2.2.3 果蝇血腔侵染实验步骤 9
2.2.4 活体果蝇体内菌落计数 11
3结果与分析 11
3.1 肠道侵染实验 11
3.1.1大肠杆菌侵染与S1菌株侵染比较 11
3.1.2 野生型与突变型果蝇的比较 12
3.2 血腔侵染实验 13
3.2.1大肠杆菌侵染和S1菌株侵染的比较 13
3.2．2野生型与突变型果蝇的比较 15
3.3 菌落计数 15
4 讨论 16
致谢 17
参考文献： 17
昆虫病原线虫共生菌菌株S1与果蝇imd信号途径2种突变体的互作
摘 要：果蝇具有包括体液免疫、细胞免疫和黑化反应等先天性免疫应答系统，能够对病原微生物感染，做出快速有效反应。果蝇的体液免疫包括了Toll信号途径和Imd信号途径，在Imd信号途径中含有多种突变体。本研究中，挑选了野生型和两种Imd途径突变型Ken和FADD的果蝇，以及Serratia nematodiphila细菌中的S1菌株作为实验材料，研究了在肠道侵染和血腔侵染等两种不同的处理方案，相同的细菌S1的侵染下，两种突变型果蝇与野生型果蝇的死亡率的差异，同时又用大肠杆菌作为S1菌株的阳性对照。研究表明，三种果蝇的死亡率有所不同，说明其免疫机制略有差异！
关键词 果蝇，imd信号途径，免疫机制, Serratia nematodiphila细菌S1菌株，
Interaction between the Entomopathogenic nematodes symbiotic bacteria S1 of Serratia nematodiohila and the two mutants Ken,FADD of Drosophila melanogaster in the Imd signal pathway
Abstract Drosophila melanogaster is an important model organism for understanding basic biological and human disease mechanisms. Drosophila, lacking an adaptive immune system found in mammals, but involving humoral immunity, cellular immunity and melanization, can resist rapidly and effectively to infection of various microorganisms. Drosophila humoral immunity, include Toll signal pathway and Imd signal pathway, and Imd signal pathway contains a variety of mutant. In this study, choose the way of wild type and two kinds of Imd mutant flies as experimental material, studied in different treatment scheme, the same bacteria S1 under the infection of two mutant drosophila and wild-type flies differences in mortality rates. Research shows that three flies mortality is different, that their immune mechanism is slightly different!
Key words Drosophila，Imd signal pathway，bacteria Serratia nematodiphila S1，The immune mechanism
1引 言
果蝇不像人类拥有B、T淋巴细胞一样，拥有高度专一的获得性免疫系统，已有的研究表明，果蝇具有3种先天性免疫应答系统，即体液免疫、细胞免疫还有黑化反应【1】。在3种免疫应答系统的作用下，果蝇能够对侵入体内的病原微生物作出快速有效的免疫反应。
而病原微生物侵染果蝇后，会进行一系列的隐瞒或者调整，以确保它们能够在宿主果蝇的免疫反应下继续生存下去【2,3】。昆虫病原线虫共生菌菌株S1是一种强有力的昆虫病原细菌，它能够快速的引起宿主果蝇表达出分子产物进行免疫反应，而这，对于我们来说，则是一个探索免疫的分子基础的一个有用工具。在侵染过程中，S1能够在昆虫中迅速繁殖，并且产生出一系列的毒素，抑制宿主果蝇的免疫吞噬，其结果是，最终杀死宿主果蝇【2】。
1．1 昆虫病原线虫共生菌
1.1.1昆虫病原线虫介绍
昆虫病原线虫是指一类专性寄生昆虫的线虫，它消化道内携带有病原菌，当它从昆虫消化道或体壁侵入昆虫寄主体内后，共生菌从线虫体内释放出来，在昆虫血液内增殖，最终使寄主昆虫感染病原杆菌患败血症而死亡。目前世界上描述定名的这一类线虫，主要是斯氏线虫科和异小杆线虫科的线虫。
昆虫病原线虫生活史中有一个侵染期线虫阶段，称之为侵染期线虫。侵染期线虫不取食，独立于昆虫体外自由生活，在自然界土壤中可分离到昆虫病原线虫的侵染期幼虫【4】。
1.1.2 昆虫病原线虫共生菌介绍
昆虫病原线虫共生菌，是存在于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌, 在系统分类上，属于肠杆菌科( Enterobacteriaceae), 兼性厌氧, 包括光杆状菌属【10】( Photorhabdus)、致病杆菌属【11】( Xenorhabdus)和沙雷氏菌属【】（Serratia）, 它们分别与异小杆线虫属【12】(Heterorhabditis) 斯氏线虫科【12】(Stenernematidas) 、和拟异小杆菌属【】（Heterorhabditidoides）的线虫共生。在自然界, 共生菌存在于 3 龄侵染期线虫的肠道中, 不能从土壤中分离获得, 是昆虫病原线虫的主要致病因子【5】。
多年来，随着对昆虫病原线虫及其共生菌的不断深入研究，共生细菌的多种生物学功能不断被发现，简单而言，主要有以下的一些作用：
（1）、共生菌可以分泌出广谱抑菌活性物质，这些活性物质之中，已经有一些物质显示出了良好的商业开发前景；
（2）、共生菌产生的杀虫毒素对多种害虫有较强的致死作用，尤其是胞外蛋白毒素的发现，为生物农药的开发和抗虫基因工程提供了新的杀虫剂因资【5】；
（3）、共生菌作为一类特殊生境下的细菌，还产生多种对人类癌细胞具有较强抑制作用的活性物质，为研制抗癌新药物提供了新材料【5】。
除了上述所说的3种功用之外，共生菌也表现出了其他的一些特性，而这些特异的生物学功能使昆虫病原线虫共生菌已经成为了一类新型的具有开发潜力和应用前景的生物资源，因此，大家也是越来越重视对昆虫病原线虫共生菌作用于昆虫身上的研究。
这些研究也为研究病原体毒力基因与宿主免疫基因之间的相互作用铺平了道路，通过对共生菌感染无脊椎动物的研究，可以过渡到对脊椎动物的病原感染研究上，能让大家了解到更多的昆虫病原线虫共生菌，甚至于，最终可以应用于人类病原体的研究，成为研究人类病原体的飞跃【3】。
1.2 Serratia nematodiphila 介绍及研究意义
S1菌株是Serratia nematodiphila菌种的一个菌株，Serratia nematodiphila在系统分类上，属于Enterobacterianceae科，Serratia属，除此之外，还有Serratia marcescens和Serratia sakuensis两个种的细菌都属于这一个分类。以上三种细菌都是与Heterorhabditidoides chongmingensis线虫共生。
