地衣芽孢杆菌atcc14580发酵菊粉生产2,3丁二醇条件的优化
：2,3-丁二醇是一种非常重要的工业化合物，然而现今工业生产2,3-丁二醇的效率很低，为了获得高产率和高浓度的2,3-丁二醇，需要价廉、可再生的底物和适宜的发酵菌种，并采取高效的发酵方式进行发酵。菊粉是在很多植物中都能够发现的一种多分散的果聚糖，其生产作物菊芋的高产量和高抗逆性等优良性状吸引了人们的目光，同时地衣芽孢杆菌ATCC14580果聚糖酶的高菊粉酶活性，高pH耐受性，高耐温性也非常适用于2,3-丁二醇的工业化生产。分批补料式同步糖化发酵（SSF）能以3.4 g/L*h的高产率在30h内生产出103.0 g/L的 2,3-丁二醇。这个结果显示使用这种地衣芽孢杆菌的SSF进程可能是以菊粉这种良好底物高效生产2,3-丁二醇的有效选择之一。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract. 2
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 3
1．1 菌种 3
1．2 碳源利用效果比较和发酵条件优化 3
1．2．1 碳源利用效果比较 3
1．2．2 发酵温度优化 3
1．2．3 发酵pH优化 4
1．3 培养基灭菌方法 4
1．4 分析方法 4
1．4．1 糖度 4
1．4．2 pH 4
1．4．3 2,3BD 4
1．4．4 菌体浓度 4
2 结果与分析 4
2．1 菌种的选择 4
2．2 碳源利用效果比较和发酵条件优化 4
2．2．1 碳源利用效果比较 4
2．2．2 发酵温度优化 5
2．2．3 发酵pH优化 6
2．2．4 2,3BD的产量分析 6
3 讨论 7
致谢 8
参考文献： 8
地衣芽孢杆菌ATCC14580发酵菊粉生产2,3丁二醇条件的优化
引言
2,3丁二醇（2,3BD）可以作为一种传统的化合物——碳四烃的替代物，用于大规模的合成甲乙酮（优良溶剂）和1,3丁二烯（广泛应用于合成橡胶、聚酯和聚
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
亚胺酯等领域）[1]。除此之外，2,3丁二醇还可用于制备油墨、香水、熏蒸剂、增湿剂、软化剂、增塑剂、炸药及药物手性载体等，2,3BD的氧化产物3羟基丁酮和丁二酮可作为食用香料使用。作为液体燃料或燃料添加剂，27200 J/g的2,3BD相比于乙醇（29100 J/g）和甲醇（22100 J/g）也显得更为优异[2,19]。
2,3BD能通过化学或生物技术方法生产出来。目前化学方法生产2,3BD主要是由石油裂解时产生的四碳类碳氢化合物在高温高压下产生的。同生物法相比，化学法不仅成本高，而且过程繁琐，不易操作，所以一直很难实现大规模工业化生产，用生物法生产2,3BD不仅符合绿色化工的要求，还克服了化学法生产的困难，减少了对石油资源的依赖。近年来由于天然油类资源的逐渐枯竭，人们在用生物学方法生产2,3BD上的兴趣大大增加。如今，克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌和地衣芽孢杆菌被认为2,3BD最有效的生产者[36]。有研究表明以葡萄糖和蔗糖为底物在经济上是不可行的。由于原料价格超过了发酵产物总产值的30%，所以2,3BD的生产需要低成本的底物和高效的菌株[7]。虽然，从经济的角度上来看，价廉的原料如木质纤维素材料、玉米芯渣、玉米芯酸解液、淀粉水解液、乳清渗透液、甘蔗渣和木薯粉也能用于2,3BD的生产，但是，通过使用这些价廉原料获得的2,3BD的产率和浓度仍然很低。因此，为了获得高产率和高浓度的2,3BD，需要价廉、非食品、可再生的资源并且开发合适的发酵菌种。
果聚糖是淀粉之后在植物中发现的最丰富的非结构性多糖，并且在大多数种类的植物中能够发现。果聚糖是果糖单元通过(21)链联接而成并以葡萄糖单元终止的碳水化合物。这些果聚糖之一的菊粉是种主要由β(2,1)D果糖基果糖连接，蔗糖残基终止的多分散的果聚糖[8]。它在许多菊科和禾本科植物中作为一种储备性多糖，并且积聚在几种植物包括菊芋、菊苣和天竺牡丹的地下根和导管中[9]。这些植物中菊芋由于它的高产量（每公顷50吨）和它对温度和灾害的耐受性颇引人瞩目，它甚至能被种植在沙地和湿地中，栽培时只需要有限的人类干预，并且不与谷物类耕地竞争[24]。菊粉占据了菊芋高达85 %干重和菊苣根湿重的16 %。2014年菊粉在世界范围内的产量约为350000吨[11]。虽然它的总产量不能与木质纤维素的产量相比，但它能轻易超过淀粉[10]。因此，最近菊粉作为一种生产果糖和化合物如乙醇和乳酸的可再生资源受到了很多的关注。但是，以菊粉为底物生产2,3BD的研究还很少[1213]。
