针对全基因组测序的细菌DNA大量提取最优方法的探索
针对全基因组测序的细菌DNA大量提取最优方法的探索[20200614171439]
摘要: 以 Dyella jiangningensis SBZ3-12为实验材料,采用试剂盒法,酶解法,水煮法，改进的酶解法四种方法提取细菌基因组DNA，并从DNA纯度、DNA得率以及提取成本等方面进行比较，优化细菌基因组DNA提取方法。结果显示，试剂盒法提取的DNAA260/A280=2.02，DNA浓度为1501.15 ng/μL;酶解法提取的DNAA260/A280=2.05，DNA浓度为2605.3 ng/μL;水煮法提取的DNAA260/A280=1.69，DNA浓度为1065.9 ng/μL;改进的酶解法提取细菌基因组DNA A260/A280=1.97，符合基因组测序要求的A260/A280=1.8-2.0，DNA浓度为1654.8 ng/μL，符合测序要求的100ng/μL以上。因此，改进的酶解法提取的DNA用于细菌全基因组测序效果最好。
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关键字:全基因组测序,DNA提取,酶解法,优化
目录
摘要 1
引言
1引言
随着分子生物学的不断发展, 核酸分析已在生物学各领域得到广泛应用, 细菌DNA 的提取日益成为一种常规的实验手段。作为分子生物学研究的第一步, 样品DNA 的提取显得尤为重要。提取DNA 的总量、纯度、片段大小, 都将对后续工作产生影响。比如接下来的PCR，以及PCR-DGGE分析等。
Xie & Yokota (2005)[12]从菜园土中分离得到3株新的菌株，并提出将这三株菌归为Dyella属，根据16s rRNA基因序列的比对，Dyella属与Xanthomonadaceae科的Frateuria属, Rhodanobacter 属和Fulvimonas属相近，目前该属已经有七个已报道的物种，本实验采用的Dyella jiangningensis SBZ3-12是分离自南京江宁区钾质粗面岩的一株新种[13]。实验表明菌株SBZ3-12能在贫瘠条件下有效分化黑云母，并且比对照能释放出更多的Fe、Si、Al。虽然近年来国内外的学者对细菌分化矿物的机制做了很多的研究，从早期的宏观水平层面上的分析，例如细菌产生的生物膜、有机酸、铁载体等，到现在的运用分子生物学手段，如转录组学、基因组学等方面的研究，但是细菌风化矿物的机制至今没有统一的结论。接下来对D. jiangningensis SBZ3-12的研究，就是要运用分子生物学以及生物信息学等手段对该菌株进行进一步的分析，比如各个功能基因的确定，在此之前，需要全基因组测序，也就是需要对该菌株进行基因组DNA的大量提取，满足测序需要。
本实验目的就在于采用不同的DNA提取方法，通过检测菌株的纯度、DNA纯度、浓度、得率、片段完整性以及比较耗费的时间、经济成本探寻最优的基因组DNA提取方法，从而提取出符合测序要求的基因组 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
DNA，在此基础上为相类似的实验提供可循的参考及建议。
2 材料与方法
2.1材料
2.1.1 菌体制备
取1-2 g湿菌体（3-10个平板或者接瓶培养）于40 mL螺口离心管中，备用。
2.1.2 试剂
1×TE溶液，溶菌酶，20% SDS，蛋白酶K，苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），3 M NaAc，5M Kac，CTAB-NaCl溶液，异丙醇，70% 乙醇，RNA酶。
2.1.3 器材
水浴锅，高速冷冻离心机，细菌基因组DNA提取试剂盒，PCR仪，电泳仪等。
2.2方法
2.2.1提取方法1 试剂盒法提DNA