后两种细菌与果蝇的作用已经被了解的比较透彻，而Serratia nematodiphila细菌则是一种比较新的细菌，对果蝇的作用还是不明朗，它没有被归分到其他两种种类中，也是有它的原因的，Serratia nematodiphila细菌与其他两种细菌相比较，在表性特征上，就有很大的不同。
比如说精氨酸水解酶的活性比较上，就有很大不同；再比如，它不同于其他两种细菌，他可以在以D-乳糖，D-阿拉伯糖，蜜三糖，D-木糖，蜜二糖，乳酸等为唯一碳源的培养基中生存，但是，不能够在以草酸为唯一碳源的培养基中生存。
Serratia nematodiphila细菌都是需氧型的革兰氏阴性菌，显微表示为短杆状，菌体大小在0.8-1.3*0.6-0.7微米，菌体外有一条鞭毛，能够运动，在营养琼脂上培养的菌落呈现为红色圆斑状，菌落边缘光滑，生存条件比较广泛，能够在4-42℃、pH5-11、2-7%NaCl的条件下生存，最适温度为30-37℃，最适pH为6-10【7】。
研究S1菌株，主要是因为S1菌株是Serratia nematodiphila细菌中的一个菌株，而对于Serratia nematodiphila细菌的研究也不是很明朗，通过对S1菌株的研究，能够让大家更加了解Serratia nematodiphila细菌，不管是在科研，还是在临床应用上，都将是一个突破。
2 实验材料与方法
2.1 前期准备
本课题需要从多个不同的方向进行实验验证，从而得到实验结论，实验进行之前，也需要准备多种实验器材，做很多的实验准备。
2.1.1 实验器材
果蝇培养基配制材料：琼脂条、蔗糖、玉米粉、酵母粉、丙酸等，LB培养基配制材料：胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠（NaCl）、琼脂等，1000微升、200微升移液枪各一，烧杯两个，玻璃棒，酒精灯，超净工作台，吸光光度计/酶标仪等。
以下物品都需要在使用前灭菌：用以摇菌的长试管若干，1.5毫升离心管若干，专用的果蝇培养管若干，以及专用的1000微升、200微升的枪头若干，50mmol/L的蔗糖水500ml，平板若干，配制各培养基所用的水均为去离子水。
2.1.2 实验需要的培养基的配制
实验室果蝇培养基配方：
（1）4瓶/12管：水，150ml；琼脂，1.5g；蔗糖，13g；玉米粉，17g；酵母，3g；丙酸，1-1.5ml
（2）11瓶/32管：水，412.5ml；琼脂，4.13g；蔗糖，35.75g；玉米粉，46.75g；酵母，8.25g；丙酸，3-4.5ml
配制方法：
（1）称量相应质量的蔗糖、玉米粉、酵母粉，将这3种物品倒入同一个烧杯中，记A；
（2）然后再称量相应质量的琼脂条，放在另一个烧杯中，记B；
（3）用量筒量取相应体积的去离子水，分开倒入两个烧杯中，用玻璃棒搅拌A烧杯，使A烧杯中的用品溶解；
（4）然后将两个烧杯放到微波炉中加热，待B烧杯中的琼脂条溶解之后，将B烧杯中的溶液倒入到A烧杯中；
（5）之后继续加热，每过20-30秒钟的时间将A烧杯从微波炉中拿出，然后用玻璃棒搅拌防止玉米粉沉底，6-7分钟后，即可准备分装。
液体LB培养基配方：胰蛋白胨（Tryptone）10g/L；酵母提取物（Yeast Extract）5g/L；氯化钠（NaCl）10g/L,用去离子水溶解，121℃高压灭菌；
固体LB培养基配方：在液体培养基的基础上，再加琼脂（Agar）15g/L，用去离子水溶解，121℃高压灭菌待用。
2.2 实验步骤
本次课题研究，维持时间两个多月，所做实验可以分为4各部分：实验准备、果蝇肠道侵染、果蝇血腔侵染以及活体果蝇体内菌落计数，下面对这四个方面逐一详细说明。
2.2.1 实验准备步骤
1、各种实验材料的准备。将上述需要灭菌的实验器材全部用报纸包好，在121℃的高压灭菌锅中灭菌25min，然后取出，在烘箱中烘干，备用；
2、果蝇培养基的配制。果蝇培养基配制完成之后，待培养基冷却到60℃以下时，加入1-3ml丙酸，搅拌，然后迅速将培养基分装到已经灭过菌的果蝇培养管中，每管分装2-3cm高，冷却待用；
3、LB培养基（L/S）的配制。按照上述LB培养基配方，配制50ml固体LB培养基，高压灭菌之后，在超净工作台中倒平板，每10ml左右培养基倒一块平板，等待平板中培养基冷却凝固，晾干备用；同时配制100ml液体LB培养基，灭菌，在超净工作台中将培养基分装到已灭菌的试管中，密封，备用；
4、果蝇培养。选定实验所需要的两种突变体果蝇，接种，接种前需要在果蝇培养基的表面撒上少量的酵母粉，以利于果蝇对培养基的吸收；接种时，为了保证之后果蝇繁殖胜利，需要对每种果蝇接种3-4管，每一管中果蝇需要10-12只，而且雌雄果蝇各一半最佳；
5、果蝇接种后的观察。在25℃的条件下，果蝇培养从卵到成虫的时间大约在10-14天【4】，在培养6-7天的时候，培养管中能够看得到果蝇幼虫，而若是在这段时间里面观察不到果蝇幼虫，则选择更换果蝇培养基，或者更换一管新的培养基；
6、果蝇的扩繁。实验需要大量的各类果蝇，需要对果蝇进行扩繁；
注：选择扩繁的母体果蝇管在接种时，需要有几个条件，即：母体果蝇管中果蝇较多，密度大；母体果蝇管的培养基中，需要能够观察到有果蝇幼虫，避免培养基的浪费。
7、划平板。取出冷冻中的大肠杆菌菌种以及实验所需S1菌种，捂热解冻，然后再在超净工作台中，分别吸取100微升菌液进行划平板，并在37℃的温箱中培养8小时左右，观察是否有单菌落，然后密封平板，保存在-18℃的冰箱中，备用。
2.2.2 果蝇肠道侵染实验步骤
1、准备9支空的果蝇培养管，每支果蝇培养管底部垫上吸水纸，用报纸包好，高压灭菌，然后烘干，备用；
2、挑选单菌落、接种摇菌。从冰箱中取出划好的平板，用接种针挑选单菌落，接种到LB培养液试管中，然后在37℃的恒温摇床中摇菌24小时，再将平板封好，放回原冰箱中，备用（以上操作在超净工作台中完成）；
3、取3支灭菌的空果蝇培养管，与含有果蝇的果蝇培养管对接，使待用作实验的果蝇进入空的培养管中，做好记号，饥饿处理2-3小时，能够促进实验时，果蝇对于蔗糖溶液的取食；
注：本步实验，可以根据具体情况，改变对接的灭菌空管的数量，避免造成因培养管中果蝇密度过大而引起果蝇伤亡。
4、OD600nm值测定。从试管中吸取1000微升菌液置于1.5ml离心管中离心，去上清，然后用1000微升50mmol/L的无菌蔗糖水重悬沉淀，吸取200微升重悬液测量OD值，通过调节菌液浓度，最终使OD值达到0.1左右，备用；
注：这里调节OD值时，并非直接将菌液OD值调节到0.1，而是OD值达到1.0时，用50mmol/L的无菌蔗糖水稀释十倍左右，使之达到0.1。
5、将上述9支果蝇培养管分成3组，记为A、B、C三组，分别在A组的3支培养管中添加2ml的50mmol无菌蔗糖溶液，作为对照组；分别在B组的3支培养管中添加上述2ml的OD600nm=0.1的S1菌液，作为实验组；分别在C组的3支培养管中添加上述2ml的大肠杆菌菌液，与B组的实验组形成阴性对照，并且分别在培养管上标注清楚；
注：添加3种溶液时，需要直接滴加在培养管中的吸水纸上，尽量避免有液体黏在培养管的内管壁上，避免造成果蝇被黏在管壁上，而造成外部损伤。
6、将步骤3中饥饿处理的果蝇用乙醚迷晕，然后将迷晕了的果蝇分别对号平均装到9支处理过的培养管中，同时在培养管的外壁上做好标记，以及记录相应的果蝇数量；
注：果蝇在分装到9支处理过的培养管中的之后一段时间，仍然会处于昏迷状态，为了避免对果蝇造成伤害，在果蝇没有从昏迷中醒过来，并且具有行动能力之前，需要将培养管横放，让果蝇在培养管内壁缓慢苏醒。
