osysl15调控铁由根部向上转运功能的初探
：铁营养的吸收与转运对于植物的生长与繁殖是很重要的，研究表明，植物吸收铁有两种途径，即策略Ⅰ和策略Ⅱ，其中策略Ⅰ适用于双子叶和非禾本科单子叶植物，策略Ⅱ适用于禾本科植物。关于OsYSL15与铁的吸收相关的功能已有报道，本实验主要通过表达模式分析、表型分析、金属的含量测定和转基因回补等实验手段，探索OsYSL15基因调控铁由根部向上转运的功能，结果证明OsYSL15参与铁从根部向地上部转运的调控。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法4
1.1材料 4
1．2 菌株、载体4
1．3 突变体的鉴定4
1．4 金属浓度分析5
1．5 Gateway系统构建载体.5
1．5．1 RNA的提取5
1．5．2 RNA反转录成cDNA 6
1．5．3使用内参基因Actin检测反转录情况.6
1．5．4 GateWay技术构建载体6
1．6水稻回补株系的构建 ..10
1．6．1农杆菌EHA105感受态细胞的制备双元载体转化10
1．6．2双元载体转化农杆菌10
1．6．3水稻转化受体的准备10
1．6．4农杆菌的培养10
1．6．5水稻愈伤组织与农杆菌的共培养10
1．6．6抗性愈伤组织的筛选11
1．6．7抗性愈伤组织的分化11
1．6．8生根、壮苗和移栽11
1．7 OsYSL15基因表达量..11
2 结果与分析 ...11
2．1半定量结果..11
2．2突变体的鉴定..12
2．3野生型与突变体表现差异..12
2．4金属含量的测定..12
2．5 GateWay构载体..13
2．6 组培结果.15
3 讨论 ...16
3．1 关于水稻OsYSL15基....16
3．2 关于缺Fe处理幼苗...17
3
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
．3 关于OsYSL15基因的克隆....17
3．4 关于水稻表达载体的构建.17
3. 5 关于组培及农杆菌侵染.....17
3. 6 关于水稻家族序列分析.17
致谢...18
参考文献19
附录A 溶液配制20
附录B 激素和抗生素21
附录C 消煮数据22
OsYSL15调控铁由根部向上转运功能的初探
引言
铁是植物生长必需的微量元素之一，在植物生长发育过程中起到至关重要的作用。缺铁环境会导致植物的代谢失衡，影响叶绿体的生长发育，使其光合速率降低，影响植物的正常生长[12]。
虽然土壤环境中铁含量非常丰富，通常是以较稳定的氧化态存在，导致植物无法利用，故植物缺铁现象严重[3]。
在人体中，铁分布范围很广，对人的生命活动起到至关重要的作用，目前人类铁营养的缺乏是世界上最普遍的营养缺乏症，当人体缺铁时，就会引起如威尔逊，帕金森和贫血等疾病，影响患者的智力和身体发育。因此，了解水稻对铁的吸收转运机制，可以增加水稻中铁含量，进而改善某些缺铁性疾病，研究意义重大[4]。
水稻对于铁的吸收转运大体可以分为如下几个环节，即根部吸收、木质部装载、木质部运输、木质部卸载，亚细胞器（叶绿体和液泡）存储等过程，才能在植物体内发挥相应的生理作用[5]。
目前高等植物根部吸收铁的机理已经研究得较为详细，1986年，Romheld和Marschner首先提出高等植物适应缺铁胁迫的铁吸收系统，即策略Ⅰ( StrategyⅠ)和策略Ⅱ ( StrategyⅡ ) [6]。Kobayashi和 Nishizawa对此做出了较为详细的总结[7]。
策略Ⅰ（还原法），适用于大豆、花生等双子叶和非禾本科单子叶植物。包括三部分：（1）根系质膜上ATPase分泌H+降低土壤pH值，增加土壤中铁的溶解性（2）通过铁还原酶FRO还原吸附在根表皮的三价铁（3）根系质膜上的二价铁转运体IRT( Iron regulated transporter 1 )将其转入胞内，然后由转运蛋白转运到各个细胞器供利用[8]。
