稻瘟病菌基因mgg09531和mgg11676的稻瘟病菌基因mgg09531和mgg11676的功能研究(附件)【字数：8390】
稻瘟病是一种世界性真菌病害，是严重影响水稻稳产和高产的重要因素。生物防治是解决水稻稻瘟病菌侵害的有效方法。麝香霉产生的挥发性有机物（volatile?organic compounds，VOCs）可以较好地抑制稻瘟病菌的生长。本课题主要通过敲除载体构建和T-DNA转化对目的基因MGG_09531和MGG_11676进行敲除，并通过PCR确定敲除转化子。通过表型分析及与麝香酶对峙培养实验研究稻瘟病菌基因敲除后的转化子生长活性，验证被敲除基因的功能。结果表明，转化子为阳性转化子，即基因MGG_11676已被成功敲除。该转化子生长速度明显加快，说明MGG_11676基因与稻瘟病菌的生长相关。与麝香酶对峙实验结果显示，麝香酶菌株ZJLQ024可完全抑制稻瘟病菌Guy11的生长，而麝香酶菌株ZJLQ024部分抑制敲除转化子的生长，说明MGG_11676基因是麝香酶VOCs抑制稻瘟病菌生长的潜在可能的靶标位点。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1．1 材料 3
1．1．1 实验菌株 3
1．1．2 仪器 3
1．1．3 培养基及试剂 3
1．2 方法 3
1．2．1 上下游片段的扩增 3
1．2．2 敲除载体的构建 4
1．2．3 重组产物转化 5
1．2．4 真菌基因敲除（ATMT） 5
1．2．5 转化子验证 6
1．2．6 表型观察 6
2 结果与分析 6
2．1 目的片段的获得 7
2．2 重组产物转化 7
2．2．1 质粒PCR验证结果 7
2．3 转化子的获得 8
2．4 转化子验证 9
2．5 表型观察 10
2．5．1与稻瘟病菌Guy11比较 10
2．5．2与麝香酶对峙培养实验 11
3 讨论 12
致谢 13
参考文献 14
附录 16< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
br /> 稻瘟病菌基因MGG_09531和MGG_11676的功能研究
引言
引言
水稻是世界三大粮食作物之一，全世界人口23%的卡路里消耗要依靠水稻提供，所以水稻产量与世界人民的温饱和粮食安全问题息息相关[1]。然而，水稻会受到各种病害的感染，其中稻瘟病侵染水稻较为严重，会引发大面积减产。每年稻瘟病会导致水稻减产惨重，有时严重至颗粒无收。自上世纪末起，我国每年水稻产量因稻瘟病引起的损失至数以千斤[2]。
稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是稻瘟病的病原菌。在水稻发育过程中，该病害能够侵染水稻的各个部位，如苗、叶、节、穗颈、谷粒等[3]，其中叶和穗颈的感染比较普遍。稻瘟病菌侵染的部位不同，相应症状也会有所不同。水稻感染稻瘟病后，会在叶片处形成椭圆形病斑，以此为稻瘟病的典型症状（图1）。稻瘟病菌除了侵染水稻地上部分，还能从水稻根系入侵使整株水稻得病。稻瘟病菌还会侵害大麦、小米等其它重要的禾本科农作物。
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图1 稻瘟病田间发病症状[4]
目前稻瘟病菌及其寄主水稻的全基因组测序已完成并对外开放[5]。稻瘟病菌是丝状子囊真菌，可以在培养基上进行离体培养，其生长发育、侵染过程及致病机理具备典型性，而且新技术的研发使其易于遗传转化，稻瘟病菌现已成为模式菌株用于研究病原真菌植物间互作 [67]。
稻瘟病现在通过化学药剂、抗性品种培育和生物防治方法来进行预防治理，但是化学防治会使药剂残留，导致环境污染，且稻瘟病菌易产生抗药性；培育抗性品种存在抗性品种单一，耗时长及抗性不稳定等问题[8]。而生物防治不易引发环境污染，而且培育的品种比较丰富。生物农药最可以体现生物防治的特点，是防治病害爆发的重要工具，它是利用微生物自身或其产生的代谢产物，经人工合成和人工修饰研制合成，其具有环保、稻瘟病菌不易产生抗药性、高效等优点[9]。所以生物农药研究成为了有效防治稻瘟病和可持续发展水稻产业的热点。