7、观察与记录。步骤6中的果蝇苏醒之后，将9支培养管都放回果蝇培养箱中培养，之后，每过24小时，观察记录一次果蝇的死亡数，连续6-7天（实验组果蝇全部死亡）；
2.2.3 果蝇血腔侵染实验步骤
1、准备6支空的果蝇培养管，每支果蝇培养管底部垫上吸水纸，用报纸包好，高压灭菌，然后烘干，备用；
2、挑选单菌落、接种摇菌。从冰箱中取出划好的平板，用接种针挑选单菌落，接种到LB培养液试管中，然后在37℃的恒温摇床中摇菌24小时，再将平板封好，放回原冰箱中，备用（以上操作在超净工作台中完成）；
3、OD600nm值测定。从试管中吸取1000微升菌液置于1.5ml离心管中离心，去上清，然后用1000微升无菌水重悬沉淀，吸取200微升重悬液测量OD值，通过调节菌液浓度，最终使OD值达到0.1左右，备用；
注：这里调节OD值时，并非直接将菌液OD值调节到0.1，而是OD值达到1.0时，用无菌水稀释十倍左右，使之达到0.1。
4、在上述6支已经处理的培养管中，全部加入2ml的50mmol/L的无菌蔗糖水，注意蔗糖水不能黏在内管壁上，备用；
5、取3支灭菌的空果蝇培养管，与含有果蝇的果蝇培养管对接，使待用作实验的果蝇进入空的培养管中，做好记号；
6、直接用注射器吸取少量乙醚，对培养管中的果蝇进行麻醉，待果蝇全部被麻醉之后，则可以进行下一步操作；
7、扎果蝇。将一应器材：台灯、钨丝针、OD=0.1的菌液、酒精灯、放大镜、灭菌的白纸准备齐全之后，就可以进行针扎实验：
首先，用酒精灯灼烧钨丝针，进行灭菌；
其次，将麻醉后的果蝇倒出一部分，在已灭菌的白纸上；
再次，将菌液混匀，用钨丝针沾取菌液，在放大镜下对果蝇进行针扎，针扎的部位如下图所示：
图1【3】
说明：图上所示为针扎果蝇的部位，左右两边为对照说明。
注：本实验步骤中，每次从培养管中倒出的果蝇不应过多，每次可以控制在15只左右，防止针扎实验还没有结束，果蝇就已经苏醒，从而乱飞的现象。
8、将大肠杆菌和S1细菌侵染的果蝇分别放入相应的培养管中，并且在果蝇培养管外壁做好记号，等待果蝇从麻醉状态中苏醒，并且记录好每一管中，果蝇的存活数量；
9、观察与记录。将扎好的果蝇放回培养箱中继续培养，没过6小时，观察记录一次，统计相应时间内，各管果蝇的死亡数和存活数，直到实验组全部死亡。
2.2.4 活体果蝇体内菌落计数
由于肠道侵染实验所需时间太长，所以本实验全部针对血腔侵染试验中的实验果蝇。
1、 从各种正在实验的果蝇培养管中，接一只活的被侵染的果蝇，用乙醚麻醉；
2、 待果蝇被完全麻醉之后，将之倒出，在无水酒精中漂洗，洗掉或者杀灭果蝇体表可能沾染上的实验菌体；
3、 在专用的研钵中，用1000微升的无菌水彻底将果蝇粉碎、研磨，使果蝇体内的菌体完全溶于无菌水中；
4、 对于0小时和6小时两个时间段的果蝇，分别取10微升和100微升的研磨液于1.5ml的离心管中，用无菌水稀释到1000微升，即稀释100倍和10倍，而对于12小时和15小时两个时间段的果蝇，则将之分别稀释100倍和1000倍；
5、 涂布。分别吸取100微升的稀释液，在事前准备好的添加了特定抗生素的平板上涂布，分别做好标记；
6、 细菌培养。将做好标记的平板密封，放倒37℃的温箱中进行培养，24小时后，进行观察；
7、 观察与记录。记录每一块平板上的菌落数量，留作分析。
3结果与分析
3.1 肠道侵染实验
3.1.1大肠杆菌侵染与S1菌株侵染比较
A 两种细菌侵染野生型果蝇的比较
B 两种细菌侵染突变体果蝇Ken的比较
C 两种细菌侵染突变体果蝇FADD的比较
注：以上三图中，红色的线均表示大肠杆菌侵染果蝇肠道后，各相应果蝇随着时间的推移的存活率；蓝色的线则表示S1菌株侵染果蝇肠道后，各相应类型的果蝇随时间的推移的存活率
Fig. 1 The red line showed the survival rate of each corresponding Drosophila over time after the E.coli infecting it’s intestinal; The bleu line showed after the bacteria Serratia nematodiphila S1 infecting it’s intestinal,the survival rate is.
分析：从上述3图可以看出来，大肠杆菌肠道侵染的实验的结果是，大肠杆菌的侵染不能够导致果蝇死亡，即，大肠杆菌并非果蝇的致病菌，而S1菌株侵染的结果是，野生型果蝇和两种突变型Ken、FADD果蝇都是在6天左右的时间全部死亡，同时，大肠杆菌侵染和S1菌株侵染的实验步骤都是按照上面所述的实验步骤实施下来的，所以也能说明，果蝇的死亡原因就是因为肠道感染了S1菌株，S1菌株在果蝇肠道内增殖，产生毒素，致死果蝇！
3.1.2 野生型与突变型果蝇的比较
S1菌株侵染3种果蝇肠道，果蝇存活率的比较
注：“wt”——野生型；“Ken”——5号突变体Ken；“FADD”——6号突变体FADD；上图中3条折线表示在S1的侵染下，3类果蝇随着时间的存活率
Fig. 2 “wt”-wide type; “Ken”-The mutant 5 Ken; “FADD”- The mutant 6 FADD; The 3 lines above showed that the survival rate of each corresponding Drosophila over time after the bacteria Serratia nematodiphila S1 infecting their intestinal
分析：肠道侵染实验，实际上是果蝇喂养试验，即，用带细菌的培养液培养果蝇，让果蝇取食时，S1菌株能够进入果蝇的肠道。上图所示，在喂养果蝇的第一天、第二天，3类果蝇均有少数死亡，果蝇的死亡率均在10%左右，死亡数较少，而在接下来的三天时间内，则是果蝇的死亡高峰期，存活率降低到10%左右。
从相应时间点上的果蝇存活率来看，在第一天的24小时内，三类果蝇的死亡率非常接近，存活率都在95%以上，从数据上来看，我们可以认为是果蝇的个体差异造成的；在第二天的24小时内，三类果蝇的死亡率开始出现差异，“wt”的存活率比“FADD”的存活率高5%左右；接下来的24、48、72小时的试验时间中，“wt”的存活率明显比“Ken”、“FADD”高10-15%，这一段时间证明在S1菌株的肠道侵染情况下，“wt”比“Ken”、“FADD”在免疫上，具有更大的调节能力；而，三类果蝇都在144小时之后死亡，也证明S1菌株对于果蝇来说，毒性很强，而在“Ken”和“FADD”之间，差异则不是很明显。
3.2 血腔侵染实验
3.2.1大肠杆菌侵染和S1菌株侵染的比较
A 两种细菌侵染野生型果蝇血腔，果蝇的存活率比较
B 两种细菌侵染突变体果蝇Ken血腔，果蝇的存活率
C 两种细菌侵染突变体果蝇FADD血腔，果蝇的存活率
注：以上三图中，红色的线均表示大肠杆菌侵染果蝇血腔后，各相应果蝇随着时间的推移的存活率；蓝色的线则表示S1菌株侵染果蝇肠道后，各相应类型的果蝇随时间的推移的存活率
Fig. 3 The red line showed the survival rate of each corresponding Drosophila over time after the E.coli infecting it’s hemocoel; The bleu line showed after the bacteria Serratia nematodiphila S1 infecting it’s hemocoel, the survival rate is.