图1 双子叶和非禾本科单子叶植物根系Fe吸收机理
策略Ⅱ（螯合法），小麦、水稻、玉米等禾本科植物特有的铁吸收方式，一旦受到低铁胁迫，体内就会合成大量的高铁载体(Phytosiderophore，PS)，分泌到土壤中，螯合土壤中的Fe3+，再通过YSL家族转运至胞内，释放Fe3+，供代谢利用[8]。
图2 草本单子叶植物根系Fe吸收机理
铁载体MAs家族的合成过程：
对于铁元素如何从根表皮细胞到木质部转运这一问题研究的还不是很透彻，Inoue等研究发现OsNAS1、OsNAS2和OsNAAT1在木质部和根表皮细胞中均有大量表达，由此推测DMA或NA可能与铁离子形成复合物参与到铁由根表皮细胞向木质部转运的过程，而完成这一过程的转运蛋白还尚未发现，本文中的OsYSL15极有可能就是完成这一过程的转运蛋白[910]。
通过阅读文献发现OsYSL15特异性的在根部强烈表达，且在表皮细胞和维管束细胞中均有较为强烈的表达。进一步对本实验室缺铁处理下的高通量测序结果分析发现缺铁处理下，水稻根部OsYSL2、OsYSL9、OsYSL15、OsYSL16均受到诱导表达，其中OsYSL15诱导表达最为强烈。上述基因表达情况均暗示缺铁条件下OsYSL15在水稻根中起到重要作用，而这种作用很可能不单单是只与铁吸收相关，还可能与水稻铁向地上部转运过程相关。
为了进一步确定OsYSL15参与到水稻体内铁向地上部运输过程，以OsYSL15突变体10712纯合植株为实验材料，在0.2、2、20 μmol/L FeSO4处理下分析植株地下部、地上部铁元素的含量，并计算地下部到地上部的转运系数，结果表明突变体地下部到地上部的转运系数小于野生型的转运系数。这一结果支持了OsYSL15参与到水稻体内铁向地上部转运功能的假说。然而这些还不足以确切的说明这一问题，还应通过根中各部位基因表达、回补株系等相关实验确认该基因功能。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法4
1.1材料 4
1．2 菌株、载体4
1．3 突变体的鉴定4
1．4 金属浓度分析5
1．5 Gateway系统构建载体.5
1．5．1 RNA的提取5
1．5．2 RNA反转录成cDNA 6
1．5．3使用内参基因Actin检测反转录情况.6
1．5．4 GateWay技术构建载体6
1．6水稻回补株系的构建 ..10
1．6．1农杆菌EHA105感受态细胞的制备双元载体转化10
1．6．2双元载体转化农杆菌10
1．6．3水稻转化受体的准备10
1．6．4农杆菌的培养10
1．6．5水稻愈伤组织与农杆菌的共培养10
1．6．6抗性愈伤组织的筛选11
1．6．7抗性愈伤组织的分化11
1．6．8生根、壮苗和移栽11
1．7 OsYSL15基因表达量..11
2 结果与分析 ...11
2．1半定量结果..11
2．2突变体的鉴定..12
2．3野生型与突变体表现差异..12
2．4金属含量的测定..12
2．5 GateWay构载体..13
2．6 组培结果.15
3 讨论 ...16
3．1 关于水稻OsYSL15基....16
3．2 关于缺Fe处理幼苗...17
3
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
．3 关于OsYSL15基因的克隆....17
3．4 关于水稻表达载体的构建.17
3. 5 关于组培及农杆菌侵染.....17
3. 6 关于水稻家族序列分析.17
致谢...18
参考文献19
附录A 溶液配制20