麝香酶属（Muscodor）真菌是一类能够产生挥发性有机化合物（volatile?organic compounds，VOCs）的内生真菌[10]。麝香霉产生的VOCs具有很强的抑菌效果，对大部分细菌、真菌及昆虫具有抑制或杀死作用。现已发现内生真菌Nodulisporium sp.会产生一种挥发性化合物，编号为CF016，该物质可以抑制稻瘟病菌的生长[11]。经相关研究表明来自内生真菌的VOCs具有抑制稻瘟病菌生长的活性，从内生真菌Fusarium tricinetum 获得的挥发油对稻瘟病菌的最小浓度（MIC）值为225μg/mL[12]；Gliomastix murorum产生的挥发油对抑制稻瘟病菌孢子萌发的平均抑制浓度（IC（50））为0.84mg/mL，Pichia guilliermondii的平均抑制浓度为1.56mg/mL[13]。
随着技术研究的不断推进，通过建立基因文库，运用农杆菌介导的转化（ATMT）通过同源重组将目的基因敲除，利用RNAi干扰载体使真菌基因沉默等方法来研究稻瘟病菌基因的功能[14]。其中ATMT技术因操作便利、转化效率高、重复性好，被广泛运用于研究真菌基因功能[15]。李海娇[16]运用同源重组、ATMT等方法，克隆了稻瘟病菌MoSOK1、MoSOD1和MoSOD2等基因，研究了这三种基因在稻瘟病菌生长发育及其它过程中的功能。结果显示，敲除这三个基因后，稻瘟病菌的生长发育、产孢量及侵染水稻等过程受到了一定的影响。张莉林[17]通过ATMT技术，成功敲除171个稻瘟病菌转录因子基因，并获得相应的敲除突变体。通过测定这些突变子的表型，她发现这些转录因子对稻瘟病菌的生长、育性及侵染过程产生重大影响。这些为后续其他研究人员分析稻瘟病菌基因提供了实验依据。
本实验室通过前期研究成功分离出多种麝香酶菌株，并已经过实验证实这些麝香酶菌株产生的VOCs对稻瘟病菌具有明显地杀死或抑制作用。目前对于麝香霉抑制稻瘟病菌生长主要集中在应用方面，然而人们对VOCs抑制稻瘟病菌的机制研究较少。目前，实验室已经筛选获得随机插入突变的转化子并明确了插入突变基因。因此，进一步验证稻瘟病菌中这些基因的功能，即研究这些基因是否是麝香霉VOCs抑制作用的靶标位点，可以帮助阐明稻瘟病菌及麝香霉的相互作用，对发掘稻瘟病菌新的防治方法具有重要意义。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1．1 材料 3
1．1．1 实验菌株 3
1．1．2 仪器 3
1．1．3 培养基及试剂 3
1．2 方法 3
1．2．1 上下游片段的扩增 3
1．2．2 敲除载体的构建 4
1．2．3 重组产物转化 5
1．2．4 真菌基因敲除（ATMT） 5
1．2．5 转化子验证 6
1．2．6 表型观察 6
2 结果与分析 6
2．1 目的片段的获得 7
2．2 重组产物转化 7
2．2．1 质粒PCR验证结果 7
2．3 转化子的获得 8
2．4 转化子验证 9
2．5 表型观察 10
2．5．1与稻瘟病菌Guy11比较 10
2．5．2与麝香酶对峙培养实验 11
3 讨论 12
致谢 13
参考文献 14
附录 16< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
br /> 稻瘟病菌基因MGG_09531和MGG_11676的功能研究
引言
引言
水稻是世界三大粮食作物之一，全世界人口23%的卡路里消耗要依靠水稻提供，所以水稻产量与世界人民的温饱和粮食安全问题息息相关[1]。然而，水稻会受到各种病害的感染，其中稻瘟病侵染水稻较为严重，会引发大面积减产。每年稻瘟病会导致水稻减产惨重，有时严重至颗粒无收。自上世纪末起，我国每年水稻产量因稻瘟病引起的损失至数以千斤[2]。
稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是稻瘟病的病原菌。在水稻发育过程中，该病害能够侵染水稻的各个部位，如苗、叶、节、穗颈、谷粒等[3]，其中叶和穗颈的感染比较普遍。稻瘟病菌侵染的部位不同，相应症状也会有所不同。水稻感染稻瘟病后，会在叶片处形成椭圆形病斑，以此为稻瘟病的典型症状（图1）。稻瘟病菌除了侵染水稻地上部分，还能从水稻根系入侵使整株水稻得病。稻瘟病菌还会侵害大麦、小米等其它重要的禾本科农作物。
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图1 稻瘟病田间发病症状[4]
目前稻瘟病菌及其寄主水稻的全基因组测序已完成并对外开放[5]。稻瘟病菌是丝状子囊真菌，可以在培养基上进行离体培养，其生长发育、侵染过程及致病机理具备典型性，而且新技术的研发使其易于遗传转化，稻瘟病菌现已成为模式菌株用于研究病原真菌植物间互作 [67]。
稻瘟病现在通过化学药剂、抗性品种培育和生物防治方法来进行预防治理，但是化学防治会使药剂残留，导致环境污染，且稻瘟病菌易产生抗药性；培育抗性品种存在抗性品种单一，耗时长及抗性不稳定等问题[8]。而生物防治不易引发环境污染，而且培育的品种比较丰富。生物农药最可以体现生物防治的特点，是防治病害爆发的重要工具，它是利用微生物自身或其产生的代谢产物，经人工合成和人工修饰研制合成，其具有环保、稻瘟病菌不易产生抗药性、高效等优点[9]。所以生物农药研究成为了有效防治稻瘟病和可持续发展水稻产业的热点。
麝香酶属（Muscodor）真菌是一类能够产生挥发性有机化合物（volatile?organic compounds，VOCs）的内生真菌[10]。麝香霉产生的VOCs具有很强的抑菌效果，对大部分细菌、真菌及昆虫具有抑制或杀死作用。现已发现内生真菌Nodulisporium sp.会产生一种挥发性化合物，编号为CF016，该物质可以抑制稻瘟病菌的生长[11]。经相关研究表明来自内生真菌的VOCs具有抑制稻瘟病菌生长的活性，从内生真菌Fusarium tricinetum 获得的挥发油对稻瘟病菌的最小浓度（MIC）值为225μg/mL[12]；Gliomastix murorum产生的挥发油对抑制稻瘟病菌孢子萌发的平均抑制浓度（IC（50））为0.84mg/mL，Pichia guilliermondii的平均抑制浓度为1.56mg/mL[13]。
随着技术研究的不断推进，通过建立基因文库，运用农杆菌介导的转化（ATMT）通过同源重组将目的基因敲除，利用RNAi干扰载体使真菌基因沉默等方法来研究稻瘟病菌基因的功能[14]。其中ATMT技术因操作便利、转化效率高、重复性好，被广泛运用于研究真菌基因功能[15]。李海娇[16]运用同源重组、ATMT等方法，克隆了稻瘟病菌MoSOK1、MoSOD1和MoSOD2等基因，研究了这三种基因在稻瘟病菌生长发育及其它过程中的功能。结果显示，敲除这三个基因后，稻瘟病菌的生长发育、产孢量及侵染水稻等过程受到了一定的影响。张莉林[17]通过ATMT技术，成功敲除171个稻瘟病菌转录因子基因，并获得相应的敲除突变体。通过测定这些突变子的表型，她发现这些转录因子对稻瘟病菌的生长、育性及侵染过程产生重大影响。这些为后续其他研究人员分析稻瘟病菌基因提供了实验依据。
本实验室通过前期研究成功分离出多种麝香酶菌株，并已经过实验证实这些麝香酶菌株产生的VOCs对稻瘟病菌具有明显地杀死或抑制作用。目前对于麝香霉抑制稻瘟病菌生长主要集中在应用方面，然而人们对VOCs抑制稻瘟病菌的机制研究较少。目前，实验室已经筛选获得随机插入突变的转化子并明确了插入突变基因。因此，进一步验证稻瘟病菌中这些基因的功能，即研究这些基因是否是麝香霉VOCs抑制作用的靶标位点，可以帮助阐明稻瘟病菌及麝香霉的相互作用，对发掘稻瘟病菌新的防治方法具有重要意义。
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