3.2．2野生型与突变型果蝇的比较
S1菌株侵染3类果蝇血腔，果蝇存活率的比较
注：“wt”——野生型；“Ken”——5号突变体Ken；“FADD”——6号突变体FADD；上图中3条折线表示在S1的侵染下，3类果蝇随着时间的存活率
Fig. 2 “wt”-wide type; “Ken”-The mutant 5 Ken; “FADD”- The mutant 6 FADD; The 3 lines above showed that the survival rate of each corresponding Drosophila over time after the bacteria Serratia nematodiphila S1 infecting their hemocoel
分析:血腔侵染实验，实际上就是针扎实验，即，用沾取了实验菌体的钨丝针从果蝇的胸部刺入果蝇体内，将实验菌直接带入果蝇的血腔中。上图所示，在六小时之内，果蝇死亡率很低，基本上在5%以下，死亡数很少，而在6-15小时这一段时间上，果蝇死亡数剧增，到15小时时，果蝇已经基本死亡，到18小时，果蝇全部死亡。
从上图分析，在前六个小时内，“1”“5”“6”在S1的侵染下，死亡率都非常小，可以推测到两个原因：一是死亡的果蝇个体差异相较于其他果蝇来说，比较大；二是果蝇体内的S1菌株数量还不到致死浓度，则不足以致死果蝇。在12小时这个点上，“1”和“5”“6”之间出现了较为显著的差异，死亡率相差20%左右，说明“5”“6”和“1”对于S1菌株的免疫能力有很大的差异，而在15小时时，果蝇基本趋于死亡，并且在18小时内，果蝇全部死亡，也证明，S1菌株对于果蝇的毒性很强。
3.3 菌落计数
各时间段不同型号果蝇体内的细菌数的对数值
注：上图表示的是在S1菌株侵染的3类果蝇体内，各相应时间点上，S1菌株数量的以10为底数的自然对数值
Fig. 3 The picture above showed that after infecting, 0 hour, 6hours, 12hours and 15hours later, the number of S1 in the Drosophila.
结果分析：由图中数据可以看出，0小时表示刚进行针扎果蝇之后，果蝇体内S1细菌的数量，即，初始扎入果蝇体内的细菌数量，而由表可知初始时，“wt”“Ken”“FADD”三个型号的果蝇体内的细菌数量相差不大，到6小时的时候，果蝇体内的细菌数量也是相差不多，而且，6个小时的时间内，果蝇体内的细菌数量增加倍数也只有几倍，而到了12小时的时候，增长数超过100倍，说明，在这一段时间里面，果蝇体内的免疫机制已经难以对S1菌株产生作用，到15个小时的时候，相对而言，增长数度虽然缓慢，但是细菌基数大，数量则很多。
结合表一与图5，我们综合分析，可以发现，在0-6小时，S1细菌基数小，数量少，果蝇的免疫系统能够有效的杀伤细菌，细菌生长缓慢，也可以理解为，果蝇的免疫系统对侵染的果蝇起到了抑制效果，而在6-12小时内，果蝇体内细菌数量急剧增加，表明果蝇的免疫系统对于体内的细菌的免疫效果已经达不到要求，比较3个型号的果蝇体内的细菌数，可以发现，“Ken”“FADD”中的数量都比“wt”中的数量多4-5倍，联系死亡率统计图，可以得到结论，“wt”的免疫系统比“Ken”“FADD”的免疫系统都要完善，对体内细菌的抑制效果更有效。
4 讨论
本研究的研究对象为S1菌株，研究工具为黑腹果蝇。黑腹果蝇作为研究工具，被世界上很多实验室所使用，大家对于黑腹果蝇的了解都很是透彻，所以黑腹果蝇是作为实验室研究材料的模式生物。
而对于本研究的研究对象S1菌株，则是一种很新的材料，作为Serratia nematodiphila细菌的一个菌株，而Serratia nematodiphila细菌作为Serratia属中的一个种，本身就是一个很新的研究课题，对于这个种的细菌的研究与其他的很多细菌相比，都可以说是一个全新的内容，和本属中的其他两个种相比，不管是在实验室还是在临床方面，都是完全没有可比性的。
S1菌株只是Serratia nematodiphila细菌的一个菌株，虽然不能完全代表Serratia nematodiphila细菌，但是总是能够反映一些它的特性，并且在S1菌株上，也能够看得出Serratia nematodiphila细菌的所有共性，并且，对于S1菌株的研究，也是能够补充对Serratia nematodiphila细菌认识的不足，从而也能够让大家对Serratia nematodiphila细菌认识了解的更深刻清楚。
本研究所使用到的研究的方法，在以往研究其他细菌的时候也是多有用到，在实验方法上，我相信不会有什么问题，实验方法操作，也是一直以来实验室常用的方法，并且，经过长时间的发展，实验材料和实验方法的运用，都是经过发展的，所以，在此前提下得到的数据也应该是真实可靠的！
致谢
其次，感谢仇汝龙师兄的帮助，感谢仇汝龙师兄在我对实验室不熟之际，带我熟悉实验室，帮我准备实验器材，并且在具体操作上给与我很大的帮助，让我的实验变得简单一些；
最后，感谢蔡翰林同学的帮助，感谢蔡翰林同学在实验期间对我的帮助，让我们在实验期间能够有相互合作、共同进步的机会！
参考文献：
[1]曹慧，李宗芸，王秋香.果蝇先天性免疫研究进展[J].昆虫知识,2009,46(2):196- 202.
[2]Ioannis Eleftherianos, Richard H. ffrench-Constant, David J. Clark, et al.. Dissecting the immune response to the entomopathogen photorhabdus[J]. Trends in Microbiology 2010,18(12):552- 560.
[3]Yiorgos A.,Laurence G R..Drosophila melanogaster as a model host for studying pseudomonas aeruginosa infection[J].NATURE PROTOCOLS,2009,4(9)：1285- 1294.
[4]Aymeric J.-L., Givaudan A., Duvic B.. Imd pathway is involved in the interaction of Drosophila menanogaster with the entomapathogentic bacteria, Xenorhabdus nematophila and Photorhabdus luminescens[D].France:Universite Montpellier, Molecular Immunology,2010:1-7.
[5]庞在堂，杨怀文.昆虫病原线虫共生菌的分类[J].微生物学报，August 2003,43(4):527- 533.
[6]张明明，初源，赵章武，安春菊.昆虫天然免疫反应分子机制研究进展[J].昆虫学报，October 2012,55(10):1221- 1229.
[7]Chong-Xing Zhang, Shou-Yun Yang, Ming-Xu Xu, et al.. Serratia nematodiphila sp. nov., associated symbiotically with the entomopathogenic nematode Heterorhabditidoides chongmingensis (Rhabditida: Rhabditidae). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009,59, 1603- 1608.
[8]Nadine T.N.,Samuel L.,Beatrix K.,Philippe G.,et al.A Model of Bacterial Intestinal Infections in Drosophila melanogaster.PLoS Pathog,2007,3(11):e173;1694- 1709.
[9]刘甜，罗开珺.果蝇Toll和IMD信号通路中的功能结构域[J].环境昆虫学报，September 2011, 33(3)：388- 395
[10] Boemare N E, Akhurst R J, Mourant R G. DNA relatedness between Xenorhabdus spp. ( Enterobacteriaceae) , symbiotic bacteria of entomopathogenic nematodes and a proposal to transfer Xenorhabdus luminescens to a new genus, Photorhabdus gen. nov. . Int J Syst Bacteriol, 1993, 43: 249- 255.
[11] Thomas G M, Poinar G O. Xenorhabdus . A genus of entomopathogenic, nematophilic bacteria of the family Enterobacteriaceae. Int J Syst Bacteriol, 1979, 29( 4) : 352- 360.
