酿酒酵母中dsl1复合体亚基tip20参与细胞自噬的研究
： 3：细胞自噬（autophagy）是真核生物中高度保守的一种降解途径。它通过降解细胞内物质，维持细胞内生理平衡并帮助细胞度过逆境。酿酒酵母中Dsl1复合体是COPI囊泡的拴系因子，担负着COPI囊泡与内质网的拴系功能。本研究通过对Dsl1复合体亚基Tip20的研究发现，Tip20不仅参与囊泡运输过程，同时影响细胞自噬的正常运输。利用GFP标记细胞自噬相关蛋白Atg8用于跟踪tip20ts温敏感突变菌株中细胞自噬的运输过程，发现GFP-Atg8在tip20ts内形成多个亮点，不能被正常运输到液泡。突变体中回补TIP20后，GFP-Atg8的运输过程恢复正常。研究结果为进一步了解Dsl1复合体在细胞自噬中的功能提供实验依据。
目录
引言
细胞自噬（autophagy）是发生在所有真核细胞中的一个主要降解途径，它是用于回收细胞质在压力条件下产生的大分子物质和能量，以除去多余和受损的细胞器以适应不断变化的营养条件，并维持细胞稳态[1]。此外，自噬在细胞保护中发挥重要作用，它能阻止有毒物质的积累，在免疫的许多方面都发挥作用，包括消除入侵的微生物和参与抗原递呈[25]。细胞自噬主要分为三类，即巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperonemediated autophagy），其中最普遍的为巨自噬[6]。酵母的巨自噬发生在自噬体组装位点(PAS,Phagophore assembly site)，细胞首先形成被称为吞噬泡（phagophore）的双层膜片结构将无用的细胞器等货物隔离开来，吞噬泡不断延伸包裹货物并封闭形成自噬体（autophagosome）。随后自噬体与液泡通过膜融合形成单层膜结构的自噬小体（autophagic body）释放到液泡中。最终内含物被水解酶降解[7]。
目前，已发现的自噬相关基因(ATG, Autophagyrelaetd Genes)有30多种，其中的18种ATG基因不仅在多种自噬途径中发挥作用，而且参与自噬体的形成，因此又称它们为自噬核心蛋白[8,9]。本实验中用于自噬表型检测的自噬核心蛋白为Atg8。当非选择性细胞自噬被诱导时, Atg8的蛋白表达量迅速升高, 是自噬相关蛋白中在PAS密度最大的蛋白, 并且Atg8的
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
量与自噬体的大小正相关[10]。在自噬体形成过程中, Atg8PE位于内外两层膜, 但当自噬体完全形成后, 外膜的Atg8 会在Atg4 的作用下, 释放回细胞质, 被循环利用；而内膜的Atg8 会随内膜一同进入液泡, 在水解酶的作用下降解。
酿酒酵母囊泡运输途径中存在着七种大分子多亚基复合体，它们作为拴系因子调控不同细胞器间的囊泡与区系的拴系过程[11,12]。随着研究的进展，一系列证据表明，其中一些大分子复合体不仅参与囊泡运输过程，同时也影响了细胞自噬过程。如在酿酒酵母中，调控高尔基体内部物质运输的大分子复合体COG，同时也调控细胞自噬过程中自噬体的形成[13]。调控反面高尔基与质膜之间囊泡运输的Excoyst复合体突变均显著影响细胞自噬[14]。调控内吞运输途径的HOPS复合体和CORVET复合体，分别调控着细胞自噬过程中自噬体与液泡的融合和自噬体的成熟过程[15]。我进行科研训练所在的实验室也有文章表明调控物质进出高尔基体的TRAPP复合体，也同样参与细胞自噬过程[16,17]。因此，多数参与囊泡运输的大分子复合体均参与调控细胞自噬。
Dsl1复合体是囊泡运输途径中七种大分子多亚基复合体之一，它调控着COPI囊泡从高尔基体到内质网物质运输中，COPI囊泡与内质网的拴系过程。在这一过程中，Dsl1复合体定位于内质网上[12,18]。最新的研究发现，内质网是自噬体形成过程中，自噬体膜的重要来源[19,20]，但定位于内质网的Dsl1复合体是否参与细胞自噬过程并不清晰。因此，本课题以Dsl1复合体亚基Tip20为研究对象，探讨Dsl1复合体是否影响细胞自噬以及Tip20亚基在细胞自噬中可能存在的功能。
1 材料与方法
1.1 实验材料
菌株 Strain
别名 Alias
基因型
Genotype
菌株来源 Source
BY4722
WT