大多数已报道的菊粉酶和果聚糖酶在45 ℃55 ℃范围内具有最适温度[11]。然而，许多微生物，包括肺炎克雷伯氏菌，产酸克雷伯氏菌，粘质沙雷氏菌和多粘类芽孢杆菌，适宜在28 ℃ 37 ℃的温度范围内生产2,3BD[1,19]。这些嗜温菌的使用可能会增加菊粉发酵生产2,3BD所需菊粉酶或果聚糖酶的剂量[21]。因此，用嗜热菌株生产2,3BD可以减少酶的使用剂量。有研究报导，在嗜热地衣芽孢杆菌101A的50 ℃最佳温度下能生产2,3BD[6]。因而嗜热地衣芽孢在50 ℃的发酵条件下可能适合菊粉发酵生产2,3BD。本毕设以另一种嗜热地衣芽孢杆菌ATCC14580来进行菊粉发酵生产2,3BD。
1 材料与方法
1．1 菌种
本实验所用的地衣芽孢杆菌ATCC14580来自实验室保存菌种。地衣芽孢杆菌ATCC14580接种在LB平板上，平板在37 ℃培养，且完全长成的平板保存在4 ℃[22]。
种子培养基(g/L)：葡萄糖(20)，果糖(20)，酵母粉（YE，5.8），牛肉膏（10.0），醋酸钠（6.5），柠檬酸铵（1）,K2HPO4.3H20（2），MgSO4.7H2O（0.25），pH 7.0；细胞从一个完全长成的平板接种到含有30 mL上述培养基的250 mL锥形瓶中，并温育，在摇床上以 170 rpm的速率振荡且在37 ℃的条件下培养12小时。然后，将10 mL种子培养物接种到锥形瓶或生物反应器（总体积的5％）来生产2,3BD。
1．2 碳源利用效果比较和发酵条件优化
1．2．1 碳源利用效果比较
发酵培养基(g/L)：用于比较地衣芽孢杆菌ATCC14580以含果糖或者菊粉的培养基生产2,3BD的能力：果糖（80）/菊粉(80)，酵母粉（YE，5.8），玉米浸渍液（CSLP，14.8），醋酸钠（6.5），柠檬酸铵（1），K2HPO4.3H20（2），MgSO4.7H2O（0.25），pH 7.0。发酵是含有30 mL培养基的250 mL锥形瓶在摇床上以180 rpm的速率振荡且在50 ℃的条件下培养24小时。接种量10 mL，OD600 1.0。调起始pH7.0，2N NaOH。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract. 2
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 3
1．1 菌种 3
1．2 碳源利用效果比较和发酵条件优化 3
1．2．1 碳源利用效果比较 3
1．2．2 发酵温度优化 3
1．2．3 发酵pH优化 4
1．3 培养基灭菌方法 4
1．4 分析方法 4
1．4．1 糖度 4
1．4．2 pH 4
1．4．3 2,3BD 4
1．4．4 菌体浓度 4
2 结果与分析 4
2．1 菌种的选择 4
2．2 碳源利用效果比较和发酵条件优化 4
2．2．1 碳源利用效果比较 4
2．2．2 发酵温度优化 5
2．2．3 发酵pH优化 6
2．2．4 2,3BD的产量分析 6
3 讨论 7
致谢 8
参考文献： 8
地衣芽孢杆菌ATCC14580发酵菊粉生产2,3丁二醇条件的优化
引言
2,3丁二醇（2,3BD）可以作为一种传统的化合物——碳四烃的替代物，用于大规模的合成甲乙酮（优良溶剂）和1,3丁二烯（广泛应用于合成橡胶、聚酯和聚
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
亚胺酯等领域）[1]。除此之外，2,3丁二醇还可用于制备油墨、香水、熏蒸剂、增湿剂、软化剂、增塑剂、炸药及药物手性载体等，2,3BD的氧化产物3羟基丁酮和丁二酮可作为食用香料使用。作为液体燃料或燃料添加剂，27200 J/g的2,3BD相比于乙醇（29100 J/g）和甲醇（22100 J/g）也显得更为优异[2,19]。
