不同施肥方式对区域水稻土壤微生物类群的影响
：土壤微生物是维持土壤健康和保持土壤生态平衡的重要因素，也被作为衡量土壤质量的重要依据。本文探讨连续施加8年的无机氮肥和有机肥对常熟地区稻田的微生物群落的影响。结果表明有机肥或无机肥的单独施加时基本不会导致土壤重金属含量的积累。而有机肥和无机肥混合施用则导致土壤中镉的积累，但未超过国家制定的标准，而其他重金属元素和氮磷钾等大量元素在各种不同施肥方式的土壤中的含量变化不显著。此外，有机肥和无机肥的混合施加与单独施加有机肥和无机肥相比，能有效提高土壤中有机质、硝态氮和全氮的含量，但对不能提高土壤铵态氮、全钾和全磷含量。有机肥或无机肥的单独施加和混施均未导致土壤pH值和电导率的显著差异。我们通过利用Miseq技术进行核糖体16s和18s的高通量测序分析，分别检测细菌和真菌的群落多样性，结果显示土壤微生物的群落组成受环境影响复杂，不同的施肥方式对细菌微生物群落的丰度和多样性影响较小，对真菌微生物群落的影响较大。施加有机肥降低了真菌微生物群落的多样性，并且较大的改变了微生物群落的结构。关键字：土壤微生物、理化性质、重金属含量、Miseq测序The Effection of different fertilization on the microbial groups of paddy soil in Changshu areaStudent majoring in National Life Science and Technique Talent Training Base LiuJianyuTutor ChenChenAbstract: Soil microorganism is an important factor of maintaining soil health and the ecological balance, which is also used as an important basis for evaluating the soil quality. This paper examines the impact of?continuous application of?microbial communities in the 8?years of?inorganic fertilizer?and organic fertiliz
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
er on paddy fields in Changshu region. The results showed that organic?fertilizer or inorganic?fertilizer?applied alone?did not cause the?soil heavy metals?accumulation. while mixed application of organic and inorganic fertilizers resulted in the accumulation of cadmium in soil, but not exceeding the standards formulated by the state, and other heavy metal elements and other common elements, such as nitrogen, phosphorus and potassium element content changes in the soil of different modes of fertilization was not significant. In addition, a blend of organic fertilizer and inorganic fertilizer applied and individually applied organic fertilizer and inorganic fertilizer compared, can effectively improve the content of soil organic matter, nitrate nitrogen and total nitrogen, but not improve soil ammonium nitrogen, total potassium and total phosphorus content. Organic fertilizer or?inorganic fertilizer?applied alone?and mixed fertilization?did not?result in significant?differences in soil?pH value?and conductivity. Through analysis on of high-throughput sequencing of the ribosomal 16S and 18S using miseq technique, bacterial and fungal community diversity were detected.?Results show that the?composition?is influenced by the environment?of complex?soil microbial community, different fertilization on bacterial community abundance and diversity has little effect, whlie significantly affects on the microbial communities in fungi. Applying organic?fertilizer to reduce?fungal diversity of?microbial communities,?and?greatly?changed?the microbial community structure.