采用国内GENRAY公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）进行试验。取菌株 SBZ3-12培养的菌液1.5 mL，8000 rpm离心，1.5 mL TE重悬，加入3 mL Digestion Solution，混匀；加入40 μL RNase A混匀，55 ℃保温10 min，再加入40 μL Proteinase K，55 ℃保温30min。依次添加3 mL Ext Solution 以及3 mL PB Solution 充分摇匀，12000 rpm室温离心5min，取下层溶液，转移到套放于2 mL收集管内的GenClean柱中，8000 rpm室温离心1min。取下GenClean柱，弃去收集管中的废液，将GenClean柱放回收集管中，加入500 μL Wash Solution, 12000 rpm，室温离心1min，除去残留的Wash Solution。将GenClean柱放入新的洁净的1.5 mL离心管中，在GenClean柱中央加入预热到70 ℃（以提高洗脱效率）的100 μL Elution Buffer，室温放置2min。12000 rpm，室温离心1min，离心管中的液体基因组DNA。[2]
2.2.2提取方法2 酶解法提DNA
菌株 SBZ3-12培养的菌液50 mL，8000 rpm离心5min，收集菌体，在装有菌体的离心管中，加入含有溶菌酶的1×TE溶液约7 mL（使溶菌酶的终浓度为5 mg/mL），37 ℃保温2h，期间每15min翻转混匀一次；随后加入700 μL 20 % SDS，再加20 mg/mL蛋白酶K，至终浓度为2 mg/mL，充分混匀，37 ℃保温40min，期间每10min左右翻转一次。随后用苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）溶液多次抽提[4]，每次充分混匀，12000 rpm低温离心10 min，直至蛋白被抽提干净为止，最后用氯仿：异戊醇（24:1）抽提。加1/10体积的3 mol/L NaAc溶液，混合后加等体积的异丙醇，小心上下搅动混匀，使DNA形成可见的絮状沉淀；用洁净玻璃棒搅出DNA，用5 mL70% 乙醇洗2次，室温干燥后溶于1×TE溶液中（视DNA的量而定）[8]。在溶有DNA的1×TE溶液中加高温处理过的RNA酶至终浓度为100 μg/mL，37 ℃保温30 min；苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）溶液抽提3次左右[9]，每次充分摇匀，12000 rpm低温离心10min，加等体积的异丙醇，1/10倍体积的3 M NaAc，小心上下混匀；用洁净玻璃棒搅出 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
DNA，用7 mL 70% 乙醇清洗两次，室温下干燥，溶于超纯水中（至DNA溶解为止）。
2.2.3提取方法3 改进的水煮法
在装有菌体的40 mL螺口离心管中加入约1×TE溶液约7 mL，混匀，随后放入100 ℃的水浴锅中，沸水浴约8 min，12000 rpm离心10 min，取上清液，再加1 mL 20% SDS溶液，混匀，65 ℃热水浴中放置30min，期间每十分钟左右颠倒混匀一次[1]。然后加入约5 mL 5 M的KAc，混匀，冰浴约5 min，12000 rpm低温离心10 min，取上清液即为所需DNA溶液，加等体积的异丙醇，1/10倍体积的3 M NaAc，小心上下混匀[4]；用洁净玻璃棒搅出DNA，用7 mL 70% 乙醇清洗两次，室温下干燥，溶于超纯水中（至DNA溶解为止）。
2.2.4提取方法4改进的酶解法
方法基本与第二种方法相同，先在装有菌体的离心管中，加入含有溶菌酶的1×TE溶液约7 mL（使溶菌酶的终浓度为5 mg/mL），37 ℃保温2 h，期间每15 min翻转混匀一次；随后加入700 μL 20% SDS，再加20 mg/mL蛋白酶K，至终浓度为2 mg/mL，充分混匀，37 ℃保温40 min，期间每10 min左右翻转一次。在这一步时，先不抽提蛋白，而是加入1/6倍体积的5 M Nacl和1/6倍体积的CTAB-Nacl Solution，（CTAB-Nacl溶液：CTAB 10 mg/mL，Nacl 0.7 mol/l）[11]。在这之后就是酚：氯仿：异戊醇抽提，最后氯仿：异戊醇抽提，再加1/10倍体积的3M NaAc，等体积的异丙醇，小心上下混匀；用洁净玻璃棒搅出DNA，用7 mL 70% 乙醇清洗两次，室温下干燥，溶于超纯水中（至DNA溶解为止）。
2.3.3 16SrRNA 基因扩增
试剂盒法 DNA kit method 30.023 14.86 2.02 2.04 1501.15
