与水稻氮素利用相关的microrna初探
：本文对OsNAR2.1-RNAi,OE-OsNAR2.1及野生型三种材料的miRNA进行生物信息学分析，通过对miRNA的长度分析发现不同材料中miRNA的切割前体DCL可能不同，通过对材料中miRNA的差异性表达分析发现miR156，miR166，miR169，miR1874，miR1882，miR399，miR5150几个miRNA的表达可能与氮相关，通过对miRNA靶基因的pathway进行分析，基本可以确定miR397a与氮代谢相关，但仍需要通过生理生化实验进行验证。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 文献综述 1
1.1 microRNA的发现 1
1.2 植物microRNA的特点 2
1.3 miRNA的生物合成 3
1.4 miRNA的作用机制 3
1.5 miRNA的研究方法 4
1.5.1 miRNA的鉴定 4
1.5.2 miRNA表达的检测 4
1.5.3 miRNA与其靶基因相互作用的验证 4
1.6 miRNA与氮素表达的关系 5
1.7 miRNA的命名原则 5
2 材料与方法 6
2.1 材料 6
2.2 方法 6
2.2.1 数据统计及对比读数 6
2.2.2 miRNA的差异性表达 6
2.2.3 新miRNA的分析 6
2.2.4 miRNA靶基因的预测及分析 6
3. 实验结果及分析 7
3.1数据统计及对比读数 7
3.2 材料中miRNA的差异性表达 7
3.3 新miRNA的分析 9
3.4 miRNA靶基因的预测及分析 10
4 讨论 12
致谢 13
参考文献 13
与水稻氮素利用相关的microRNA初探
引言
引言:近二十年
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
来，因为模式植物的建立及分子生物学的快速发展，人们对植物发育机理有了突破性的认识。基因的表达调控及其功能的研究也成了分子生物学中是重大课题。这几年，随着microRNA（miRNA）的发现及对其作用机理不断的深入研究，miRNA已经作为一种研究基因功能的新手段，受到研究者们越来越多的关注。它是存在于植物体内的内源性非编码的单链RNA分子，通过介导基因表达在转录水平上对基因组进行修饰，从而抑制靶基因的转录，或在转录后水平，介导靶基因mRNA的裂解或抑制蛋白翻译[1]。
1 文献综述
1.1 microRNA的发现
miRNA是指长度大约为1925nt的小型非编码单链RNA分子。它最初也被称作stRNA（small temporal RNA），因为其表达一般具有特异性，而且很容易在线虫，果蝇，植物及哺乳动物中找到[2]。
第一个miRNA的发现是在1993年（Lee et al.1993），长度为22nt的miRNA，被命名为Lin－14，它能够控制线虫细胞的发育时序。这种miRNA在线虫发育的第一期及第二期大量表达，同时与对应的靶mRNA通过碱基互补配对的方式结合到靶lin－14的3’非翻译区（3’－untranslated region ，3’－UTR），抑制Lin14的翻译，从而暂时使Lin14蛋白质的表达水平下调，使线虫从第一期转化为第二期，并且不影响靶基因的转录。这一新发现，表明有一种新的机制存在于基因表达的过程当中。
相比于动物miRNA，植物miRNA则发现较晚[3]。Reinhart等（2002）于2002年第一次从植物中鉴定出miRNA[12]。他们当时以拟南芥的幼苗和花作为材料，构建出拟南芥的小分子RNA克隆文库，并得到16个microRNA，其中5条为单拷贝，11条为多拷贝。并将其依次命名为miR156—171。所发现的拟南芥miRNA的5’端均为U，与之前发现的动物miRNA类似。而与动物miRNA不同的是，这些miRNAs是通过和其对应的靶RNA互补配对介导靶基因的裂解从而使靶基因的表达下调。同年，2002年12月，Manchester大学建立了miRNAs的数据库miRBase（http://www.mirbase.org）以方便研究者查询[13]（ Griffiths－Jones et al. 2004; 2006; 2008)。
1.2 植物microRNA的特点
（1）miRNA存在于真核生物中，长度为1925nt，属于非编码序列，在3’端有几个个碱基的长度变化。