MATα leu2, ura3
[21]
tip20ts
MATa, ura3, leu2, his4, trp1, lys2, suc2_9
[21]
GFPAtg8
BY4722, GFPAtg8::URA3
本研究
tip20ts GFPAtg8
tip20ts, GFPAtg8::URA3
本研究
质粒 Strain
别名 Alias
基因型 Genotype
菌株来源 Source
pYL125
pRS423
2μ, HIS3, Ampr
[22]
pYL233
pRS423TIP20
pRS423SEC20
pRS306GFPATG8
2μ, HIS3, Ampr
2μ, HIS3, Ampr
2μ, URA3, Ampr
本研究
本实验室
[23]
1.2 主要试剂和仪器
质粒小量抽提试剂盒：碧云天生物有限公司；胶回收试剂盒（Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.2.0）（购自Takara大连宝生物工程有限公司）DNA纯化试剂盒(DNA Fragment Purification Kit Ver.3.0) （购自美国Sigama公司）各种限制性内切酶、DNA聚合酶和T4连接酶，DNA Marker，PCR，酶切酶连反应用实际均购自TAKARA（大连宝生物工程）公司，实验所用氨基酸等试剂（购自美国Amresco公司）
梯度基因扩增仪（TaKaRa），生化培养箱SHP150、隔水式恒温培养箱GRP9050、电热恒温培养箱DRP9052（上海森信实验仪器有限公司），大容量恒温振荡器THZ25、冷冻水浴恒温振荡器（太仓市华美生化仪器厂），全自动凝胶成像分析仪JS680B（培清），琼脂糖水平电泳槽（北京六一仪器厂），稳流稳压电泳仪DYY6B（南京大学），荧光倒置显微镜（日本尼康）。
1.3 atg1Δ菌株构建
Atgl 是细胞自噬非常关键的一个蛋白, 属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 它的激活诱导细胞自噬的发生。atg1Δ缺陷型菌株无法正常完成细胞自噬过程，当非选择性自噬被诱导时，Atg8无法被运输到液泡中降解，因此可以通过对比atg1Δ缺陷型菌株与WT野生型及tip20ts突变体的蛋白降解量来判断细胞自噬水平。
1.3.1 PCR扩增ATG1基因
根据目的基因ATG1的扩增特异性设计其PCR扩增引物，引物浓度为100 μg/μmol，序列如下：
ATG1::KAN
目录
引言
细胞自噬（autophagy）是发生在所有真核细胞中的一个主要降解途径，它是用于回收细胞质在压力条件下产生的大分子物质和能量，以除去多余和受损的细胞器以适应不断变化的营养条件，并维持细胞稳态[1]。此外，自噬在细胞保护中发挥重要作用，它能阻止有毒物质的积累，在免疫的许多方面都发挥作用，包括消除入侵的微生物和参与抗原递呈[25]。细胞自噬主要分为三类，即巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperonemediated autophagy），其中最普遍的为巨自噬[6]。酵母的巨自噬发生在自噬体组装位点(PAS,Phagophore assembly site)，细胞首先形成被称为吞噬泡（phagophore）的双层膜片结构将无用的细胞器等货物隔离开来，吞噬泡不断延伸包裹货物并封闭形成自噬体（autophagosome）。随后自噬体与液泡通过膜融合形成单层膜结构的自噬小体（autophagic body）释放到液泡中。最终内含物被水解酶降解[7]。
目前，已发现的自噬相关基因(ATG, Autophagyrelaetd Genes)有30多种，其中的18种ATG基因不仅在多种自噬途径中发挥作用，而且参与自噬体的形成，因此又称它们为自噬核心蛋白[8,9]。本实验中用于自噬表型检测的自噬核心蛋白为Atg8。当非选择性细胞自噬被诱导时, Atg8的蛋白表达量迅速升高, 是自噬相关蛋白中在PAS密度最大的蛋白, 并且Atg8的
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
量与自噬体的大小正相关[10]。在自噬体形成过程中, Atg8PE位于内外两层膜, 但当自噬体完全形成后, 外膜的Atg8 会在Atg4 的作用下, 释放回细胞质, 被循环利用；而内膜的Atg8 会随内膜一同进入液泡, 在水解酶的作用下降解。