附录B 激素和抗生素21
附录C 消煮数据22
OsYSL15调控铁由根部向上转运功能的初探
引言
铁是植物生长必需的微量元素之一，在植物生长发育过程中起到至关重要的作用。缺铁环境会导致植物的代谢失衡，影响叶绿体的生长发育，使其光合速率降低，影响植物的正常生长[12]。
虽然土壤环境中铁含量非常丰富，通常是以较稳定的氧化态存在，导致植物无法利用，故植物缺铁现象严重[3]。
在人体中，铁分布范围很广，对人的生命活动起到至关重要的作用，目前人类铁营养的缺乏是世界上最普遍的营养缺乏症，当人体缺铁时，就会引起如威尔逊，帕金森和贫血等疾病，影响患者的智力和身体发育。因此，了解水稻对铁的吸收转运机制，可以增加水稻中铁含量，进而改善某些缺铁性疾病，研究意义重大[4]。
水稻对于铁的吸收转运大体可以分为如下几个环节，即根部吸收、木质部装载、木质部运输、木质部卸载，亚细胞器（叶绿体和液泡）存储等过程，才能在植物体内发挥相应的生理作用[5]。
目前高等植物根部吸收铁的机理已经研究得较为详细，1986年，Romheld和Marschner首先提出高等植物适应缺铁胁迫的铁吸收系统，即策略Ⅰ( StrategyⅠ)和策略Ⅱ ( StrategyⅡ ) [6]。Kobayashi和 Nishizawa对此做出了较为详细的总结[7]。
策略Ⅰ（还原法），适用于大豆、花生等双子叶和非禾本科单子叶植物。包括三部分：（1）根系质膜上ATPase分泌H+降低土壤pH值，增加土壤中铁的溶解性（2）通过铁还原酶FRO还原吸附在根表皮的三价铁（3）根系质膜上的二价铁转运体IRT( Iron regulated transporter 1 )将其转入胞内，然后由转运蛋白转运到各个细胞器供利用[8]。
图1 双子叶和非禾本科单子叶植物根系Fe吸收机理
策略Ⅱ（螯合法），小麦、水稻、玉米等禾本科植物特有的铁吸收方式，一旦受到低铁胁迫，体内就会合成大量的高铁载体(Phytosiderophore，PS)，分泌到土壤中，螯合土壤中的Fe3+，再通过YSL家族转运至胞内，释放Fe3+，供代谢利用[8]。
图2 草本单子叶植物根系Fe吸收机理
铁载体MAs家族的合成过程：
对于铁元素如何从根表皮细胞到木质部转运这一问题研究的还不是很透彻，Inoue等研究发现OsNAS1、OsNAS2和OsNAAT1在木质部和根表皮细胞中均有大量表达，由此推测DMA或NA可能与铁离子形成复合物参与到铁由根表皮细胞向木质部转运的过程，而完成这一过程的转运蛋白还尚未发现，本文中的OsYSL15极有可能就是完成这一过程的转运蛋白[910]。
通过阅读文献发现OsYSL15特异性的在根部强烈表达，且在表皮细胞和维管束细胞中均有较为强烈的表达。进一步对本实验室缺铁处理下的高通量测序结果分析发现缺铁处理下，水稻根部OsYSL2、OsYSL9、OsYSL15、OsYSL16均受到诱导表达，其中OsYSL15诱导表达最为强烈。上述基因表达情况均暗示缺铁条件下OsYSL15在水稻根中起到重要作用，而这种作用很可能不单单是只与铁吸收相关，还可能与水稻铁向地上部转运过程相关。
为了进一步确定OsYSL15参与到水稻体内铁向地上部运输过程，以OsYSL15突变体10712纯合植株为实验材料，在0.2、2、20 μmol/L FeSO4处理下分析植株地下部、地上部铁元素的含量，并计算地下部到地上部的转运系数，结果表明突变体地下部到地上部的转运系数小于野生型的转运系数。这一结果支持了OsYSL15参与到水稻体内铁向地上部转运功能的假说。然而这些还不足以确切的说明这一问题，还应通过根中各部位基因表达、回补株系等相关实验确认该基因功能。
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