小鼠脚掌炎症模型的immunoregulinha的功能研究
牛虻是重要的吸血节肢动物，其成虫是一种传统中药，唾液腺中含有多种药理活性物质。Immunoregulin HA是一种从拟黑腹瘤虻（Hybomitra atriperoides）的唾液腺提取物（Salivary gland extracts , SGE）中分离纯化鉴定得到的具有免疫抑制功能的生物活性肽，它由30个氨基酸残基组成。在研究Immunoregulin HA的抑炎功效时发现，它能影响白细胞介素10（IL-10），γ-干扰素（IFN-γ）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等细胞因子分的泌。我们运用了Western Blot和RT-qPCR等方法，分别在蛋白质磷酸化水平和mRNA水平检测了免疫调节肽对LPS（Lipopolysaccharide）诱导的炎症反应中主要信号转导途径的影响。初步研究结果表明， Immunoregulin HA主要作用于JNK/SAPK途径。而在动物模型水平， Immunoregulin HA在弗氏完全佐剂（Freunds complete adjuvant , CFA）诱导的小鼠脚掌炎症模型中初步表现出抑制炎症反应的趋势。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法5
1.1材料5
1.1.1 实验动物5
1.1.2药物与试剂5
1.1.3 仪器与设备5
1.2 验证Immunoregulin HA对LPS诱导炎症信号通路相关基因表达的影响5
1.2.1 细胞培养与给药处理5
1.2.2 细胞总RNA提取 6 1.2.3 mRNA纯化6 1.2.4 cDNA合成6 1.2.5 荧光定量PCR（qPCR）7 1.3 验证Immunoregulin HA对LPS诱导炎症信号通路相关蛋白激活的影响8
1.3.1 细胞培养与给药处理8
1.3.2 Western Blot所需试剂配制8
1.3.3 蛋白样品的制备9 1.3.4蛋白浓度的测定9 1.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）9 1.4小鼠脚掌炎症模型的构建10 1.4.1 药品的准备10 1.4.2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
炎症模型的构建10 1.4.3 分组及给药方法10 1.4.4 观察项目及检测方法11 2 结果与分析11 2.1 Immunoregulin HA对LPS诱导的炎症反应的影响11
2.2 Immunoregulin HA对佐剂诱导的小鼠脚掌炎症模型的影响12
3 讨论14
致谢15
参考文献16
基于小鼠脚掌炎症模型的Immunoregulin HA功能研究
引言
引言 为了成功地从宿主得到血餐，吸血节肢动物逐渐完善了它们的免疫抑制系统以逃避宿主的免疫应答。在与宿主长期共同进化的过程中，吸血节肢动物形成独特的刺吸式口器，通过叮咬等方式，吮吸牛马骡驴等牲畜的血液，同时传播多种人畜共患疾病，如丝虫病等[1]。为了抵抗宿主的止血，吸血节肢动物通过特殊的口器从它们的唾液腺中向宿主表皮内注入抗凝血、抗血小板聚集、血管舒张的物质[2]。除此以外，吸血节肢动物的唾液腺中还含有其他许多行使不同功能的药理活性物质，如在各种蜱虫中，从唾液腺分离纯化得到的并在体外验证其功能的抗菌肽、神经肽、免疫抑制剂，凝血酶抑制剂，血小板聚集抑制剂等[36]。研究人员发现，其中某些具有免疫调节活性的短肽，有较高的清除自由基的活性和抗氧化能力。同时免疫调节肽通过抑制宿主炎症因子的分泌，如TNFα、IFNγ、IL1等或增加免疫抑制因子的分泌，如IL10等直接或间接地抵御宿主的免疫排斥和对炎症的应答。他们还通过构建弗氏完全佐剂诱导的小鼠脚掌炎症模型，在动物模型水平上进一步确认这些多肽具有调节宿主免疫排斥的功能 [6,7]。吸血节肢动物的唾液腺中含有丰富的免疫调节肽资源，这早在1987年就得到了证实，开启了该领域研究的先河[8]。天然的免疫调节肽来源分布极广，可初步分为微生物来源、植物来源及动物来源[9]。立足于中国丰富的昆虫资源，来自吸血节肢动物唾液腺的免疫调节肽逐渐成为最近的研究热门[10]。