摘要: 以 Dyella jiangningensis SBZ3-12为实验材料,采用试剂盒法,酶解法,水煮法，改进的酶解法四种方法提取细菌基因组DNA，并从DNA纯度、DNA得率以及提取成本等方面进行比较，优化细菌基因组DNA提取方法。结果显示，试剂盒法提取的DNAA260/A280=2.02，DNA浓度为1501.15 ng/μL;酶解法提取的DNAA260/A280=2.05，DNA浓度为2605.3 ng/μL;水煮法提取的DNAA260/A280=1.69，DNA浓度为1065.9 ng/μL;改进的酶解法提取细菌基因组DNA A260/A280=1.97，符合基因组测序要求的A260/A280=1.8-2.0，DNA浓度为1654.8 ng/μL，符合测序要求的100ng/μL以上。因此，改进的酶解法提取的DNA用于细菌全基因组测序效果最好。
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关键字:全基因组测序,DNA提取,酶解法,优化
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引言
1引言
随着分子生物学的不断发展, 核酸分析已在生物学各领域得到广泛应用, 细菌DNA 的提取日益成为一种常规的实验手段。作为分子生物学研究的第一步, 样品DNA 的提取显得尤为重要。提取DNA 的总量、纯度、片段大小, 都将对后续工作产生影响。比如接下来的PCR，以及PCR-DGGE分析等。
Xie & Yokota (2005)[12]从菜园土中分离得到3株新的菌株，并提出将这三株菌归为Dyella属，根据16s rRNA基因序列的比对，Dyella属与Xanthomonadaceae科的Frateuria属, Rhodanobacter 属和Fulvimonas属相近，目前该属已经有七个已报道的物种，本实验采用的Dyella jiangningensis SBZ3-12是分离自南京江宁区钾质粗面岩的一株新种[13]。实验表明菌株SBZ3-12能在贫瘠条件下有效分化黑云母，并且比对照能释放出更多的Fe、Si、Al。虽然近年来国内外的学者对细菌分化矿物的机制做了很多的研究，从早期的宏观水平层面上的分析，例如细菌产生的生物膜、有机酸、铁载体等，到现在的运用分子生物学手段，如转录组学、基因组学等方面的研究，但是细菌风化矿物的机制至今没有统一的结论。接下来对D. jiangningensis SBZ3-12的研究，就是要运用分子生物学以及生物信息学等手段对该菌株进行进一步的分析，比如各个功能基因的确定，在此之前，需要全基因组测序，也就是需要对该菌株进行基因组DNA的大量提取，满足测序需要。
本实验目的就在于采用不同的DNA提取方法，通过检测菌株的纯度、DNA纯度、浓度、得率、片段完整性以及比较耗费的时间、经济成本探寻最优的基因组DNA提取方法，从而提取出符合测序要求的基因组 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
DNA，在此基础上为相类似的实验提供可循的参考及建议。
2 材料与方法
2.1材料
2.1.1 菌体制备
取1-2 g湿菌体（3-10个平板或者接瓶培养）于40 mL螺口离心管中，备用。
2.1.2 试剂
1×TE溶液，溶菌酶，20% SDS，蛋白酶K，苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），3 M NaAc，5M Kac，CTAB-NaCl溶液，异丙醇，70% 乙醇，RNA酶。
2.1.3 器材
水浴锅，高速冷冻离心机，细菌基因组DNA提取试剂盒，PCR仪，电泳仪等。
2.2方法
2.2.1提取方法1 试剂盒法提DNA