（2）没有开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）(Ambros,1989)，由独立的转录单位表达。
（3）miRNA具有高度保守型，在植物中，miRNA和其靶基因mRNA的配对几乎是完美的，其主要调节方式为直接切割。
（4）premiRNA是miRNA的前体，它为发夹结构或茎环结构。而成熟的miRNA一般位于前体的一个臂上，通过对前体的剪切加工得到（LagosQuintana et al. 2001）。
（5）miRNA以多种形式存在于基因组中,包括单拷贝、多拷贝以及基因簇等形式。其中基因簇形式在植物中并不常见,但在动物中则广泛存在。属于同一簇的miRNA同源性比较强（Bartel，2004）。同时大多数情况下，miRNA存在于基因的间隔区，说明其大多位于独立转录单位中，可以调控自身的转录（Zeng et al.，2003）。[4]
（6）miRNA的3’端为羟基，5’端为磷酸基团。5’端第一个碱基对U由严重的偏向性，对G则有抗性。第二三四个碱基则少U，二三碱基少C。(Bartel, 2004; Millar et al., 2005)
（7）miRNA具有组织特异性以及时序性，在不同的发育阶段，miRNA的表达不同，在不同的组织中，miRNA的表达也不同，说明miRNA可以参与调控复杂的基因表达，并对生物的发育生长起着决定性的作用。
（8）可以用Northern blotting对miRNA及premiRNA进行生理生化水平测验。
1.3 miRNA的生物合成
miRNA的生物合成主要分为miRNA前体基因的转录，成熟miRNA的加工运输，RISD（RNA诱导的复合沉默体）的组装及miRNA的转运四个步骤。首先，miRNA一般通过在自身启动子和RNA聚合酶II的作用下进行转录，首先生成初级转录产物primiRNA，它的长度较长，有时可达到1kb，一般要经过剪切，多聚腺苷化，5’带帽等加工。然后primiRNA在HYL1（Hyponastic Leaves 1）,DCL1（DICERLIKE1）及SE（Serrate）形成premiRNA（80～200nt），premiRNA不稳定，很快由DCL1进一步加工形成miRNA*双链复合体，然后经过Helicase酶解旋，其中一条链加工为成熟的miRNA，另一条则被降解。成熟单链组装到RISC（RNA induced silencing complex）中行使功能。[1]
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 文献综述 1
1.1 microRNA的发现 1
1.2 植物microRNA的特点 2
1.3 miRNA的生物合成 3
1.4 miRNA的作用机制 3
1.5 miRNA的研究方法 4
1.5.1 miRNA的鉴定 4
1.5.2 miRNA表达的检测 4
1.5.3 miRNA与其靶基因相互作用的验证 4
1.6 miRNA与氮素表达的关系 5
1.7 miRNA的命名原则 5
2 材料与方法 6
2.1 材料 6
2.2 方法 6
2.2.1 数据统计及对比读数 6
2.2.2 miRNA的差异性表达 6
2.2.3 新miRNA的分析 6
2.2.4 miRNA靶基因的预测及分析 6
3. 实验结果及分析 7
3.1数据统计及对比读数 7
3.2 材料中miRNA的差异性表达 7
3.3 新miRNA的分析 9
3.4 miRNA靶基因的预测及分析 10
4 讨论 12
致谢 13
参考文献 13
与水稻氮素利用相关的microRNA初探
引言
引言:近二十年
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
来，因为模式植物的建立及分子生物学的快速发展，人们对植物发育机理有了突破性的认识。基因的表达调控及其功能的研究也成了分子生物学中是重大课题。这几年，随着microRNA（miRNA）的发现及对其作用机理不断的深入研究，miRNA已经作为一种研究基因功能的新手段，受到研究者们越来越多的关注。它是存在于植物体内的内源性非编码的单链RNA分子，通过介导基因表达在转录水平上对基因组进行修饰，从而抑制靶基因的转录，或在转录后水平，介导靶基因mRNA的裂解或抑制蛋白翻译[1]。
1 文献综述
1.1 microRNA的发现