粮食问题是我国建国以来一直密切关注的重点，提高粮食产量的研究也是一直备受研究者的青睐。在众多的措施中，施肥是提升农作物产量和土地肥力最直接、最有效的措施。从目前我国的国情来看，施肥对于提高产量的贡献率已经上升到50%以上[1]。现有的研究表明长期使用无机肥破坏了土壤的构造，存在土壤板结、土壤质量和土壤生产力下等一系列问题，而且会影响土壤众多的生物化学转化的过程[2]，使土壤生态系统遭受了一定程度的破坏，进而降低了肥料的利用率。虽然无机肥能短时间内大量提高作物所需的大量元素，但化肥也存在一些缺点，如营养单一、微量元素含量低等，更严重的是无机肥的大量使用还会使多余的N、P、K等大量元素，渗透至地下水，最终造成江河湖泊大量水体富营养化，间接造成环境污染。近些年，有机肥的出现在一定程度上缓解了目前的单一使用无机肥所带来的诟病。有机肥不仅有各种农作物生长发育所需的大量元素和多种微量元素，还具有多种对植物生长发育有帮助的有机质，如蛋白质、氨基酸、纤维素、半纤维素、脂肪等物质。有机肥可以为农作物提供生长所需的养分、维持土壤肥沃的肥力、更新土壤中沉淀的有机质、促进微生物大量繁殖、增强土壤的保水保肥能力和保护农业生态环境、促进生态农业的可持续发展等方面有着重要积极的作用[3]。此外，有机肥的来源十分广泛，其主要有五种来源：畜禽生活粪便、作物性残体、农产品加工后产生的废弃物、人类的生活污泥和生活垃圾。而另一方面，随着人们生活及生产水平的提高，各种有机废弃物、排泄物的量也逐年增长，这些却是有机肥的重要来源。可见，推广有机肥的大范围的使用，不仅能提高粮食产量同时保持土壤生态平衡，还有促进资源更再次利用的的特点。但近年来的研究表明，使用沼渣用于有机肥料存在一定的土壤重金属污染风险[4]。可能的原因是日常生活中的生活污泥和生活垃圾中含有有害的重金属污染物，从而导致此类的有机肥的来源存在很大的局限性。例如动物饲料中加入一些常见的重金属元素，如铜、锌等，从而导致家畜排泄物中对应的重金属含量升高，长期使用这样的有机肥可导致土壤中的可溶态重金属元素浓度升高，故存在一定的土壤重金属污染风险[5]。总的来说，有机肥不但给农作物生长提供多种营养元素和某些活性有机物，还可以通过某些作用将土壤中一些难以利用的养分元素活化，以提高农作物对土壤养分的利用，进而促进农作物的生长。有机肥在被施入土壤后，其养分释放较慢，存在不能及时为农作物提供充足营养物质的可能性，所以可以将有机肥和化肥配合施用，兼顾两者的双重优点，在减少化肥元素的流失的同时，还能是土壤保持稳定的提供氮元素的能力。一些研究表明，在较长时间内有机肥和化肥的合理配合使用，能够在提高农作物的产量的同时保持土壤的可持续生产力[6]。土壤微生物是推动土壤中各种复杂的新陈代谢反应进行的动力，在土壤生态系统中发挥着不可替代的作用。所以土壤肥力和土壤微生物生物多样性有着密切的关系，常被用于衡量土壤质量变化的相关指标之一[7]。土壤微生物群落的变化，对土壤中养分的循环转化，提高肥料利用率以及抵抗一些不良环境，维持土壤生态系统的稳定性有很大的影响。因此，土壤微生物的生物量和群落数是衡量土壤生态环境好坏的重要指标。研究表明，长期的化肥施用能降低该区域土壤的微生物总量，可能的原因是大量的化肥抑制了微生物的生长繁殖并且抑制了其生长代谢的活性[8]。其他的实验结果则指出，有机肥的施加不仅增加了土壤微生物生物量碳，氮，磷，还增加了土壤中真菌麦角固醇和CO2的含量[9]。同时，有机肥和化肥配合施用的施肥方式能明显的提高了稻田土壤微生物中N、C元素的含量[10]。其他研究者的研究表明在施用化肥之后施用有机肥可以明显增加土壤中微生物的种群数目和活性，同时土壤中微生物活性在一定程度上也会受到不同有机肥种类的影响；研究还发现在施用化肥后能一定程度提高根际间土壤生物量中碳和氮的含量[11]。所以从土壤微生物量和土壤微生物种群数的方面来看，研究有机肥和化肥的配合施加是十分有益的。有机无机肥的配合施用在一定程度上能有效的减少化肥的使用量，能在保证农作物产量的同时改善土壤结构，提高土壤持续肥力，从而提高土壤的可耕种性。土壤微生物是维持土壤健康和保持土壤生态平衡的重要因素，也被作为衡量土壤质量的重要依据。我们可以通过土壤微生物对于长期不同施肥方式的反应，初步得出高效、绿色、环保的施肥方式，进一步实现可持续发展。第二章·土壤重金属污染风险分析 近年来研究发现，使用沼渣作为有机肥的来源存在一定的重金属污染风险。生活垃圾与生活污泥含有难以降解的污染，病原菌，以及重金属污染物，使有机肥的来源收到了很大的局限性。本章主要探讨连续不同施肥处理下，每个处理组土壤重金属含量的测定。2.1材料与方法2.1.1土壤的采集和处理取江苏省常熟市有机肥试验地提前筛选好的各处理小区采集耕作层，深度为0-25 cm的土样。运用梅花形布点法（在地势平坦，土壤分布均匀的田块，取两条对角线上的样点），采集每个处理小区5个样点的土壤，混合均匀，四分法留取约1kg混合土样。土壤样品带回实验室后，自然风干并除去植物残体及碎石颗粒，在研体中磨细并用直径2 mm尼龙筛过滤，再用四分法取部分土样用玛瑙研钵进一步研磨，过0.15 mm尼龙筛，保存备用。2.1.2土壤金属元素和大量元素测定分析采用王水（VHCl:VHNO3=4:1）湿法消解，用ICP-OES（电感耦合等离子体发射光谱仪，可测定全部金属元素和部分非金属元素）测定Cu、Zn、Ni、As、Fe、Mn、Al、Ca、Mg、K和P的含量[12]，Cd、Cr和Pb元素则可以用ICP-MS（电感耦合等离子体质谱）进行测定分析。 在分析过程中设置空白对照并进行重复，并用国内土壤标准物质（GBW07403）作为进数据分析和实验质量控制[13]。2.2实验结果与分析2.2.1施加不同含氮水平的无机肥对稻田土壤重金属元素和大量元素含量的影响由表1可知实验中大部分土壤pH值都介于6.50~6.90之间。