红豆杉紫杉醇合成途径ggpps和ts基因序列与时空表达分析
紫杉醇是一种具有高效抗癌特性的二萜类物质，其生物合成途径一直是科学家们研究的热点。‘金锡杉’是南方红豆杉变种，含有丰富的紫杉醇。紫杉醇的含量受其合成途径中的基因调控，本研究以‘金锡杉’为材料，运用生物信息学方法分析了紫杉醇合成途径中的两种关键酶基因GGPPS和TS的序列结构并采用半定量RT-PCR技术分析了它们的时空表达模式。生物信息学分析结果显示，基因GGPPS全长为1186bp，序列中不含有内含子，属于编码序列，其编码的蛋白质GGPPS属于胞内酶，具有亲水性和不稳定性。基因TS全长为2586bp，序列中不含有内含子，属于编码序列，其编码的蛋白质TS属于胞内酶，具有脂溶性和不稳定性。时间表达分析结果显示， GGPPS和TS在春季和夏季时期都有表达且两个基因在春季的表达量都高于在夏季的，这个结果表明两个基因的表达都受到季节的影响。组织表达分析结果表明，GGPPS和TS在‘金锡杉’的树叶、树皮、树枝和果实中都有表达且两个基因在不同组织中表达量也不同，GGPPS在树叶中表达量较高，TS在树皮中表达量较高，这些结果表明GGPPS和TS的表达均具有组织特异性。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1 材料与方法5
1.1 实验材料与仪器 5
1.1.1 实验材料5
1.1.2 酶与试剂5
1.1.3 引物设计5
1.2 生物信息学分析 6
1.3 RNA提取 6
1.4 cDNA反转录 6
1.5 半定量PCR 7
2 结果与分析7
2.1GGPPS和TS基因的结构分析7
2.1.1开放阅读框预测7
2.1.2氨基酸序列8
2.1.3 蛋白质一级结构预测结果与分析8
2.1.4 跨膜区域与信号肽预测结果与分析10
2.1.5 蛋白质亚细胞定位结果与分析12
2.1.6 蛋白质二级结构预测结果与分析12
2.1.7 蛋白质三级结构预测结果与分析13
2.2 ‘金锡杉’各组织RNA *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
提取14
2.3 GGPPS基因的表达特征分析14
2.3.1不同季节时关键酶基因GGPPS的表达量分析14
2.3.2不同组织部位中关键酶基因GGPPS的表达量分析15
2.4 TS基因的表达特征分析15
2.4.1不同季节时关键酶基因GGPPS的表达量分析15
2.4.2不同组织部位中关键酶基因GGPPS的表达量分析15
3 讨论16
致谢 17
参考文献17
红豆杉紫杉醇合成途径GGPPS和TS基因序列与时空表达分析
国家生命科学与技术人才培养基地班 刘彦君
引言
红豆杉中含有紫杉醇、红豆杉多糖、紫杉黄酮和生物碱等多种可食用的药用成分。目前研究发现，这些药用成分能够治疗多种疾病。紫杉醇是目前高效的抗癌药物；红豆杉多糖结合癌症的化疗药物一起使用，可以保护人体的心脏，减少冠心病等一系列心血管疾病的发病率；生物碱能显著提高人类的睡眠质量；鞣质，可用于治疗一些临床上的前列腺疾病；紫杉黄酮能够预防高血压，利尿，改善人的生理机能等等。?