[12] Ehlers R U, Wyss U, Stackebrandt E. 16S rRNA cataloguing and the phylogenetic position of the genus Xenorhabdus. Syst Appl Microbiol, 1988, 10: 121- 125.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
关键字:
目录
摘 要： 4
关键词 4
Abstract 4
Key words 5
1引 言 5
1．1 昆虫病原线虫共生菌 5
1.1.1昆虫病原线虫介绍 5
1.1.2 昆虫病原线虫共生菌介绍 5
1.2 Serratia nematodiphila 介绍及研究意义 6
2 实验材料与方法 7
2.1 前期准备 7
2.1.1 实验器材 7
2.1.2 实验需要的培养基的配制 7
2.2 实验步骤 8
2.2.1 实验准备步骤 8
2.2.2 果蝇肠道侵染实验步骤 8
2.2.3 果蝇血腔侵染实验步骤 9
2.2.4 活体果蝇体内菌落计数 11
3结果与分析 11
3.1 肠道侵染实验 11
3.1.1大肠杆菌侵染与S1菌株侵染比较 11
3.1.2 野生型与突变型果蝇的比较 12
3.2 血腔侵染实验 13
3.2.1大肠杆菌侵染和S1菌株侵染的比较 13
3.2．2野生型与突变型果蝇的比较 15
3.3 菌落计数 15
4 讨论 16
致谢 17
参考文献： 17
昆虫病原线虫共生菌菌株S1与果蝇imd信号途径2种突变体的互作
摘 要：果蝇具有包括体液免疫、细胞免疫和黑化反应等先天性免疫应答系统，能够对病原微生物感染，做出快速有效反应。果蝇的体液免疫包括了Toll信号途径和Imd信号途径，在Imd信号途径中含有多种突变体。本研究中，挑选了野生型和两种Imd途径突变型Ken和FADD的果蝇，以及Serratia nematodiphila细菌中的S1菌株作为实验材料，研究了在肠道侵染和血腔侵染等两种不同的处理方案，相同的细菌S1的侵染下，两种突变型果蝇与野生型果蝇的死亡率的差异，同时又用大肠杆菌作为S1菌株的阳性对照。研究表明，三种果蝇的死亡率有所不同，说明其免疫机制略有差异！
关键词 果蝇，imd信号途径，免疫机制, Serratia nematodiphila细菌S1菌株，
Interaction between the Entomopathogenic nematodes symbiotic bacteria S1 of Serratia nematodiohila and the two mutants Ken,FADD of Drosophila melanogaster in the Imd signal pathway
Abstract Drosophila melanogaster is an important model organism for understanding basic biological and human disease mechanisms. Drosophila, lacking an adaptive immune system found in mammals, but involving humoral immunity, cellular immunity and melanization, can resist rapidly and effectively to infection of various microorganisms. Drosophila humoral immunity, include Toll signal pathway and Imd signal pathway, and Imd signal pathway contains a variety of mutant. In this study, choose the way of wild type and two kinds of Imd mutant flies as experimental material, studied in different treatment scheme, the same bacteria S1 under the infection of two mutant drosophila and wild-type flies differences in mortality rates. Research shows that three flies mortality is different, that their immune mechanism is slightly different!
Key words Drosophila，Imd signal pathway，bacteria Serratia nematodiphila S1，The immune mechanism
1引 言
果蝇不像人类拥有B、T淋巴细胞一样，拥有高度专一的获得性免疫系统，已有的研究表明，果蝇具有3种先天性免疫应答系统，即体液免疫、细胞免疫还有黑化反应【1】。在3种免疫应答系统的作用下，果蝇能够对侵入体内的病原微生物作出快速有效的免疫反应。
而病原微生物侵染果蝇后，会进行一系列的隐瞒或者调整，以确保它们能够在宿主果蝇的免疫反应下继续生存下去【2,3】。昆虫病原线虫共生菌菌株S1是一种强有力的昆虫病原细菌，它能够快速的引起宿主果蝇表达出分子产物进行免疫反应，而这，对于我们来说，则是一个探索免疫的分子基础的一个有用工具。在侵染过程中，S1能够在昆虫中迅速繁殖，并且产生出一系列的毒素，抑制宿主果蝇的免疫吞噬，其结果是，最终杀死宿主果蝇【2】。
1．1 昆虫病原线虫共生菌
1.1.1昆虫病原线虫介绍
昆虫病原线虫是指一类专性寄生昆虫的线虫，它消化道内携带有病原菌，当它从昆虫消化道或体壁侵入昆虫寄主体内后，共生菌从线虫体内释放出来，在昆虫血液内增殖，最终使寄主昆虫感染病原杆菌患败血症而死亡。目前世界上描述定名的这一类线虫，主要是斯氏线虫科和异小杆线虫科的线虫。
昆虫病原线虫生活史中有一个侵染期线虫阶段，称之为侵染期线虫。侵染期线虫不取食，独立于昆虫体外自由生活，在自然界土壤中可分离到昆虫病原线虫的侵染期幼虫【4】。
1.1.2 昆虫病原线虫共生菌介绍
昆虫病原线虫共生菌，是存在于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌, 在系统分类上，属于肠杆菌科( Enterobacteriaceae), 兼性厌氧, 包括光杆状菌属【10】( Photorhabdus)、致病杆菌属【11】( Xenorhabdus)和沙雷氏菌属【】（Serratia）, 它们分别与异小杆线虫属【12】(Heterorhabditis) 斯氏线虫科【12】(Stenernematidas) 、和拟异小杆菌属【】（Heterorhabditidoides）的线虫共生。在自然界, 共生菌存在于 3 龄侵染期线虫的肠道中, 不能从土壤中分离获得, 是昆虫病原线虫的主要致病因子【5】。
多年来，随着对昆虫病原线虫及其共生菌的不断深入研究，共生细菌的多种生物学功能不断被发现，简单而言，主要有以下的一些作用：
（1）、共生菌可以分泌出广谱抑菌活性物质，这些活性物质之中，已经有一些物质显示出了良好的商业开发前景；
（2）、共生菌产生的杀虫毒素对多种害虫有较强的致死作用，尤其是胞外蛋白毒素的发现，为生物农药的开发和抗虫基因工程提供了新的杀虫剂因资【5】；
（3）、共生菌作为一类特殊生境下的细菌，还产生多种对人类癌细胞具有较强抑制作用的活性物质，为研制抗癌新药物提供了新材料【5】。
除了上述所说的3种功用之外，共生菌也表现出了其他的一些特性，而这些特异的生物学功能使昆虫病原线虫共生菌已经成为了一类新型的具有开发潜力和应用前景的生物资源，因此，大家也是越来越重视对昆虫病原线虫共生菌作用于昆虫身上的研究。