随着施氮量的增加，各个组重金属含量的数据变化量不显著，不与氮施加量形成正相关（表2），因此，有机肥和无机肥的单独施加或混合施加不会造成稻田土壤重金属元素的积累。由表3可知，施氮量的增加并不会导致各种大量元素的增加，故施加氮肥含量的不同以及施肥种类的不同均不会造成稻田土壤大量元素的变化。2.2.2施加不同剂量的有机肥对稻田土壤重金属元素和大量元素含量的影响由表4可知，随着有机肥的施加量的增加，大部分金属元素并没有呈上升趋势，仅在有机肥施用量在3000 kg·hm-2的区域（标为红色字体），土壤Co元素含量显著高于对照水平，可能的原因是此取样区的土壤本身就存在大量Co元素，导致土壤整体Co元素水平的上升，故有机肥施加量的增加一般来说不会造成金属元素的上升。由表5可知，随着有机肥含量的增加，土壤中的大量元素的含量与有机肥含氮量的相关性不显著，故施加不同剂量的有机肥不会引起稻田土壤大量的元素积累。2.2.3施加几种不同复合肥料对稻田土壤重金属元素和大量元素含量的影响 利用6个处理组和一个对照组进行实验，实验中的实验组土壤样品来源有：常熟有机无机复混肥1（OM≥20％）、常熟有机无机复混肥2（OM≥15％）、宜兴有机无机复混肥1（OM≥20％）、宜兴有机无机复混肥2（OM≥15％）、明珠有机无机复混肥1（OM≥20％）、明珠有机无机复混肥2（OM≥15％），其中OM表示Organic Manure， OM≥20%即为有机肥的含量≥20%。由表6可知，与对照组的数据相比，施加常熟有机无机复混肥1（OM≥20％）会引起土壤Cu元素含量的增加；施加宜兴有机无机复混肥2（OM≥15％）引起土壤中Zn元素的积累；施加宜兴有机无机复混肥1（OM≥20％）和宜兴有机无机复混肥2（OM≥15％）均能引起土壤Pb元素的积累；施加宜兴有机无机复混肥1（OM≥20％）引起土壤As元素的积累；施加宜兴有机无机复混肥1（OM≥20％）和宜兴有机无机复混肥2（OM≥15％）则均能引起土壤Mo元素的积累。引起以上结果的原因可能是混合肥中的有机肥来源受到一定的重金属污染，例如动物饲料中会添加一些Cu、Zn元素，对比实验数据可知，存在Cu、Zn元素积累的风险。尽管混合肥的施加有可能引起稻田土壤重金属的积累，但各种重金属元素的增加量仍低于国家限制标准（表1），说明施用这些肥料是相对安全的。由表7可知，有机肥和无机肥的混合使用能使土壤中的大量元素积累，如K、P元素，但积累量之间的差异性不显著，不足以对土壤生态环境影响产生重大影响。故混合肥的施加量与土壤的大量元素的积累存在一定的相关性，但相关性不显著。表1 中国几种重金属元素的土壤环境质量标准*（mg·kg-1） Table 1 Soil environment quality standard of several heavy metal elements in China（mg·kg-1） 项目 pH < 6.5 6.5～7.5 > 7.5 Cu 水作、旱作、蔬菜、柑桔等 ≤ 50 100 100 Pb 水作、旱地、果树等 ≤ 80 80 80 Cd 水作、旱地、果树等 ≤ 0.30 0.30 0.60 Cr 水作 ≤ 250 300 350 As 水作、蔬菜 ≤30 25 20 Zn ≤ 200 250 300 Ni ≤ 40 50 60 注：*摘自《食用农产品产地环境质量评价标准》（HJ332-2006）。 表2施加不同氮水平的无机肥对稻田土壤重金属元素含量（mg·kg-1 干重）的影响 Table 2 Heavy metal content (mg·kg-1 DW) in paddy soil after addition of Nitrogen fertilizer (NF) with different N content 氮水平 (kg·hm-2) Cu Zn Pb Cd Ni Cr As Co Mo 0 35.0±6.2a 119±19a 30.8±2.8a 0.402±0.123a 30.3±0.5a 57.6±3.7a 8.02±0.50ab 12.8±0.9ab 0.489±0.015a 180 33.6±4.3a 114±16a 25.5±1.9ab 0.414±0.110a 26.9±0.5c 43.5±1.8b 6.91±0.07bc 10.9±0.2c 0.383±0.047ab 240 30.6±3.4a 106±13a 25.4±3.1ab 0.367±0.102a 26.9±1.4c 42.3±3.9b 6.67±0.87c 11.0±0.6c 0.351±0.050b 270 34.6±2.5a 109±10a 22.2±2.8b 0.398±0.105a 28.7±0.7b 60.6±8.5a 8.67±0.45a 13.6±1.4a 0.414±0.093ab 300 33.3±4.1a 113±15a 28.8±2.8a 0.360±0.124a 29.6±0.7ab 54.2±3.1a 8.29±0.95a 11.9±0.3bc 0.416±0.059ab 注: “ ±”后数值为标准差，同列数值后不同字母表示LSD检验在0.05 水平差异显著。 Note: The "±" followed with the standard error and values with the various letters in a column indicate significant difference at 0.05 level by LSD test. The same as follows. 