紫杉醇是一种植物体内天然合成的二萜生物碱类药用化合物。美国化学家Wani和Wall等[1]在1971年首次从短叶红豆杉Taxus brevifolia Nutt.中提取分离出来紫杉醇并利用X光线确定了它的相应结构。紫杉醇是天然的植物次生代谢产物，其本身具有高效的抗癌作用,1979年Schiff P .B 等发现了紫杉醇抗癌的作用机理[2]，其通过结合细胞微量蛋白，从而致使纺锤体与纺锤丝这两种结构无法形成。纺锤丝与纺锤体无法牵引染色体继续进行分裂反应，肿瘤细胞的有丝分裂进程也因此停止，最终引发肿瘤细胞凋亡机制，达成抗癌的目的。作为抗癌药物，临床上紫杉醇主要应用于治疗卵巢癌和乳腺癌等癌症[3]。1992年底，美国FDA第一次批准紫杉醇作为新药Paclltaxael上市，将其用于治疗晚期卵巢癌；1994年将其批准用于乳腺癌，现在对于治疗胃癌、鼻咽癌非小细胞肺癌、和宫颈癌等恶性肿瘤具有显著的效果[4]。杨兆华等（2006）发现紫杉醇能抑制动脉内膜增生和炎症细胞浸润，防止动脉发生硬化[5]。在美国、法国进行的多次临床试验证明，红豆杉适用于多种癌症疾病的治疗，且治疗效果极佳，是癌症晚期治疗的最后一道可靠防线，被称作近十年以来科学家所发现的一种最有研究价值和治愈癌症希望的药物[67]。近来科学家研究发现红豆杉中的活性多糖能够辅助治疗肿瘤，与其他抗癌药物结合使用，治疗效果可以显著提升，同时红豆杉多糖具有提高人体自身免疫力、保肝护肝等一系列作用[8]。
一直以来，紫杉醇的生产是应用上的瓶颈，治愈一位癌症前期的病人需要两到四株成年红豆杉才能获得足够量的紫杉醇。这是因为其在红豆杉植株中本身合成率较低，含量较少，且紫杉醇的化学结构较为复杂，合成途径及部分反应原理尚未明确，因此运用化学合成的方法来获得紫杉醇其难度较大，也正因为这两种原因，紫杉醇的生产量一直较低，供需之间存在巨大的矛盾。为了解决供需之间这一显著矛盾，国内外科学家一直致力于研究运用不同的方法与途径来提高紫杉醇的合成产量，经过多年研究，取得了一些成果[913]。
紫杉醇的生物合成途径总共分为三个阶段：第一阶段，紫杉烷环母核结构的形成，先通过甲羟戊酸途径(mevalonicacid pathway，MVA) 或位于磷酸甲基赤藓糖醇途径(methylerythritol phosphate，MEP)来合成异戊二烯单元的C5结构前体，即异戊烯焦磷酸（isopentenyl diphosphate, IPP）,然后经过一系列缩合反应以及官能团修饰后，生成产物巴卡亭Ⅲ，紫杉烷环母核结构也基本形成；第二阶段，侧链苯基异丝氨酸的合成，其主要由两步反应完成：第一步是，α苯丙氨酸(αphenylalanine) 通过苯丙氨酸氨基变位(phenylalanine aminomutase，PAM) 的作用，异构化为β苯丙氨酸(βphenylalanine)；第二步是，乙酰辅酶A与生成的β苯丙氨酸结反应后生成βphenylalanyl CoA。最后一个阶段，苯基异丝氨酸侧链连接到巴卡亭Ⅲ的C13 位上，并发生酰基化反应，然后在产物侧链的C2位和C3位分别进行羟基化和苯甲酰化修饰反应，形成最后所需的产物紫杉醇。
在紫杉醇生物合成过程中有很多非相关的旁路途径存在，如果能够筛选出有效抑制旁路途径的相关抑制剂，那么就可以调控紫杉醇的生物合成反应，相应的提高其产量。如在中国红豆杉的悬浮细胞培养液中添加类似松油醇这种单萜合成抑制剂，从而抑制红豆杉植株中单萜旁路途径的产量。除此之外，樟脑和α蒎烯这两种抑制剂也能够显著影响红豆杉细胞的生长，但是却能够增加二萜产物紫杉醇的产量。因为松油醇、樟脑和α蒎烯这三种物质能够抑制红豆杉植株中的3个单萜旁路反应，从而使单萜反应大幅度下降，更多的反应将会集中到从单萜合成二萜的途径中来，大量的物质用来生物合成二萜产物紫杉醇，从而提高了其产量[14]。CollinsPavao等[15]发现添加一些激素如细胞分裂素和赤霉素有利于曼地亚红豆杉中的紫杉醇的生物合成反应，可能是因为这些激素能够抑制旁路代谢反应，如赤霉素的反馈抑制反应，赤霉素含量的增加能够使该支路的合成被明显抑制，有利于紫杉醇的生物合成代谢途径进行，从而二萜产物紫杉醇的生物合成。甘烦远等[1617]证实氯化氯胆碱（CCC）这种甾体合成代谢抑制剂也能提高紫杉醇含量。除此之外，MPTA、 TmAB和Alar等旁路合成抑制剂，也可以通过作用于旁路代谢途径中的GPPi，达到抑制其旁路代谢反应的目的，从而间接提高紫杉醇生物合成途径反应，达到提高其产量的作用。