这些研究也为研究病原体毒力基因与宿主免疫基因之间的相互作用铺平了道路，通过对共生菌感染无脊椎动物的研究，可以过渡到对脊椎动物的病原感染研究上，能让大家了解到更多的昆虫病原线虫共生菌，甚至于，最终可以应用于人类病原体的研究，成为研究人类病原体的飞跃【3】。
1.2 Serratia nematodiphila 介绍及研究意义
S1菌株是Serratia nematodiphila菌种的一个菌株，Serratia nematodiphila在系统分类上，属于Enterobacterianceae科，Serratia属，除此之外，还有Serratia marcescens和Serratia sakuensis两个种的细菌都属于这一个分类。以上三种细菌都是与Heterorhabditidoides chongmingensis线虫共生。
后两种细菌与果蝇的作用已经被了解的比较透彻，而Serratia nematodiphila细菌则是一种比较新的细菌，对果蝇的作用还是不明朗，它没有被归分到其他两种种类中，也是有它的原因的，Serratia nematodiphila细菌与其他两种细菌相比较，在表性特征上，就有很大的不同。
比如说精氨酸水解酶的活性比较上，就有很大不同；再比如，它不同于其他两种细菌，他可以在以D-乳糖，D-阿拉伯糖，蜜三糖，D-木糖，蜜二糖，乳酸等为唯一碳源的培养基中生存，但是，不能够在以草酸为唯一碳源的培养基中生存。
Serratia nematodiphila细菌都是需氧型的革兰氏阴性菌，显微表示为短杆状，菌体大小在0.8-1.3*0.6-0.7微米，菌体外有一条鞭毛，能够运动，在营养琼脂上培养的菌落呈现为红色圆斑状，菌落边缘光滑，生存条件比较广泛，能够在4-42℃、pH5-11、2-7%NaCl的条件下生存，最适温度为30-37℃，最适pH为6-10【7】。
研究S1菌株，主要是因为S1菌株是Serratia nematodiphila细菌中的一个菌株，而对于Serratia nematodiphila细菌的研究也不是很明朗，通过对S1菌株的研究，能够让大家更加了解Serratia nematodiphila细菌，不管是在科研，还是在临床应用上，都将是一个突破。
2 实验材料与方法
2.1 前期准备
本课题需要从多个不同的方向进行实验验证，从而得到实验结论，实验进行之前，也需要准备多种实验器材，做很多的实验准备。
2.1.1 实验器材
果蝇培养基配制材料：琼脂条、蔗糖、玉米粉、酵母粉、丙酸等，LB培养基配制材料：胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠（NaCl）、琼脂等，1000微升、200微升移液枪各一，烧杯两个，玻璃棒，酒精灯，超净工作台，吸光光度计/酶标仪等。
以下物品都需要在使用前灭菌：用以摇菌的长试管若干，1.5毫升离心管若干，专用的果蝇培养管若干，以及专用的1000微升、200微升的枪头若干，50mmol/L的蔗糖水500ml，平板若干，配制各培养基所用的水均为去离子水。
2.1.2 实验需要的培养基的配制
实验室果蝇培养基配方：
（1）4瓶/12管：水，150ml；琼脂，1.5g；蔗糖，13g；玉米粉，17g；酵母，3g；丙酸，1-1.5ml
（2）11瓶/32管：水，412.5ml；琼脂，4.13g；蔗糖，35.75g；玉米粉，46.75g；酵母，8.25g；丙酸，3-4.5ml
配制方法：
（1）称量相应质量的蔗糖、玉米粉、酵母粉，将这3种物品倒入同一个烧杯中，记A；
（2）然后再称量相应质量的琼脂条，放在另一个烧杯中，记B；
（3）用量筒量取相应体积的去离子水，分开倒入两个烧杯中，用玻璃棒搅拌A烧杯，使A烧杯中的用品溶解；
（4）然后将两个烧杯放到微波炉中加热，待B烧杯中的琼脂条溶解之后，将B烧杯中的溶液倒入到A烧杯中；
（5）之后继续加热，每过20-30秒钟的时间将A烧杯从微波炉中拿出，然后用玻璃棒搅拌防止玉米粉沉底，6-7分钟后，即可准备分装。
液体LB培养基配方：胰蛋白胨（Tryptone）10g/L；酵母提取物（Yeast Extract）5g/L；氯化钠（NaCl）10g/L,用去离子水溶解，121℃高压灭菌；
固体LB培养基配方：在液体培养基的基础上，再加琼脂（Agar）15g/L，用去离子水溶解，121℃高压灭菌待用。
2.2 实验步骤
本次课题研究，维持时间两个多月，所做实验可以分为4各部分：实验准备、果蝇肠道侵染、果蝇血腔侵染以及活体果蝇体内菌落计数，下面对这四个方面逐一详细说明。
2.2.1 实验准备步骤
1、各种实验材料的准备。将上述需要灭菌的实验器材全部用报纸包好，在121℃的高压灭菌锅中灭菌25min，然后取出，在烘箱中烘干，备用；
2、果蝇培养基的配制。果蝇培养基配制完成之后，待培养基冷却到60℃以下时，加入1-3ml丙酸，搅拌，然后迅速将培养基分装到已经灭过菌的果蝇培养管中，每管分装2-3cm高，冷却待用；
3、LB培养基（L/S）的配制。按照上述LB培养基配方，配制50ml固体LB培养基，高压灭菌之后，在超净工作台中倒平板，每10ml左右培养基倒一块平板，等待平板中培养基冷却凝固，晾干备用；同时配制100ml液体LB培养基，灭菌，在超净工作台中将培养基分装到已灭菌的试管中，密封，备用；
4、果蝇培养。选定实验所需要的两种突变体果蝇，接种，接种前需要在果蝇培养基的表面撒上少量的酵母粉，以利于果蝇对培养基的吸收；接种时，为了保证之后果蝇繁殖胜利，需要对每种果蝇接种3-4管，每一管中果蝇需要10-12只，而且雌雄果蝇各一半最佳；
5、果蝇接种后的观察。在25℃的条件下，果蝇培养从卵到成虫的时间大约在10-14天【4】，在培养6-7天的时候，培养管中能够看得到果蝇幼虫，而若是在这段时间里面观察不到果蝇幼虫，则选择更换果蝇培养基，或者更换一管新的培养基；
6、果蝇的扩繁。实验需要大量的各类果蝇，需要对果蝇进行扩繁；
注：选择扩繁的母体果蝇管在接种时，需要有几个条件，即：母体果蝇管中果蝇较多，密度大；母体果蝇管的培养基中，需要能够观察到有果蝇幼虫，避免培养基的浪费。
7、划平板。取出冷冻中的大肠杆菌菌种以及实验所需S1菌种，捂热解冻，然后再在超净工作台中，分别吸取100微升菌液进行划平板，并在37℃的温箱中培养8小时左右，观察是否有单菌落，然后密封平板，保存在-18℃的冰箱中，备用。
2.2.2 果蝇肠道侵染实验步骤
1、准备9支空的果蝇培养管，每支果蝇培养管底部垫上吸水纸，用报纸包好，高压灭菌，然后烘干，备用；
2、挑选单菌落、接种摇菌。从冰箱中取出划好的平板，用接种针挑选单菌落，接种到LB培养液试管中，然后在37℃的恒温摇床中摇菌24小时，再将平板封好，放回原冰箱中，备用（以上操作在超净工作台中完成）；
3、取3支灭菌的空果蝇培养管，与含有果蝇的果蝇培养管对接，使待用作实验的果蝇进入空的培养管中，做好记号，饥饿处理2-3小时，能够促进实验时，果蝇对于蔗糖溶液的取食；
注：本步实验，可以根据具体情况，改变对接的灭菌空管的数量，避免造成因培养管中果蝇密度过大而引起果蝇伤亡。
4、OD600nm值测定。从试管中吸取1000微升菌液置于1.5ml离心管中离心，去上清，然后用1000微升50mmol/L的无菌蔗糖水重悬沉淀，吸取200微升重悬液测量OD值，通过调节菌液浓度，最终使OD值达到0.1左右，备用；
注：这里调节OD值时，并非直接将菌液OD值调节到0.1，而是OD值达到1.0时，用50mmol/L的无菌蔗糖水稀释十倍左右，使之达到0.1。
5、将上述9支果蝇培养管分成3组，记为A、B、C三组，分别在A组的3支培养管中添加2ml的50mmol无菌蔗糖溶液，作为对照组；分别在B组的3支培养管中添加上述2ml的OD600nm=0.1的S1菌液，作为实验组；分别在C组的3支培养管中添加上述2ml的大肠杆菌菌液，与B组的实验组形成阴性对照，并且分别在培养管上标注清楚；
注：添加3种溶液时，需要直接滴加在培养管中的吸水纸上，尽量避免有液体黏在培养管的内管壁上，避免造成果蝇被黏在管壁上，而造成外部损伤。