表 3施加不同氮水平的无机肥对稻田土壤大量元素含量（g·kg-1 干重）的影响Table 3 Major element content (g·kg-1 DW) in paddy soil after addition of Nitrogen fertilizer (NF) with different N content氮水平(kg·hm-2) Fe Al Ca Mg K P 0 31.9±1.0a 32.3±1.1a 9.04±0.68a 8.60±0.11a 4.94±0.19a 1.22±0.25a 180 28.2±0.8b 24.1±1.2c 8.13±1.12a 7.61±0.27b 2.66±0.19c 1.09±0.11a 240 28.7±0.5b 24.1±0.3c 7.31±0.35a 7.47±0.27b 2.50±0.02c 1.01±0.05a 270 30.9±0.9a 29.6±0.8b 8.68±1.26a 8.18±0.29a 3.65±0.34b 1.15±0.14a 300 31.1±0.8a 32.2±0.4a 8.64±0.72a 8.53±0.30a 4.82±0.07a 1.13±0.11a 表4 施加不同剂量有机肥对稻田土壤重金属元素含量（mg·kg-1 干重）的影响 Table 6 Heavy metal content (mg·kg-1 DW) in paddy soil after addition of Organic fertilizer (OF) with different amount. 有机肥施加 (kg·hm-2) Cu Zn Pb Cd Ni Cr As Co Mo Mn 0 35.0±6.2a 119±19a 30.8±2.8a 0.402±0.123a 30.3±0.5a 57.6±3.7a 8.02±0.50a 12.8±0.9b 0.489±0.015ab 389±31a 1500 38.2±3.7a 120±12a 25.0±1.6b 0.466±0.074a 30.4±1.1a 63.8±0.3a 8.55±0.66a 13.9±0.2ab 0.453±0.033ab 396±27a 3000 39.2±6.1a 133a ±34a 24.1±1.1b 0.463±0.084a 29.6±0.4ab 67.0±1.9a 8.35±0.42a 15.0±0.9a 0.556±0.064a 388±17a 3500 35.3±3.6a 120±17a 24.5±3.4b 0.420±0.090a 28.5±0.5b 59.5±10.6a 8.11±0.32a 13.0±0.8b 0.409±0.096b 385±33a 4500 37.0±2.6a 120±11a 22.4±1.0b 0.420±0.110a 29.1±0.5b 60.5±1.8a 8.59±1.20a 13.7±0.5ab 0.469±0.018ab 401±20 表5 施加不同剂量有机肥对稻田土壤大量元素含量（g·kg-1 干重）的影响 Table 3 Major element content (g·kg-1 DW) in paddy soil after addition of Organic fertilizer (OF) with different amount 有机肥施加量 (kg·hm-2) Fe Al Ca Mg K P 0 31.9±1.0a 32.3±1.1a 9.04±0.68a 8.60±0.11a 4.94±0.19a 1.22±0.25a 1500 32.0±1.4a 30.9±2.9ab 9.34±1.44a 8.81±0.31a 3.90±0.47b 1.08±0.02a 3000 32.2±1.9a 27.2±1.3b 9.70±1.16a 8.89±0.52a 2.69±0.10c 1.21±0.25a 3500 30.7±1.5a 28.1±1.7b 9.57±1.88a 8.57±0.64a 3.22±0.11c 1.17±0.06a 4500 31.5±0.7a 28.4±2.2b 10.0±1.0a 8.81±0.23a 3.16±0.58c 1.13±0.11a 表 6 施加不同肥料对稻田土壤重金属元素含量（mg·kg-1 干重）的影响 Table 4 Heavy metal content (mg·kg-1 DW) in paddy soil after addition of various fertilizers 肥料种类 Cu Zn Pb Cd Ni Cr As Co Mo Mn 未施氮肥 （对照） 31.0±0.1b 98.8±1.6b 21.3±0.9b 0.351±0.005ab 28.2±0.3ab 45.5±2.4ab 6.75±0.65b 11.4±0.1b 0.304±0.014c 317±6a 宜兴有机无机复混肥1 （OM≥20％） 31.6±1.9ab 102±5ab 27.7±6.3a 0.361±0.012ab 29.4±0.8a 46.7±1.0ab 8.25±0.30a 11.9±0.5ab 0.381±0.011ab 341±30a 宜兴有机无机复混肥2 （OM≥15％） 32.1±1.0ab 106±2a 28.8±4.9a 0.336±0.038b 29.6±0.6a 47.6±1.2a 7.27±0.34ab 11.9±0.4ab 0.414±0.039a 320±33a 常熟有机无机复混肥1 （OM≥20％） 33.9±1.2a 103±5ab 21.6±0.8b 0.384±0.023a 29.0±0.6ab 43.6±0.3bc 7.11±0.78ab 12.0±0.3ab 0.343±0.036bc 327±9a 常熟有机无机复混肥2 （OM≥15％） 31.8±2.3ab 97.4±4.1b 21.0±0.5b 0.361±0.009ab 27.9±1.5b 43.3±3.1bc 7.58±0.90ab 13.2±1.7a 0.354±0.019bc 322±19a 明珠有机无机复混肥1 （OM≥20％） 31.5±1.2ab 104±3ab 24.6±1.0ab 0.384±0.023a 29.5±0.5a 46.6±1.0ab 7.75±1.1ab 12.2±0.6ab 0.388±0.019ab 334±30a 明珠有机无机复混肥2 （OM≥15％） 30.6±1.3b 103±3ab 21.2±0. 