牛虻是虻科动物的总称，作为重要的吸血节肢动物，主要吸食牛、马等家畜的血液，其成虫是一味传统的抗血栓中药——虻虫，具有破血逐瘀通经闭的功效，关于虻虫的各种药方在《本草经疏》等古籍医书中均有记录。随着近些年来生物技术的发展，科研工作者们运用蛋白质组学和多肽组学结合药理学的研究手段，在多种虻科昆虫中分离纯化得到了各种各样的活性物质，并鉴定了它们的功能，为挖掘牛虻宝贵的药用价值打下了基础[11]。
Xu等在姚虻唾液腺提取物中分离纯化出一类全新的免疫抑制肽类家族，首次定义了牛虻唾液腺中具有免疫抑制活性的物质的存在[12]。Zhao等从雁虻的唾液腺提取物中分离纯化出免疫调节肽Immunoregulin TP1，并且验证了Immunoregulin TP1具有调节免疫相关细胞因子分泌的功能[13]。Yan等从拟黑腹瘤虻(Hybomitra atriperoides）的唾液腺提取物中分离纯化得到了一种全新的免疫调节肽，命名为Immunoregulin HA[1,14]。拟黑腹瘤虻(Hybomitra atriperoides)，属昆虫纲(Insecta)，双翅目(Diptera)，短角亚目(Brachycera )，虻科(Tabanidae)，瘤虻属(Hybomitra Enderlein)[15]，在我国主要分布于甘肃地区。Yan等利用Edman降解法测定了从拟黑腹牛虻唾液腺中分离纯化得到的Immunoregulin HA的氨基酸序列为GGVTGVTEFEPVDVSGEDYDSDEMDEDGRA。建立拟黑腹牛虻的cDNA文库， 克隆编码Immunoregulin HA前体的cDNA序列，发现它的前体肽由68个氨基酸残基组成，在精氨酸赖氨酸（Arg–Lys）位点经酶切后释放出含有30个氨基酸残基的成熟肽。前期研究表明，在LPS诱导大鼠脾细胞产生炎症反应的模型中，该多肽能显著提高小鼠脾细胞白细胞介素10（IL10）的分泌并显著抑制γ干扰素（IFNγ）及单核细胞趋化蛋白1（MCP1）的分泌[14]。
LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要组成成分，机体对LPS的识别与信号转导是免疫炎症反应的重要环节[16]。在本研究中，通过LPS刺激体外培养的Wistar大鼠腹腔巨噬细胞模拟炎症反应，进一步深入研究免疫调节肽Immunoregulin HA作用的机理。由于IκBα、ERK、JNK和p38 MAPK 蛋白是LPS介导的MAPK信号通路中的关键蛋白，其信号转导途径也是细胞增殖和细胞因子分泌的相关途径[17]，本研究通过RTqPCR的方法在mRNA水平上检测上述信号转导途径中相关基因的表达情况，同时运用Western Blot验证免疫调节肽作用于LPS 诱导的炎症模型中IκBα、ERK、JNK和p38 MAPK等对应的磷酸化蛋白pIκBα、pERK、pJNK和pp38等的表达量变化，从而确定免疫调节肽涉及的信号通路。