6、将步骤3中饥饿处理的果蝇用乙醚迷晕，然后将迷晕了的果蝇分别对号平均装到9支处理过的培养管中，同时在培养管的外壁上做好标记，以及记录相应的果蝇数量；
注：果蝇在分装到9支处理过的培养管中的之后一段时间，仍然会处于昏迷状态，为了避免对果蝇造成伤害，在果蝇没有从昏迷中醒过来，并且具有行动能力之前，需要将培养管横放，让果蝇在培养管内壁缓慢苏醒。
7、观察与记录。步骤6中的果蝇苏醒之后，将9支培养管都放回果蝇培养箱中培养，之后，每过24小时，观察记录一次果蝇的死亡数，连续6-7天（实验组果蝇全部死亡）；
2.2.3 果蝇血腔侵染实验步骤
1、准备6支空的果蝇培养管，每支果蝇培养管底部垫上吸水纸，用报纸包好，高压灭菌，然后烘干，备用；
2、挑选单菌落、接种摇菌。从冰箱中取出划好的平板，用接种针挑选单菌落，接种到LB培养液试管中，然后在37℃的恒温摇床中摇菌24小时，再将平板封好，放回原冰箱中，备用（以上操作在超净工作台中完成）；
3、OD600nm值测定。从试管中吸取1000微升菌液置于1.5ml离心管中离心，去上清，然后用1000微升无菌水重悬沉淀，吸取200微升重悬液测量OD值，通过调节菌液浓度，最终使OD值达到0.1左右，备用；
注：这里调节OD值时，并非直接将菌液OD值调节到0.1，而是OD值达到1.0时，用无菌水稀释十倍左右，使之达到0.1。
4、在上述6支已经处理的培养管中，全部加入2ml的50mmol/L的无菌蔗糖水，注意蔗糖水不能黏在内管壁上，备用；
5、取3支灭菌的空果蝇培养管，与含有果蝇的果蝇培养管对接，使待用作实验的果蝇进入空的培养管中，做好记号；
6、直接用注射器吸取少量乙醚，对培养管中的果蝇进行麻醉，待果蝇全部被麻醉之后，则可以进行下一步操作；
7、扎果蝇。将一应器材：台灯、钨丝针、OD=0.1的菌液、酒精灯、放大镜、灭菌的白纸准备齐全之后，就可以进行针扎实验：
首先，用酒精灯灼烧钨丝针，进行灭菌；
其次，将麻醉后的果蝇倒出一部分，在已灭菌的白纸上；
再次，将菌液混匀，用钨丝针沾取菌液，在放大镜下对果蝇进行针扎，针扎的部位如下图所示：
图1【3】
说明：图上所示为针扎果蝇的部位，左右两边为对照说明。
注：本实验步骤中，每次从培养管中倒出的果蝇不应过多，每次可以控制在15只左右，防止针扎实验还没有结束，果蝇就已经苏醒，从而乱飞的现象。
8、将大肠杆菌和S1细菌侵染的果蝇分别放入相应的培养管中，并且在果蝇培养管外壁做好记号，等待果蝇从麻醉状态中苏醒，并且记录好每一管中，果蝇的存活数量；
9、观察与记录。将扎好的果蝇放回培养箱中继续培养，没过6小时，观察记录一次，统计相应时间内，各管果蝇的死亡数和存活数，直到实验组全部死亡。
2.2.4 活体果蝇体内菌落计数
由于肠道侵染实验所需时间太长，所以本实验全部针对血腔侵染试验中的实验果蝇。
1、 从各种正在实验的果蝇培养管中，接一只活的被侵染的果蝇，用乙醚麻醉；
2、 待果蝇被完全麻醉之后，将之倒出，在无水酒精中漂洗，洗掉或者杀灭果蝇体表可能沾染上的实验菌体；
3、 在专用的研钵中，用1000微升的无菌水彻底将果蝇粉碎、研磨，使果蝇体内的菌体完全溶于无菌水中；
4、 对于0小时和6小时两个时间段的果蝇，分别取10微升和100微升的研磨液于1.5ml的离心管中，用无菌水稀释到1000微升，即稀释100倍和10倍，而对于12小时和15小时两个时间段的果蝇，则将之分别稀释100倍和1000倍；
5、 涂布。分别吸取100微升的稀释液，在事前准备好的添加了特定抗生素的平板上涂布，分别做好标记；
6、 细菌培养。将做好标记的平板密封，放倒37℃的温箱中进行培养，24小时后，进行观察；
7、 观察与记录。记录每一块平板上的菌落数量，留作分析。
3结果与分析
3.1 肠道侵染实验
3.1.1大肠杆菌侵染与S1菌株侵染比较
A 两种细菌侵染野生型果蝇的比较
B 两种细菌侵染突变体果蝇Ken的比较
C 两种细菌侵染突变体果蝇FADD的比较
注：以上三图中，红色的线均表示大肠杆菌侵染果蝇肠道后，各相应果蝇随着时间的推移的存活率；蓝色的线则表示S1菌株侵染果蝇肠道后，各相应类型的果蝇随时间的推移的存活率
Fig. 1 The red line showed the survival rate of each corresponding Drosophila over time after the E.coli infecting it’s intestinal; The bleu line showed after the bacteria Serratia nematodiphila S1 infecting it’s intestinal,the survival rate is.
分析：从上述3图可以看出来，大肠杆菌肠道侵染的实验的结果是，大肠杆菌的侵染不能够导致果蝇死亡，即，大肠杆菌并非果蝇的致病菌，而S1菌株侵染的结果是，野生型果蝇和两种突变型Ken、FADD果蝇都是在6天左右的时间全部死亡，同时，大肠杆菌侵染和S1菌株侵染的实验步骤都是按照上面所述的实验步骤实施下来的，所以也能说明，果蝇的死亡原因就是因为肠道感染了S1菌株，S1菌株在果蝇肠道内增殖，产生毒素，致死果蝇！
3.1.2 野生型与突变型果蝇的比较
S1菌株侵染3种果蝇肠道，果蝇存活率的比较
注：“wt”——野生型；“Ken”——5号突变体Ken；“FADD”——6号突变体FADD；上图中3条折线表示在S1的侵染下，3类果蝇随着时间的存活率
Fig. 2 “wt”-wide type; “Ken”-The mutant 5 Ken; “FADD”- The mutant 6 FADD; The 3 lines above showed that the survival rate of each corresponding Drosophila over time after the bacteria Serratia nematodiphila S1 infecting their intestinal
分析：肠道侵染实验，实际上是果蝇喂养试验，即，用带细菌的培养液培养果蝇，让果蝇取食时，S1菌株能够进入果蝇的肠道。上图所示，在喂养果蝇的第一天、第二天，3类果蝇均有少数死亡，果蝇的死亡率均在10%左右，死亡数较少，而在接下来的三天时间内，则是果蝇的死亡高峰期，存活率降低到10%左右。
从相应时间点上的果蝇存活率来看，在第一天的24小时内，三类果蝇的死亡率非常接近，存活率都在95%以上，从数据上来看，我们可以认为是果蝇的个体差异造成的；在第二天的24小时内，三类果蝇的死亡率开始出现差异，“wt”的存活率比“FADD”的存活率高5%左右；接下来的24、48、72小时的试验时间中，“wt”的存活率明显比“Ken”、“FADD”高10-15%，这一段时间证明在S1菌株的肠道侵染情况下，“wt”比“Ken”、“FADD”在免疫上，具有更大的调节能力；而，三类果蝇都在144小时之后死亡，也证明S1菌株对于果蝇来说，毒性很强，而在“Ken”和“FADD”之间，差异则不是很明显。
3.2 血腔侵染实验
3.2.1大肠杆菌侵染和S1菌株侵染的比较
A 两种细菌侵染野生型果蝇血腔，果蝇的存活率比较
B 两种细菌侵染突变体果蝇Ken血腔，果蝇的存活率
C 两种细菌侵染突变体果蝇FADD血腔，果蝇的存活率
注：以上三图中，红色的线均表示大肠杆菌侵染果蝇血腔后，各相应果蝇随着时间的推移的存活率；蓝色的线则表示S1菌株侵染果蝇肠道后，各相应类型的果蝇随时间的推移的存活率
Fig. 3 The red line showed the survival rate of each corresponding Drosophila over time after the E.coli infecting it’s hemocoel; The bleu line showed after the bacteria Serratia nematodiphila S1 infecting it’s hemocoel, the survival rate is.