目前为止，细胞培养法提取紫杉醇开始呈现实用化的势头。可是通过细胞培养法所获得的紫杉醇含量极少且存在很大程度上的不稳定性，因此无法利用红豆杉组织培养法来进行工业化大规模生产紫杉醇。另一种运用半合成法来合成紫杉醇，其需要大量的红豆杉枝叶，所需要的生产成本极高，因此也无法运用于大规模生产。总而言之，在未来很长的一段时间内，半合成法合成紫杉醇前体物质将必须依赖于相应的生物学方法，即通过人工栽培红豆杉植株或者运用细胞培养法这些途径来达成目的，这些途径都需要全面了解和掌握紫杉醇的生物合成及其旁路竞争途径，以及这些途径所涉及的一系列反应的反应酶及其相应编码基因。做好这些理论基础研究，就可以通过促进二萜产物紫杉醇合成或抑制其旁路单萜竞争途径这些方法来提高紫杉醇的产量，即通过促进紫杉醇生物合成途径中相关的关键酶基因的表达或抑制其单萜旁路竞争途径中关键酶基因的表达来提高紫杉醇合成。因此全面了解紫杉醇生物合成及其竞争途径，以及代谢调控所需要的酶和其相应的编码基因对于提高紫杉醇产量至关重要。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1 材料与方法5
1.1 实验材料与仪器 5
1.1.1 实验材料5
1.1.2 酶与试剂5
1.1.3 引物设计5
1.2 生物信息学分析 6
1.3 RNA提取 6
1.4 cDNA反转录 6
1.5 半定量PCR 7
2 结果与分析7
2.1GGPPS和TS基因的结构分析7
2.1.1开放阅读框预测7
2.1.2氨基酸序列8
2.1.3 蛋白质一级结构预测结果与分析8
2.1.4 跨膜区域与信号肽预测结果与分析10
2.1.5 蛋白质亚细胞定位结果与分析12
2.1.6 蛋白质二级结构预测结果与分析12
2.1.7 蛋白质三级结构预测结果与分析13
2.2 ‘金锡杉’各组织RNA *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
提取14
2.3 GGPPS基因的表达特征分析14
2.3.1不同季节时关键酶基因GGPPS的表达量分析14
2.3.2不同组织部位中关键酶基因GGPPS的表达量分析15
2.4 TS基因的表达特征分析15
2.4.1不同季节时关键酶基因GGPPS的表达量分析15
2.4.2不同组织部位中关键酶基因GGPPS的表达量分析15
3 讨论16
致谢 17
参考文献17
红豆杉紫杉醇合成途径GGPPS和TS基因序列与时空表达分析
国家生命科学与技术人才培养基地班 刘彦君
引言
红豆杉中含有紫杉醇、红豆杉多糖、紫杉黄酮和生物碱等多种可食用的药用成分。目前研究发现，这些药用成分能够治疗多种疾病。紫杉醇是目前高效的抗癌药物；红豆杉多糖结合癌症的化疗药物一起使用，可以保护人体的心脏，减少冠心病等一系列心血管疾病的发病率；生物碱能显著提高人类的睡眠质量；鞣质，可用于治疗一些临床上的前列腺疾病；紫杉黄酮能够预防高血压，利尿，改善人的生理机能等等。?
紫杉醇是一种植物体内天然合成的二萜生物碱类药用化合物。美国化学家Wani和Wall等[1]在1971年首次从短叶红豆杉Taxus brevifolia Nutt.中提取分离出来紫杉醇并利用X光线确定了它的相应结构。紫杉醇是天然的植物次生代谢产物，其本身具有高效的抗癌作用,1979年Schiff P .B 等发现了紫杉醇抗癌的作用机理[2]，其通过结合细胞微量蛋白，从而致使纺锤体与纺锤丝这两种结构无法形成。纺锤丝与纺锤体无法牵引染色体继续进行分裂反应，肿瘤细胞的有丝分裂进程也因此停止，最终引发肿瘤细胞凋亡机制，达成抗癌的目的。作为抗癌药物，临床上紫杉醇主要应用于治疗卵巢癌和乳腺癌等癌症[3]。1992年底，美国FDA第一次批准紫杉醇作为新药Paclltaxael上市，将其用于治疗晚期卵巢癌；1994年将其批准用于乳腺癌，现在对于治疗胃癌、鼻咽癌非小细胞肺癌、和宫颈癌等恶性肿瘤具有显著的效果[4]。杨兆华等（2006）发现紫杉醇能抑制动脉内膜增生和炎症细胞浸润，防止动脉发生硬化[5]。在美国、法国进行的多次临床试验证明，红豆杉适用于多种癌症疾病的治疗，且治疗效果极佳，是癌症晚期治疗的最后一道可靠防线，被称作近十年以来科学家所发现的一种最有研究价值和治愈癌症希望的药物[67]。近来科学家研究发现红豆杉中的活性多糖能够辅助治疗肿瘤，与其他抗癌药物结合使用，治疗效果可以显著提升，同时红豆杉多糖具有提高人体自身免疫力、保肝护肝等一系列作用[8]。