采用国内GENRAY公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）进行试验。取菌株 SBZ3-12培养的菌液1.5 mL，8000 rpm离心，1.5 mL TE重悬，加入3 mL Digestion Solution，混匀；加入40 μL RNase A混匀，55 ℃保温10 min，再加入40 μL Proteinase K，55 ℃保温30min。依次添加3 mL Ext Solution 以及3 mL PB Solution 充分摇匀，12000 rpm室温离心5min，取下层溶液，转移到套放于2 mL收集管内的GenClean柱中，8000 rpm室温离心1min。取下GenClean柱，弃去收集管中的废液，将GenClean柱放回收集管中，加入500 μL Wash Solution, 12000 rpm，室温离心1min，除去残留的Wash Solution。将GenClean柱放入新的洁净的1.5 mL离心管中，在GenClean柱中央加入预热到70 ℃（以提高洗脱效率）的100 μL Elution Buffer，室温放置2min。12000 rpm，室温离心1min，离心管中的液体基因组DNA。[2]
2.2.2提取方法2 酶解法提DNA
菌株 SBZ3-12培养的菌液50 mL，8000 rpm离心5min，收集菌体，在装有菌体的离心管中，加入含有溶菌酶的1×TE溶液约7 mL（使溶菌酶的终浓度为5 mg/mL），37 ℃保温2h，期间每15min翻转混匀一次；随后加入700 μL 20 % SDS，再加20 mg/mL蛋白酶K，至终浓度为2 mg/mL，充分混匀，37 ℃保温40min，期间每10min左右翻转一次。随后用苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）溶液多次抽提[4]，每次充分混匀，12000 rpm低温离心10 min，直至蛋白被抽提干净为止，最后用氯仿：异戊醇（24:1）抽提。加1/10体积的3 mol/L NaAc溶液，混合后加等体积的异丙醇，小心上下搅动混匀，使DNA形成可见的絮状沉淀；用洁净玻璃棒搅出DNA，用5 mL70% 乙醇洗2次，室温干燥后溶于1×TE溶液中（视DNA的量而定）[8]。在溶有DNA的1×TE溶液中加高温处理过的RNA酶至终浓度为100 μg/mL，37 ℃保温30 min；苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）溶液抽提3次左右[9]，每次充分摇匀，12000 rpm低温离心10min，加等体积的异丙醇，1/10倍体积的3 M NaAc，小心上下混匀；用洁净玻璃棒搅出 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
DNA，用7 mL 70% 乙醇清洗两次，室温下干燥，溶于超纯水中（至DNA溶解为止）。
2.2.3提取方法3 改进的水煮法
在装有菌体的40 mL螺口离心管中加入约1×TE溶液约7 mL，混匀，随后放入100 ℃的水浴锅中，沸水浴约8 min，12000 rpm离心10 min，取上清液，再加1 mL 20% SDS溶液，混匀，65 ℃热水浴中放置30min，期间每十分钟左右颠倒混匀一次[1]。然后加入约5 mL 5 M的KAc，混匀，冰浴约5 min，12000 rpm低温离心10 min，取上清液即为所需DNA溶液，加等体积的异丙醇，1/10倍体积的3 M NaAc，小心上下混匀[4]；用洁净玻璃棒搅出DNA，用7 mL 70% 乙醇清洗两次，室温下干燥，溶于超纯水中（至DNA溶解为止）。
2.2.4提取方法4改进的酶解法
方法基本与第二种方法相同，先在装有菌体的离心管中，加入含有溶菌酶的1×TE溶液约7 mL（使溶菌酶的终浓度为5 mg/mL），37 ℃保温2 h，期间每15 min翻转混匀一次；随后加入700 μL 20% SDS，再加20 mg/mL蛋白酶K，至终浓度为2 mg/mL，充分混匀，37 ℃保温40 min，期间每10 min左右翻转一次。在这一步时，先不抽提蛋白，而是加入1/6倍体积的5 M Nacl和1/6倍体积的CTAB-Nacl Solution，（CTAB-Nacl溶液：CTAB 10 mg/mL，Nacl 0.7 mol/l）[11]。在这之后就是酚：氯仿：异戊醇抽提，最后氯仿：异戊醇抽提，再加1/10倍体积的3M NaAc，等体积的异丙醇，小心上下混匀；用洁净玻璃棒搅出DNA，用7 mL 70% 乙醇清洗两次，室温下干燥，溶于超纯水中（至DNA溶解为止）。
2.3.3 16SrRNA 基因扩增
试剂盒法 DNA kit method 30.023 14.86 2.02 2.04 1501.15
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