酿酒酵母囊泡运输途径中存在着七种大分子多亚基复合体，它们作为拴系因子调控不同细胞器间的囊泡与区系的拴系过程[11,12]。随着研究的进展，一系列证据表明，其中一些大分子复合体不仅参与囊泡运输过程，同时也影响了细胞自噬过程。如在酿酒酵母中，调控高尔基体内部物质运输的大分子复合体COG，同时也调控细胞自噬过程中自噬体的形成[13]。调控反面高尔基与质膜之间囊泡运输的Excoyst复合体突变均显著影响细胞自噬[14]。调控内吞运输途径的HOPS复合体和CORVET复合体，分别调控着细胞自噬过程中自噬体与液泡的融合和自噬体的成熟过程[15]。我进行科研训练所在的实验室也有文章表明调控物质进出高尔基体的TRAPP复合体，也同样参与细胞自噬过程[16,17]。因此，多数参与囊泡运输的大分子复合体均参与调控细胞自噬。
Dsl1复合体是囊泡运输途径中七种大分子多亚基复合体之一，它调控着COPI囊泡从高尔基体到内质网物质运输中，COPI囊泡与内质网的拴系过程。在这一过程中，Dsl1复合体定位于内质网上[12,18]。最新的研究发现，内质网是自噬体形成过程中，自噬体膜的重要来源[19,20]，但定位于内质网的Dsl1复合体是否参与细胞自噬过程并不清晰。因此，本课题以Dsl1复合体亚基Tip20为研究对象，探讨Dsl1复合体是否影响细胞自噬以及Tip20亚基在细胞自噬中可能存在的功能。
1 材料与方法
1.1 实验材料
菌株 Strain
别名 Alias
基因型
Genotype
菌株来源 Source
BY4722
WT
MATα leu2, ura3
[21]
tip20ts
MATa, ura3, leu2, his4, trp1, lys2, suc2_9
[21]
GFPAtg8
BY4722, GFPAtg8::URA3
本研究
tip20ts GFPAtg8
tip20ts, GFPAtg8::URA3
本研究
质粒 Strain
别名 Alias
基因型 Genotype
菌株来源 Source
pYL125
pRS423
2μ, HIS3, Ampr
[22]
pYL233
pRS423TIP20
pRS423SEC20
pRS306GFPATG8
2μ, HIS3, Ampr
2μ, HIS3, Ampr
2μ, URA3, Ampr
本研究
本实验室
[23]
1.2 主要试剂和仪器
质粒小量抽提试剂盒：碧云天生物有限公司；胶回收试剂盒（Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.2.0）（购自Takara大连宝生物工程有限公司）DNA纯化试剂盒(DNA Fragment Purification Kit Ver.3.0) （购自美国Sigama公司）各种限制性内切酶、DNA聚合酶和T4连接酶，DNA Marker，PCR，酶切酶连反应用实际均购自TAKARA（大连宝生物工程）公司，实验所用氨基酸等试剂（购自美国Amresco公司）
梯度基因扩增仪（TaKaRa），生化培养箱SHP150、隔水式恒温培养箱GRP9050、电热恒温培养箱DRP9052（上海森信实验仪器有限公司），大容量恒温振荡器THZ25、冷冻水浴恒温振荡器（太仓市华美生化仪器厂），全自动凝胶成像分析仪JS680B（培清），琼脂糖水平电泳槽（北京六一仪器厂），稳流稳压电泳仪DYY6B（南京大学），荧光倒置显微镜（日本尼康）。
1.3 atg1Δ菌株构建
Atgl 是细胞自噬非常关键的一个蛋白, 属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 它的激活诱导细胞自噬的发生。atg1Δ缺陷型菌株无法正常完成细胞自噬过程，当非选择性自噬被诱导时，Atg8无法被运输到液泡中降解，因此可以通过对比atg1Δ缺陷型菌株与WT野生型及tip20ts突变体的蛋白降解量来判断细胞自噬水平。
1.3.1 PCR扩增ATG1基因
根据目的基因ATG1的扩增特异性设计其PCR扩增引物，引物浓度为100 μg/μmol，序列如下：
ATG1::KAN
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