5b 0.336±0.023b 28.2±0.8ab 41.7±1.3c 6.69±0.55b 11.4±0.9b 0.326±0.051c 296±29a 表 7 施加不同肥料对稻田土壤大量元素含量（g·kg-1 干重）的影响 Table 5 Major element content (g/kg DW) in paddy soil after ddition of various fertilizers 肥料种类 Fe Al Ca Mg K P 未施氮肥 （对照） 30.3±0.8a 27.4±0.6d 6.57±0.07a 7.62±0.11a 3.32±0.10c 1.07±0.04b 宜兴有机无机复混肥1 （OM≥20％） 30.9±1.0a 32.3±1.3ab 6.74±0.43a 7.75±0.20a 4.82±0.12a 1.21±0.12ab 宜兴有机无机复混肥2 （OM≥15％） 32.2±1.5a 33.9±1.2a 6.94±0.79a 8.04±0.42a 4.89±0.08a 1.17±0.07ab 常熟有机无机复混肥1 （OM≥20％） 31.3±0.2a 29.8±0.9bcd 6.85±0.43a 7.92±0.05a 3.56±0.28bc 1.08±0.04b 常熟有机无机复混肥2 （OM≥15％） 30.4±1.8a 29.8±2.7bcd 6.82±0.80a 7.64±0.58a 4.08±0.67abc 1.09±0.02b 明珠有机无机复混肥1 （OM≥20％） 32.1±1.7a 33.3±1.8a 7.19±1.03a 8.04±0.48a 4.74±0.26a 1.23±0.08a 明珠有机无机复混肥2 （OM≥15％） 30.5±1.5a 28.2±0.9cd 6.00±0.68a 7.64±0.45a 3.27±0.15c 1.23±0.06a 2.3结论 综上所述，单独施加无机肥不会引起土壤中重金属元素增加，也不会使稻田土壤大量元素积累；单独施加有机肥时，存在少量重金属元素积累的可能性，整体上有机肥的施加量与重金属积累的相关性不显著，不会造成重金属在土壤中的积累；有机肥和无机肥混合施用时，除土壤中Cd元素存在积累的风险外，土壤中其他重金属元素基本不存在积累现象。第三章·中长期施肥对土壤营养状况的影响 土壤是农作物营养物质的最主要来源。土壤营养状况的好坏不仅关系到地上农作物的生长发育，也对土壤微生物的代谢繁殖有着深远的影响。有机肥有作物生长发育的大量元素和微量元素，同时又含有多种有机质，能为作物生长提供充足营养。本章通过对比单独施加氮肥和有机肥和无机肥配合施用后所测试的有机质含量、铵态氮、硝态氮、氮钾磷元素的含量和pH值、土壤电导率等各项指标，来初读推断土壤营养状况变化的差异。3.1材料与方法各处理土样对照(CK)：未施氮肥； 化肥(CF1)：氮总量为180kg·hm-2 ； 化肥(CF2)：氮总量为240kg·hm-2 ； 化肥(CF4)：氮总量为300kg·hm-2 ； 有机无机肥料配施(OMCF1-1)： 氮总量为180kg·hm-2；化肥＋有机肥1500kg·hm-2； 有机无机肥料配施(OMCF1-2)： 氮总量为180kg·hm-2；化肥＋有机肥3000kg·hm-2；有机无机肥料配施(OMCF1-4)： 氮总量为180kg·hm-2；化肥＋有机肥4500kg·hm-2；有机无机肥料配施(OMCF2-1)： 氮总量为240kg·hm-2；化肥＋有机肥1500kg·hm-2；有机无机肥料配施(OMCF2-2)： 氮总量为240kg·hm-2；化肥＋有机肥3000kg·hm-2；有机无机肥料配施(OMCF2-4)： 氮总量为240kg·hm-2；化肥＋有机肥4500kg·hm-2；有机无机肥料配施(OMCF4-1)： 氮总量为300kg·hm-2；化肥＋有机肥1500kg·hm-2；有机无机肥料配施(OMCF4-2)： 氮总量为300kg·hm-2；化肥＋有机肥3000kg·hm-2；有机无机肥料配施(OMCF4-4)： 氮总量为300kg·hm-2；化肥＋有机肥4500kg·hm-2。3.1.1土壤有机质含量的测定 土壤有机质是指土壤中所有含碳元素的物质，包括所有动、植物残体，微生物及其分解和合成的所有有机物质，包括生命体和非生命体，是土壤必不可少的部分[14]。测定时用葡萄糖配制5g/L的有机碳标准溶液，再用此标准溶液配制成含碳量为0、1.25、2.5、3.75、5、6.25、7.5mg的标准工作溶液，并绘制对应的碳元素标准曲线，计算标准回归方程。取上述不同的风干土样0.2g，过2mm筛，采用重铬酸钾-浓硫酸加热法（稀释热法），利用浓硫酸和重络酸钾混合时产生的热逐步氧化土壤有机质中的碳，通过用分光光度计测定氧化后剩余铬的含量来计算有机质的量，其中测定的数据为样品上清液在559nm波长下的吸收值[15]。由图1可知，与对照相比，不同氮水平的无机肥单独施加和无机肥与有机肥混合施加均能显著提高了稻田土壤中有机质含量。另一方面，化肥处理组随着化肥含氮量的增加而出现同步递增的趋势，可能的原因是氮元素的增加，加强了土壤微生物的代谢，导致有机质增加。有机肥和无机肥混合施加对土壤有机质的变化的相关性不显著，可能原因是不同的混合肥有机肥的比例不同，不同的有机肥有机质的比例也不同。3.1.2土壤铵态氮、硝态氮以及总氮测定将各个土壤样品过20目筛，进一步筛选，再通过2mol/L的KCl 溶液抽提土壤中的铵态氮与硝态氮，具体是将吸附在土壤表面上和溶于水中的NH+4，即NH+4被K+取代下来[16]，溶液配比时Vsolution:Msoil=5:1，然后通过连续流动分析仪测定土壤中铵态氮与硝态氮的含量[17]。将各个样品风干并过100目筛，通过浓硫酸-高氯酸消煮法消解样品，使大部分含氮化合物转变成铵态氮，最后用ICP测定土壤总氮的含量[18]。由图2可知，与对照组实验相比，不同氮水平的无机肥单独施加以及无机肥与有机肥混合施加与使稻田土壤中的铵态氮含量相关性不显著，各个实验组铵态氮的含量也不存在显著相关性。可能原因是土壤样品采集后存放时间过久，实验前没有进行密封处理，导致土壤中铵态氮氧化分解；也有可能水稻田中N肥主要铵态氮形式是而被水稻大量吸收，所以铵态氮含量并没有显著上升。