3.2．2野生型与突变型果蝇的比较
S1菌株侵染3类果蝇血腔，果蝇存活率的比较
注：“wt”——野生型；“Ken”——5号突变体Ken；“FADD”——6号突变体FADD；上图中3条折线表示在S1的侵染下，3类果蝇随着时间的存活率
Fig. 2 “wt”-wide type; “Ken”-The mutant 5 Ken; “FADD”- The mutant 6 FADD; The 3 lines above showed that the survival rate of each corresponding Drosophila over time after the bacteria Serratia nematodiphila S1 infecting their hemocoel
分析:血腔侵染实验，实际上就是针扎实验，即，用沾取了实验菌体的钨丝针从果蝇的胸部刺入果蝇体内，将实验菌直接带入果蝇的血腔中。上图所示，在六小时之内，果蝇死亡率很低，基本上在5%以下，死亡数很少，而在6-15小时这一段时间上，果蝇死亡数剧增，到15小时时，果蝇已经基本死亡，到18小时，果蝇全部死亡。
从上图分析，在前六个小时内，“1”“5”“6”在S1的侵染下，死亡率都非常小，可以推测到两个原因：一是死亡的果蝇个体差异相较于其他果蝇来说，比较大；二是果蝇体内的S1菌株数量还不到致死浓度，则不足以致死果蝇。在12小时这个点上，“1”和“5”“6”之间出现了较为显著的差异，死亡率相差20%左右，说明“5”“6”和“1”对于S1菌株的免疫能力有很大的差异，而在15小时时，果蝇基本趋于死亡，并且在18小时内，果蝇全部死亡，也证明，S1菌株对于果蝇的毒性很强。
3.3 菌落计数
各时间段不同型号果蝇体内的细菌数的对数值
注：上图表示的是在S1菌株侵染的3类果蝇体内，各相应时间点上，S1菌株数量的以10为底数的自然对数值
Fig. 3 The picture above showed that after infecting, 0 hour, 6hours, 12hours and 15hours later, the number of S1 in the Drosophila.
结果分析：由图中数据可以看出，0小时表示刚进行针扎果蝇之后，果蝇体内S1细菌的数量，即，初始扎入果蝇体内的细菌数量，而由表可知初始时，“wt”“Ken”“FADD”三个型号的果蝇体内的细菌数量相差不大，到6小时的时候，果蝇体内的细菌数量也是相差不多，而且，6个小时的时间内，果蝇体内的细菌数量增加倍数也只有几倍，而到了12小时的时候，增长数超过100倍，说明，在这一段时间里面，果蝇体内的免疫机制已经难以对S1菌株产生作用，到15个小时的时候，相对而言，增长数度虽然缓慢，但是细菌基数大，数量则很多。
结合表一与图5，我们综合分析，可以发现，在0-6小时，S1细菌基数小，数量少，果蝇的免疫系统能够有效的杀伤细菌，细菌生长缓慢，也可以理解为，果蝇的免疫系统对侵染的果蝇起到了抑制效果，而在6-12小时内，果蝇体内细菌数量急剧增加，表明果蝇的免疫系统对于体内的细菌的免疫效果已经达不到要求，比较3个型号的果蝇体内的细菌数，可以发现，“Ken”“FADD”中的数量都比“wt”中的数量多4-5倍，联系死亡率统计图，可以得到结论，“wt”的免疫系统比“Ken”“FADD”的免疫系统都要完善，对体内细菌的抑制效果更有效。
4 讨论
本研究的研究对象为S1菌株，研究工具为黑腹果蝇。黑腹果蝇作为研究工具，被世界上很多实验室所使用，大家对于黑腹果蝇的了解都很是透彻，所以黑腹果蝇是作为实验室研究材料的模式生物。
而对于本研究的研究对象S1菌株，则是一种很新的材料，作为Serratia nematodiphila细菌的一个菌株，而Serratia nematodiphila细菌作为Serratia属中的一个种，本身就是一个很新的研究课题，对于这个种的细菌的研究与其他的很多细菌相比，都可以说是一个全新的内容，和本属中的其他两个种相比，不管是在实验室还是在临床方面，都是完全没有可比性的。
S1菌株只是Serratia nematodiphila细菌的一个菌株，虽然不能完全代表Serratia nematodiphila细菌，但是总是能够反映一些它的特性，并且在S1菌株上，也能够看得出Serratia nematodiphila细菌的所有共性，并且，对于S1菌株的研究，也是能够补充对Serratia nematodiphila细菌认识的不足，从而也能够让大家对Serratia nematodiphila细菌认识了解的更深刻清楚。
本研究所使用到的研究的方法，在以往研究其他细菌的时候也是多有用到，在实验方法上，我相信不会有什么问题，实验方法操作，也是一直以来实验室常用的方法，并且，经过长时间的发展，实验材料和实验方法的运用，都是经过发展的，所以，在此前提下得到的数据也应该是真实可靠的！
致谢
其次，感谢仇汝龙师兄的帮助，感谢仇汝龙师兄在我对实验室不熟之际，带我熟悉实验室，帮我准备实验器材，并且在具体操作上给与我很大的帮助，让我的实验变得简单一些；
最后，感谢蔡翰林同学的帮助，感谢蔡翰林同学在实验期间对我的帮助，让我们在实验期间能够有相互合作、共同进步的机会！
参考文献：
[1]曹慧，李宗芸，王秋香.果蝇先天性免疫研究进展[J].昆虫知识,2009,46(2):196- 202.
[2]Ioannis Eleftherianos, Richard H. ffrench-Constant, David J. Clark, et al.. Dissecting the immune response to the entomopathogen photorhabdus[J]. Trends in Microbiology 2010,18(12):552- 560.
[3]Yiorgos A.,Laurence G R..Drosophila melanogaster as a model host for studying pseudomonas aeruginosa infection[J].NATURE PROTOCOLS,2009,4(9)：1285- 1294.
[4]Aymeric J.-L., Givaudan A., Duvic B.. Imd pathway is involved in the interaction of Drosophila menanogaster with the entomapathogentic bacteria, Xenorhabdus nematophila and Photorhabdus luminescens[D].France:Universite Montpellier, Molecular Immunology,2010:1-7.
[5]庞在堂，杨怀文.昆虫病原线虫共生菌的分类[J].微生物学报，August 2003,43(4):527- 533.
[6]张明明，初源，赵章武，安春菊.昆虫天然免疫反应分子机制研究进展[J].昆虫学报，October 2012,55(10):1221- 1229.
[7]Chong-Xing Zhang, Shou-Yun Yang, Ming-Xu Xu, et al.. Serratia nematodiphila sp. nov., associated symbiotically with the entomopathogenic nematode Heterorhabditidoides chongmingensis (Rhabditida: Rhabditidae). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009,59, 1603- 1608.
[8]Nadine T.N.,Samuel L.,Beatrix K.,Philippe G.,et al.A Model of Bacterial Intestinal Infections in Drosophila melanogaster.PLoS Pathog,2007,3(11):e173;1694- 1709.
[9]刘甜，罗开珺.果蝇Toll和IMD信号通路中的功能结构域[J].环境昆虫学报，September 2011, 33(3)：388- 395
[10] Boemare N E, Akhurst R J, Mourant R G. DNA relatedness between Xenorhabdus spp. ( Enterobacteriaceae) , symbiotic bacteria of entomopathogenic nematodes and a proposal to transfer Xenorhabdus luminescens to a new genus, Photorhabdus gen. nov. . Int J Syst Bacteriol, 1993, 43: 249- 255.
[11] Thomas G M, Poinar G O. Xenorhabdus . A genus of entomopathogenic, nematophilic bacteria of the family Enterobacteriaceae. Int J Syst Bacteriol, 1979, 29( 4) : 352- 360.
[12] Ehlers R U, Wyss U, Stackebrandt E. 16S rRNA cataloguing and the phylogenetic position of the genus Xenorhabdus. Syst Appl Microbiol, 1988, 10: 121- 125.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
关键字:
目录
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/smkx/482.html