miRNA是指长度大约为1925nt的小型非编码单链RNA分子。它最初也被称作stRNA（small temporal RNA），因为其表达一般具有特异性，而且很容易在线虫，果蝇，植物及哺乳动物中找到[2]。
第一个miRNA的发现是在1993年（Lee et al.1993），长度为22nt的miRNA，被命名为Lin－14，它能够控制线虫细胞的发育时序。这种miRNA在线虫发育的第一期及第二期大量表达，同时与对应的靶mRNA通过碱基互补配对的方式结合到靶lin－14的3’非翻译区（3’－untranslated region ，3’－UTR），抑制Lin14的翻译，从而暂时使Lin14蛋白质的表达水平下调，使线虫从第一期转化为第二期，并且不影响靶基因的转录。这一新发现，表明有一种新的机制存在于基因表达的过程当中。
相比于动物miRNA，植物miRNA则发现较晚[3]。Reinhart等（2002）于2002年第一次从植物中鉴定出miRNA[12]。他们当时以拟南芥的幼苗和花作为材料，构建出拟南芥的小分子RNA克隆文库，并得到16个microRNA，其中5条为单拷贝，11条为多拷贝。并将其依次命名为miR156—171。所发现的拟南芥miRNA的5’端均为U，与之前发现的动物miRNA类似。而与动物miRNA不同的是，这些miRNAs是通过和其对应的靶RNA互补配对介导靶基因的裂解从而使靶基因的表达下调。同年，2002年12月，Manchester大学建立了miRNAs的数据库miRBase（http://www.mirbase.org）以方便研究者查询[13]（ Griffiths－Jones et al. 2004; 2006; 2008)。
1.2 植物microRNA的特点
（1）miRNA存在于真核生物中，长度为1925nt，属于非编码序列，在3’端有几个个碱基的长度变化。
（2）没有开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）(Ambros,1989)，由独立的转录单位表达。
（3）miRNA具有高度保守型，在植物中，miRNA和其靶基因mRNA的配对几乎是完美的，其主要调节方式为直接切割。
（4）premiRNA是miRNA的前体，它为发夹结构或茎环结构。而成熟的miRNA一般位于前体的一个臂上，通过对前体的剪切加工得到（LagosQuintana et al. 2001）。
（5）miRNA以多种形式存在于基因组中,包括单拷贝、多拷贝以及基因簇等形式。其中基因簇形式在植物中并不常见,但在动物中则广泛存在。属于同一簇的miRNA同源性比较强（Bartel，2004）。同时大多数情况下，miRNA存在于基因的间隔区，说明其大多位于独立转录单位中，可以调控自身的转录（Zeng et al.，2003）。[4]
（6）miRNA的3’端为羟基，5’端为磷酸基团。5’端第一个碱基对U由严重的偏向性，对G则有抗性。第二三四个碱基则少U，二三碱基少C。(Bartel, 2004; Millar et al., 2005)
（7）miRNA具有组织特异性以及时序性，在不同的发育阶段，miRNA的表达不同，在不同的组织中，miRNA的表达也不同，说明miRNA可以参与调控复杂的基因表达，并对生物的发育生长起着决定性的作用。
（8）可以用Northern blotting对miRNA及premiRNA进行生理生化水平测验。
1.3 miRNA的生物合成
miRNA的生物合成主要分为miRNA前体基因的转录，成熟miRNA的加工运输，RISD（RNA诱导的复合沉默体）的组装及miRNA的转运四个步骤。首先，miRNA一般通过在自身启动子和RNA聚合酶II的作用下进行转录，首先生成初级转录产物primiRNA，它的长度较长，有时可达到1kb，一般要经过剪切，多聚腺苷化，5’带帽等加工。然后primiRNA在HYL1（Hyponastic Leaves 1）,DCL1（DICERLIKE1）及SE（Serrate）形成premiRNA（80～200nt），premiRNA不稳定，很快由DCL1进一步加工形成miRNA*双链复合体，然后经过Helicase酶解旋，其中一条链加工为成熟的miRNA，另一条则被降解。成熟单链组装到RISC（RNA induced silencing complex）中行使功能。[1]
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