由图3可知，与对照组实验相比，不同氮水平的无机肥单独施加以及无机肥与有机肥混合施加一定程度上提高了土壤中硝态氮的含量，但硝态氮上升的量并不是十分明显；当无机肥单独施加量为300kg/hm2时土壤中硝态氮的含量显著提高了；当氮肥总量在300kg/hm2 时，土壤中硝态氮含量随着肥料中有机肥的含量上升而增加。由图4可知，与对照相比，不同氮水平的无机肥单独施加以及无机肥与有机肥混合施加能有效增加稻田土壤中的全氮含量；在氮水平相同时，同时增加有机肥的施加量不能显著提高土壤全氮含量，可能的原因是土壤中总氮达到了饱和状态，或者有机肥的氮元素含量出现饱和状态，所以没有随着有机肥的施加量而出现规律性的增长。3.1.3土壤全钾含量的测定 处理各个样品时，先用硝酸和高氯酸加热氧化，使土壤中的矿物质转变为可溶性的钾离子，再对其含量进行测定。由图5可知，与对照相比，不同氮水平的无机肥单独施加及无机肥与有机肥混合施加对稻田土壤全钾含量的相关性不显著。可能的原因是K元素易溶于水，各个采样点土壤中水分的流动可能不尽相同，导致每个采样点钾元素的流失量也存在差异，故使测定的数据产生差异。3.1.4土壤全磷含量的测定 总磷量的测定，第一步也是讲土壤中所有磷元素转变车可溶性磷，一般使用高氯酸-浓硫酸的消煮方法氧化，在进行测定含量的实验[19]。 由图6可知，与对照相比，不同氮水平的无机肥单独施加及无机肥与有机肥混合施加对稻田土壤中全磷含量的增加无显著影响。但在施氮水平为240kg/hm2和300 kg/hm2，随着有机肥比例的增加，稻田土壤中磷元素的总量也出现上升的趋势。3.1.5土壤pH测定 pH值是土壤自身十分重要的理化性质之一，也是影响土壤肥力的重要因素之一。测定pH值时，先将各个土壤样品过2mm筛，再用0.01 mol/L的CaCl2溶液浸提，使Ca+与土壤表面吸附的H+发生取代[20]，从而使溶液中H+完全释放出来，然后进行测定土壤pH值，其中Vsolution:Msoil=5:1。由图7可知，不同氮水平的无机肥单独施加及无机肥与有机肥混合施加与对照相比，各个实验组的pH值的变化随机性大，增减不一，相关性不显著故对稻田土壤pH值的增大或减小无显著的影响。3.1.6土壤电导率测定将各个组土样后并过20目筛，按水土比为5:1的方法浸提，过滤取上清液用DDS-12A型电导仪测定土壤电导率[21]。由图8可知，与对照组相比，在单独施加无机肥时，肥料的含氮量与土壤的导电率呈正相关关系,即土壤电导率随着肥料含氮量的增加而增加。在无机肥与有机肥的混合施加的情况下，施加的有机肥会在一定程度上降低土壤电导率，可能的原因是有机质的增加使可溶性盐的比例减少，从而导致电导率的下降。但在有机肥的施加量的比例增大时，电导率减少就不再明显。3.2结果分析 综合以上结果，与单独施加无机肥相比，无机肥与有机肥混合施加能有效提高稻田土壤有机质含量，也提高稻田土壤硝态氮和全氮含量；对提高土壤铵态氮、全钾和全磷的含量变化的相关性不显著。同时，混合施肥对土壤pH值和土壤电导率的变化无显著影响，但在有机肥比例处于一定范围之上的时候，能增加土壤的电导率。第四章·土壤微生物多样性检测和信息分析 土壤微生物是土壤生态环境中不可或缺的分解者，对土壤生态系统的物质循环有着十分重要的作用，是土壤质量的灵敏指标。本章通过Miseq技术进行核糖体16s和18s的高通量测序分析，分别检测细菌和真菌的群落多样性，初步得出有机肥和无机肥混合施加后两大微生物种群的变化。4.1材料与方法材料：对照(CK)：未施氮肥； 无机化肥(CF)：氮总量为300kg·hm-2 有机无机肥料配施(OMCF)：氮总量300kg·hm-2 化肥＋有机肥4500kg·hm-2 ；取样时，每个处理选择两个实验小区，取3个采样点，采样地点应避开边行以及头尾。每个采样点采集16个点，并取深度为0-15cm的土样，混合均匀。然后将混合的土样过<2 mm筛，目的是去除植物残渣和小石子，随后储存于-80度冰箱，预备MiSeq高通量测序。 4.1.1MiSeq测序实验流程 从土壤中提取DNA，设计并合成引物接头，PCR扩增DNA并纯化PCR产物，定量PCR产物并使其均一化，制备MiSeq PE文库，进行MiSeq高通量测序。MiSeq测序后，首先得到PE reads，根据overlap关系进行拼接并控制序列质量，区分样品后进行OUT分类，基于OUT可以进行多种多样性指数分析。4.1.2测序类型以及引物的选择细菌的16sRNA分子，约为1540bp大小，这段序列既拥有高度保守的序列又有中度保持和高度变化的序列区域，是用于测序辨别微生物物种的优质序列。这段序列的恒定区域基本保守，可用于设计引物，将16sRNA扩增后，通过高通量，可得到可变区序列的差异，进而鉴别微生物不同的种属。真菌ITS是真菌核糖体RNA基因非转录区的一部分。ITS 片段在真菌的进化过程中所受的自然选择压力很小，因此会常常发生变异，并保留下来。即使当两个物种亲缘关系十分接近时均能在ITS 序列上产生差异，能显示出最新的进化特征。表 7不同引物Table 7?different primers测序类型引物名称引物序列细菌16SDNA真菌ITS 27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTAG-3’338R1737F2043R5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’5’-GCTGCTTCATCGTTCTTCATCG-3’4.1.3生物多样性指数 生物多样性的测定一般分为三个重要的尺度，分别是α多样性、β多样性和γ多样性[22]。其中α多样性主用于区域内均匀生态环境下的物种多样性，即普通群落内的物种多样性指标，后文也是α多样性作为单样本多样性分析的依据。菌群丰度即为群落内物种数目的多少，在不同群落中物种丰度是不同的。微生物一般用菌群丰度表示。用于表示菌群丰度(Community Richness)的指数有Chao和Ace指数，其中Chao算法是利用chao1算法估计群落中OUT的指数，在生态学中常用chao1指数估计一个群落的物种总数。