一直以来，紫杉醇的生产是应用上的瓶颈，治愈一位癌症前期的病人需要两到四株成年红豆杉才能获得足够量的紫杉醇。这是因为其在红豆杉植株中本身合成率较低，含量较少，且紫杉醇的化学结构较为复杂，合成途径及部分反应原理尚未明确，因此运用化学合成的方法来获得紫杉醇其难度较大，也正因为这两种原因，紫杉醇的生产量一直较低，供需之间存在巨大的矛盾。为了解决供需之间这一显著矛盾，国内外科学家一直致力于研究运用不同的方法与途径来提高紫杉醇的合成产量，经过多年研究，取得了一些成果[913]。
紫杉醇的生物合成途径总共分为三个阶段：第一阶段，紫杉烷环母核结构的形成，先通过甲羟戊酸途径(mevalonicacid pathway，MVA) 或位于磷酸甲基赤藓糖醇途径(methylerythritol phosphate，MEP)来合成异戊二烯单元的C5结构前体，即异戊烯焦磷酸（isopentenyl diphosphate, IPP）,然后经过一系列缩合反应以及官能团修饰后，生成产物巴卡亭Ⅲ，紫杉烷环母核结构也基本形成；第二阶段，侧链苯基异丝氨酸的合成，其主要由两步反应完成：第一步是，α苯丙氨酸(αphenylalanine) 通过苯丙氨酸氨基变位(phenylalanine aminomutase，PAM) 的作用，异构化为β苯丙氨酸(βphenylalanine)；第二步是，乙酰辅酶A与生成的β苯丙氨酸结反应后生成βphenylalanyl CoA。最后一个阶段，苯基异丝氨酸侧链连接到巴卡亭Ⅲ的C13 位上，并发生酰基化反应，然后在产物侧链的C2位和C3位分别进行羟基化和苯甲酰化修饰反应，形成最后所需的产物紫杉醇。
在紫杉醇生物合成过程中有很多非相关的旁路途径存在，如果能够筛选出有效抑制旁路途径的相关抑制剂，那么就可以调控紫杉醇的生物合成反应，相应的提高其产量。如在中国红豆杉的悬浮细胞培养液中添加类似松油醇这种单萜合成抑制剂，从而抑制红豆杉植株中单萜旁路途径的产量。除此之外，樟脑和α蒎烯这两种抑制剂也能够显著影响红豆杉细胞的生长，但是却能够增加二萜产物紫杉醇的产量。因为松油醇、樟脑和α蒎烯这三种物质能够抑制红豆杉植株中的3个单萜旁路反应，从而使单萜反应大幅度下降，更多的反应将会集中到从单萜合成二萜的途径中来，大量的物质用来生物合成二萜产物紫杉醇，从而提高了其产量[14]。CollinsPavao等[15]发现添加一些激素如细胞分裂素和赤霉素有利于曼地亚红豆杉中的紫杉醇的生物合成反应，可能是因为这些激素能够抑制旁路代谢反应，如赤霉素的反馈抑制反应，赤霉素含量的增加能够使该支路的合成被明显抑制，有利于紫杉醇的生物合成代谢途径进行，从而二萜产物紫杉醇的生物合成。甘烦远等[1617]证实氯化氯胆碱（CCC）这种甾体合成代谢抑制剂也能提高紫杉醇含量。除此之外，MPTA、 TmAB和Alar等旁路合成抑制剂，也可以通过作用于旁路代谢途径中的GPPi，达到抑制其旁路代谢反应的目的，从而间接提高紫杉醇生物合成途径反应，达到提高其产量的作用。目前为止，细胞培养法提取紫杉醇开始呈现实用化的势头。可是通过细胞培养法所获得的紫杉醇含量极少且存在很大程度上的不稳定性，因此无法利用红豆杉组织培养法来进行工业化大规模生产紫杉醇。另一种运用半合成法来合成紫杉醇，其需要大量的红豆杉枝叶，所需要的生产成本极高，因此也无法运用于大规模生产。总而言之，在未来很长的一段时间内，半合成法合成紫杉醇前体物质将必须依赖于相应的生物学方法，即通过人工栽培红豆杉植株或者运用细胞培养法这些途径来达成目的，这些途径都需要全面了解和掌握紫杉醇的生物合成及其旁路竞争途径，以及这些途径所涉及的一系列反应的反应酶及其相应编码基因。做好这些理论基础研究，就可以通过促进二萜产物紫杉醇合成或抑制其旁路单萜竞争途径这些方法来提高紫杉醇的产量，即通过促进紫杉醇生物合成途径中相关的关键酶基因的表达或抑制其单萜旁路竞争途径中关键酶基因的表达来提高紫杉醇合成。因此全面了解紫杉醇生物合成及其竞争途径，以及代谢调控所需要的酶和其相应的编码基因对于提高紫杉醇产量至关重要。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/smkx/73.html