由于药物在体内外作用的机制可能存在差异，为了更好的验证免疫调节肽的功能，建立了在体外的细胞、分子、蛋白水平上验证的基础后，动物模型的建立能更好的演绎Immunoregulin HA在宿主体内发挥抗炎效应的过程。动物炎症模型在前期研究的基础上进一步验证抗炎药物的功效，同时推动了治疗炎症药物的发展。Dr.David E. Trentham于1977年创立了胶原诱导的关节炎（Collageninduced arthritis , CIA）模型[18]，CIA是一种依赖T细胞免疫的关节炎模型[19]，通过皮下注射等量胶原和CFA混合液的方式来诱导关节炎[20]。和CIA一样被广泛使用的小鼠炎症模型还有AIA，比较经典的诱导炎症的方法是：使用加入结核分枝杆菌的IFA制成CFA，然后通过皮下注射诱导炎症。研究发现结核分枝杆菌激发的热休克蛋白与弗氏完全佐剂诱导的关节炎发病密切相关，它与关节滑膜上的一个糖蛋白分子结构相似，可以被同一株克隆T细胞所识别，从而诱发免疫反应[21]。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法5
1.1材料5
1.1.1 实验动物5
1.1.2药物与试剂5
1.1.3 仪器与设备5
1.2 验证Immunoregulin HA对LPS诱导炎症信号通路相关基因表达的影响5
1.2.1 细胞培养与给药处理5
1.2.2 细胞总RNA提取 6 1.2.3 mRNA纯化6 1.2.4 cDNA合成6 1.2.5 荧光定量PCR（qPCR）7 1.3 验证Immunoregulin HA对LPS诱导炎症信号通路相关蛋白激活的影响8
1.3.1 细胞培养与给药处理8
1.3.2 Western Blot所需试剂配制8
1.3.3 蛋白样品的制备9 1.3.4蛋白浓度的测定9 1.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）9 1.4小鼠脚掌炎症模型的构建10 1.4.1 药品的准备10 1.4.2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
炎症模型的构建10 1.4.3 分组及给药方法10 1.4.4 观察项目及检测方法11 2 结果与分析11 2.1 Immunoregulin HA对LPS诱导的炎症反应的影响11
2.2 Immunoregulin HA对佐剂诱导的小鼠脚掌炎症模型的影响12
3 讨论14
致谢15
参考文献16
基于小鼠脚掌炎症模型的Immunoregulin HA功能研究
引言
引言 为了成功地从宿主得到血餐，吸血节肢动物逐渐完善了它们的免疫抑制系统以逃避宿主的免疫应答。在与宿主长期共同进化的过程中，吸血节肢动物形成独特的刺吸式口器，通过叮咬等方式，吮吸牛马骡驴等牲畜的血液，同时传播多种人畜共患疾病，如丝虫病等[1]。为了抵抗宿主的止血，吸血节肢动物通过特殊的口器从它们的唾液腺中向宿主表皮内注入抗凝血、抗血小板聚集、血管舒张的物质[2]。除此以外，吸血节肢动物的唾液腺中还含有其他许多行使不同功能的药理活性物质，如在各种蜱虫中，从唾液腺分离纯化得到的并在体外验证其功能的抗菌肽、神经肽、免疫抑制剂，凝血酶抑制剂，血小板聚集抑制剂等[36]。研究人员发现，其中某些具有免疫调节活性的短肽，有较高的清除自由基的活性和抗氧化能力。同时免疫调节肽通过抑制宿主炎症因子的分泌，如TNFα、IFNγ、IL1等或增加免疫抑制因子的分泌，如IL10等直接或间接地抵御宿主的免疫排斥和对炎症的应答。他们还通过构建弗氏完全佐剂诱导的小鼠脚掌炎症模型，在动物模型水平上进一步确认这些多肽具有调节宿主免疫排斥的功能 [6,7]。吸血节肢动物的唾液腺中含有丰富的免疫调节肽资源，这早在1987年就得到了证实，开启了该领域研究的先河[8]。天然的免疫调节肽来源分布极广，可初步分为微生物来源、植物来源及动物来源[9]。立足于中国丰富的昆虫资源，来自吸血节肢动物唾液腺的免疫调节肽逐渐成为最近的研究热门[10]。
牛虻是虻科动物的总称，作为重要的吸血节肢动物，主要吸食牛、马等家畜的血液，其成虫是一味传统的抗血栓中药——虻虫，具有破血逐瘀通经闭的功效，关于虻虫的各种药方在《本草经疏》等古籍医书中均有记录。随着近些年来生物技术的发展，科研工作者们运用蛋白质组学和多肽组学结合药理学的研究手段，在多种虻科昆虫中分离纯化得到了各种各样的活性物质，并鉴定了它们的功能，为挖掘牛虻宝贵的药用价值打下了基础[11]。