有Chao（1984）第一个提出。Ace指数也用来估计群体中OUT数目的指数并也是由Chao提出，同样运用于生态学的研究。Chao:Schao1=Sobs+ 其中Schao1=实际观察的OUT的数，n1=只有一条序列OTU 的数量，n2=有两条序列OTU 的数量。Ace与chao1算法有所不同：Shannon-Wiener指数和Simpson指数都是反映群落物种多样性(Community diversity)的指数之一[23]，也常用于反映α多样性。 Simpson指数： Shannon-Wiener指数：式中：Ni——第i个种的个体数目，N——群落中所有种的个体总数。区别在于Simpson指数比Shannon-Wiener指数对群落内物种均匀度更加敏感，即Simpson指数主要反映物种在群落的均匀分布情况；Shannon-Wiener指数则对群落内物种的丰富度更为敏感，即Shannon-Wiener指数反映丰富度。故Simpson指数越大，群落多样性越低；Shannon-Wiener指数越大，群落多样性越高[24]。Coverage指文库中的样品序列的覆盖率，如果Coverage的越大，则表明样品中序列的没有被测出的机率越小。即Coverage指数反映的是这个测序结果能否真正能代表样本的真实数据。C=1－n1=只有一条序列OTU 的数量，N=抽样的全部序列数量OTU（Operational Taxonomic Units，运算分类单位）是在系统发生学或群体遗传学研究中，出于分析研究方便的原因，特意给某一个分类单元（分组、品系、属、种等）设置相同的标记位点。在生物信息学的研究过程中，通常来说，测序结果得到的没一条序列都来自一个菌株。故要了解一个提取的样本测序结果中的菌种、菌属等有用的数目信息，就需要对大量序列数据进行归类操作。在进行归类操作后，我们可将互相相似的序列分归为许多不同小组，每一个小组就是一个OTU。可根据实验的要求设定相似度（96%、97%和98%），本实验中指定的相似度为97%，进而可以对所有样品序列进行OUT分类并进行生物信息学的分析。4.2细菌16s分析结果表8 细菌多样性指数表Table 8 The bacterial diversity?index tableSample IDReads0.97AceChaoCoverageShannonSimpsonOTU1_13215342241(2194,2299)2257(2196,2337)0.9813326.58(6.56,6.6)0.0037(0.0035,0.0038)19832_21230262308(2261,2365)2307(2249,2382)0.9828456.58(6.56,6.6)0.0044(0.0042,0.0046)20502_9272422281(2244,2327)2306(2254,2374)0.9875196.63(6.61,6.65)0.0035(0.0033,0.0036)20933_15171932224(2171,2289)2204(2142,2284)0.9748156.58(6.56,6.61)0.0041(0.0039,0.0043)19184_5156652172(2113,2242)2167(2096,2258)0.9710826.59(6.56,6.61)0.0036(0.0034,0.0038)18346_1265742290(2256,2334)2304(2258,2364)0.9881096.77(6.75,6.78)0.0028(0.0026,0.0029)2122其中，Sample ID：样品名称；分别属于对照组、施无机肥组和施混合肥组。对照组：1_13、6_1；无机肥：2_21、4_5；混合肥：2_9、3_15。Reads：被分为所有OUT中的总优化序列数。Ace, Chao, Coverage, Shannon, Simpson分别代表各个指数。0.97：整体相似水平为0.97。由表8可知，各处理间细菌菌落多样性较为一致，故混合施肥对土壤细菌群落多样性并无影响。可能的原因是土壤微生物群落多样性受环境影响复杂，各种因素的相互作用导致细菌的多样性变化不明显。 Shannon-Wiener曲线是反映样本中微生物多样性的指数，利用各样本的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的微生物信息。使用软件：使用97%相似度的OTU，利用mothur计算不同随机抽样下的shannon值，利用R语言工具制作曲线图。由图6可知，各不同施肥处理曲线均趋向平坦，说明各个处理组测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的细菌微生物信息。Venn 图可用于统计多个样本中所共有和独有的OTU 数目，可以比较直观的表现环境样本的OTU 数目组成相似性及重叠情况。通常情况下，分析时选用相似水平为97%的OTU 样本表。并运用R语言工具统计和作图。由图10 可知，细菌各处理间OTU数目的组成相似性较高，有两千多个OUT一致，此外少量OTU是各处理所独有。 Rank-abundance 曲线可用来解释多样性的两个方面，即物种丰度和物种均匀度。在水平方向，物种的丰度由曲线的宽度来反映，物种的丰度越高，曲线在横轴上的范围越大；曲线的形状（平滑程度）反映了样本中物种的均度，曲线越平缓，物种分布越均匀。由图11可知，各处理的细菌物种丰富度均较高，但物种分布太均匀。 PCA 分析(Principal Component Analysis)，即主成分分析，是一种对数据进行简化分析的技术，这种方法可以有效的找出数据中最“主要”的元素和结构，去除噪音和冗余，将原有的复杂数据降维，揭示隐藏在复杂数据背后的简单结构。其优点是简单且无参数限制。通过分析不同样本OTU（97%相似性）组成可以反映样本间的差异和距离，PCA 运用方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴取能够最大反映方差值的两个特征值。