2,3BD能通过化学或生物技术方法生产出来。目前化学方法生产2,3BD主要是由石油裂解时产生的四碳类碳氢化合物在高温高压下产生的。同生物法相比，化学法不仅成本高，而且过程繁琐，不易操作，所以一直很难实现大规模工业化生产，用生物法生产2,3BD不仅符合绿色化工的要求，还克服了化学法生产的困难，减少了对石油资源的依赖。近年来由于天然油类资源的逐渐枯竭，人们在用生物学方法生产2,3BD上的兴趣大大增加。如今，克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌和地衣芽孢杆菌被认为2,3BD最有效的生产者[36]。有研究表明以葡萄糖和蔗糖为底物在经济上是不可行的。由于原料价格超过了发酵产物总产值的30%，所以2,3BD的生产需要低成本的底物和高效的菌株[7]。虽然，从经济的角度上来看，价廉的原料如木质纤维素材料、玉米芯渣、玉米芯酸解液、淀粉水解液、乳清渗透液、甘蔗渣和木薯粉也能用于2,3BD的生产，但是，通过使用这些价廉原料获得的2,3BD的产率和浓度仍然很低。因此，为了获得高产率和高浓度的2,3BD，需要价廉、非食品、可再生的资源并且开发合适的发酵菌种。
果聚糖是淀粉之后在植物中发现的最丰富的非结构性多糖，并且在大多数种类的植物中能够发现。果聚糖是果糖单元通过(21)链联接而成并以葡萄糖单元终止的碳水化合物。这些果聚糖之一的菊粉是种主要由β(2,1)D果糖基果糖连接，蔗糖残基终止的多分散的果聚糖[8]。它在许多菊科和禾本科植物中作为一种储备性多糖，并且积聚在几种植物包括菊芋、菊苣和天竺牡丹的地下根和导管中[9]。这些植物中菊芋由于它的高产量（每公顷50吨）和它对温度和灾害的耐受性颇引人瞩目，它甚至能被种植在沙地和湿地中，栽培时只需要有限的人类干预，并且不与谷物类耕地竞争[24]。菊粉占据了菊芋高达85 %干重和菊苣根湿重的16 %。2014年菊粉在世界范围内的产量约为350000吨[11]。虽然它的总产量不能与木质纤维素的产量相比，但它能轻易超过淀粉[10]。因此，最近菊粉作为一种生产果糖和化合物如乙醇和乳酸的可再生资源受到了很多的关注。但是，以菊粉为底物生产2,3BD的研究还很少[1213]。
大多数已报道的菊粉酶和果聚糖酶在45 ℃55 ℃范围内具有最适温度[11]。然而，许多微生物，包括肺炎克雷伯氏菌，产酸克雷伯氏菌，粘质沙雷氏菌和多粘类芽孢杆菌，适宜在28 ℃ 37 ℃的温度范围内生产2,3BD[1,19]。这些嗜温菌的使用可能会增加菊粉发酵生产2,3BD所需菊粉酶或果聚糖酶的剂量[21]。因此，用嗜热菌株生产2,3BD可以减少酶的使用剂量。有研究报导，在嗜热地衣芽孢杆菌101A的50 ℃最佳温度下能生产2,3BD[6]。因而嗜热地衣芽孢在50 ℃的发酵条件下可能适合菊粉发酵生产2,3BD。本毕设以另一种嗜热地衣芽孢杆菌ATCC14580来进行菊粉发酵生产2,3BD。
1 材料与方法
1．1 菌种
本实验所用的地衣芽孢杆菌ATCC14580来自实验室保存菌种。地衣芽孢杆菌ATCC14580接种在LB平板上，平板在37 ℃培养，且完全长成的平板保存在4 ℃[22]。
种子培养基(g/L)：葡萄糖(20)，果糖(20)，酵母粉（YE，5.8），牛肉膏（10.0），醋酸钠（6.5），柠檬酸铵（1）,K2HPO4.3H20（2），MgSO4.7H2O（0.25），pH 7.0；细胞从一个完全长成的平板接种到含有30 mL上述培养基的250 mL锥形瓶中，并温育，在摇床上以 170 rpm的速率振荡且在37 ℃的条件下培养12小时。然后，将10 mL种子培养物接种到锥形瓶或生物反应器（总体积的5％）来生产2,3BD。
1．2 碳源利用效果比较和发酵条件优化
1．2．1 碳源利用效果比较
发酵培养基(g/L)：用于比较地衣芽孢杆菌ATCC14580以含果糖或者菊粉的培养基生产2,3BD的能力：果糖（80）/菊粉(80)，酵母粉（YE，5.8），玉米浸渍液（CSLP，14.8），醋酸钠（6.5），柠檬酸铵（1），K2HPO4.3H20（2），MgSO4.7H2O（0.25），pH 7.0。发酵是含有30 mL培养基的250 mL锥形瓶在摇床上以180 rpm的速率振荡且在50 ℃的条件下培养24小时。接种量10 mL，OD600 1.0。调起始pH7.0，2N NaOH。
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