Xu等在姚虻唾液腺提取物中分离纯化出一类全新的免疫抑制肽类家族，首次定义了牛虻唾液腺中具有免疫抑制活性的物质的存在[12]。Zhao等从雁虻的唾液腺提取物中分离纯化出免疫调节肽Immunoregulin TP1，并且验证了Immunoregulin TP1具有调节免疫相关细胞因子分泌的功能[13]。Yan等从拟黑腹瘤虻(Hybomitra atriperoides）的唾液腺提取物中分离纯化得到了一种全新的免疫调节肽，命名为Immunoregulin HA[1,14]。拟黑腹瘤虻(Hybomitra atriperoides)，属昆虫纲(Insecta)，双翅目(Diptera)，短角亚目(Brachycera )，虻科(Tabanidae)，瘤虻属(Hybomitra Enderlein)[15]，在我国主要分布于甘肃地区。Yan等利用Edman降解法测定了从拟黑腹牛虻唾液腺中分离纯化得到的Immunoregulin HA的氨基酸序列为GGVTGVTEFEPVDVSGEDYDSDEMDEDGRA。建立拟黑腹牛虻的cDNA文库， 克隆编码Immunoregulin HA前体的cDNA序列，发现它的前体肽由68个氨基酸残基组成，在精氨酸赖氨酸（Arg–Lys）位点经酶切后释放出含有30个氨基酸残基的成熟肽。前期研究表明，在LPS诱导大鼠脾细胞产生炎症反应的模型中，该多肽能显著提高小鼠脾细胞白细胞介素10（IL10）的分泌并显著抑制γ干扰素（IFNγ）及单核细胞趋化蛋白1（MCP1）的分泌[14]。
LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要组成成分，机体对LPS的识别与信号转导是免疫炎症反应的重要环节[16]。在本研究中，通过LPS刺激体外培养的Wistar大鼠腹腔巨噬细胞模拟炎症反应，进一步深入研究免疫调节肽Immunoregulin HA作用的机理。由于IκBα、ERK、JNK和p38 MAPK 蛋白是LPS介导的MAPK信号通路中的关键蛋白，其信号转导途径也是细胞增殖和细胞因子分泌的相关途径[17]，本研究通过RTqPCR的方法在mRNA水平上检测上述信号转导途径中相关基因的表达情况，同时运用Western Blot验证免疫调节肽作用于LPS 诱导的炎症模型中IκBα、ERK、JNK和p38 MAPK等对应的磷酸化蛋白pIκBα、pERK、pJNK和pp38等的表达量变化，从而确定免疫调节肽涉及的信号通路。
由于药物在体内外作用的机制可能存在差异，为了更好的验证免疫调节肽的功能，建立了在体外的细胞、分子、蛋白水平上验证的基础后，动物模型的建立能更好的演绎Immunoregulin HA在宿主体内发挥抗炎效应的过程。动物炎症模型在前期研究的基础上进一步验证抗炎药物的功效，同时推动了治疗炎症药物的发展。Dr.David E. Trentham于1977年创立了胶原诱导的关节炎（Collageninduced arthritis , CIA）模型[18]，CIA是一种依赖T细胞免疫的关节炎模型[19]，通过皮下注射等量胶原和CFA混合液的方式来诱导关节炎[20]。和CIA一样被广泛使用的小鼠炎症模型还有AIA，比较经典的诱导炎症的方法是：使用加入结核分枝杆菌的IFA制成CFA，然后通过皮下注射诱导炎症。研究发现结核分枝杆菌激发的热休克蛋白与弗氏完全佐剂诱导的关节炎发病密切相关，它与关节滑膜上的一个糖蛋白分子结构相似，可以被同一株克隆T细胞所识别，从而诱发免疫反应[21]。
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