如样本组成越相似，反映在PCA 图中的距离越近。不同环境间的样本可能表现出分散和聚集的分布情况，PCA 结果中对样本差异性解释度最高的两个或三个成分可以用于对假设因素进行验证。由图12可知，细菌各处理间未有显著聚类，处理内重复间的差异较大。多样本相似度分析，利用树枝结构描述和比较多个样本间的相似性和差异关系。首先使用描述群落组成关系和结构的算法计算样本间的距离，即根据beta 多样性距离矩阵进行层次聚类（Hierarchical cluatering）分析，使用非加权组平均法UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean）算法构建树状结构，得到树状关系形式用于可视化分析。利用树枝结构描述和比较多个样本间的相似性和差异关系。同样揭示了处理内重复间的差异较大，反映了土壤环境的复杂性，受多因素的控制。 群落结构组分图I，使用统计学的分析方法，观测样本在不同分类水平上的群落结构。将多个样本的群落结构分析放在一起对比时，还可以观测其变化情况。由图14 可知，在结果中包含了两个信息：样本中含有何种微生物；样本中各微生物的序列数，即各微生物的相对丰度。Proteobacteria变形菌门的微生物量最多，其次是chloroflexi绿弯菌门和acidobacteria酸杆菌门以及actinobacteria放线菌门，占了总细菌微生物的80%。但是不同的施肥处理间未有显著规律呈现。各处理组细菌群落的相对丰度在不同的施肥处理间未有显著规律呈现。群落Heatmap图可以用颜色变化来反映二维矩阵或表格中的数据信息，它可以直观地将数据值的大小以定义的颜色深浅表示出来。常根据需要将数据进行物种或样本间丰度相似性聚类，将聚类后数据表示在heatmap 图上，可将高丰度和低丰度的物种分块聚集，通过颜色梯度及相似程度来反映多个样本在各分类水平上群落组成的相似性和差异性。 软件及算法：R 语言vegan 包，vegdist 和hclust 进行距离计算和聚类分析。距离算法：Bray-Curtis，聚类方法：complete。图中颜色梯度可自定为两种或两种以上颜色渐变色。由以上结果可知，有机肥无机肥混合施加的施肥方式与单独施加有机肥或无机肥相比对细菌群落的丰度和多样性影响较小，细菌原有的群落并没有发生很大的变化。4.3真菌ITS MiSeq分析结果表9 真菌多样性指数表Table 9 Fungal diversity?indexSample IDReads0.97OTUAceChaoShannonSimpsonCoverage1_1336534216240(229,262)232(223,254)2.99(2.97,3)0.0903(0.0889,0.0916)0.9990422_2136230231244(237,259)243(236,263)3.13(3.12,3.15)0.0838(0,0824,0.0853)0.9992822_923172219250(236,276)269(242,328)2.9(2.88,2.93)0.1196(0.1172,0.1221)0.9981443_1531308195245(224,282)239(217,284)2.68(2.66,2.7)0.1374(0.1349,0.1399)0.9984034_536908226240(233,256)242(232,267)3.1(3.03,3.11)0.0967(0.0948,0.0986)0.9992686_129472198222(210,245)228(211,245)3.21(3.2,3.23)0.0729(0.0714,0.0745)0.998812其中，Sample ID：样品名称；分别属于对照组、施无机肥组和施混合肥组。对照组：1_13、6_1；无机肥：2_21、4_5；混合肥：2_9、3_15。Reads：被分为所有OUT中的总优化序列数。Ace, Chao, Coverage, Shannon, Simpson分别代表各个指数。0.97：整体相似水平为0.97。由表9可知，各处理间真菌菌落多样性有一定的差异，无机肥处理的群落多样性差异大，其次是对照组和有机肥处理组。表面施加有机肥与真菌群落的多样性呈一定程度的负相关性，可能的原因是对照处理内不同重复间的差异也较大。Shannon-Wiener曲线分析由图16可知，各不同施肥处理曲线均趋向平坦，表明测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的真菌微生物信息。Venn 图分析在Venn 图中，不同的颜色代表不同的样本。重叠区域表示这两个样本均有序列被划入相同的OTU中。由图17可知，真菌个处理间独有OTU较多。Rank-abundance 曲线分析由图18可知，不同施肥处理下的真菌群落各物种分布不均匀。 但物种的丰度较高。PCA 分析多样本相似度分析由图20 可知，该树枝结构可以分成不施有机肥和施有机肥两组。施加有机肥处理组(2_9,3_15)与其余各处理组之间的样本在图上呈现的是完全分离的叉枝，能说明了施加有机肥导致真菌群落组成发生较大的差别。 群落结构组分图I由图19可知样本中各微生物的序列数，即各真菌的相对丰度。Ascomycota子囊菌门的数量最多，其次是basidiomycota担子菌门、zygomycota接合菌门以及chytridiomycota壶菌门。各微生物的相对丰度在不同的施肥处理间未有显著规律呈现。群落Heatmap分析由图21可知，有机肥和无机肥混合施加对真菌生物群落的影响较大，降低了真菌微生物群落的多样性，并且较大的改变了微生物群落的结构。第五章· 讨论5.1实验中的总结土在土壤重金属含量检测中，我们得出的结果是在单独施加有机肥或者化肥时，重金属含量上升是非常少的，当有机无机肥混合施加时，出现了多组土壤重金属元素升高，主要引起Cu、Zn、Pb、As和Mo元素的增加，但增加后的数据低于可国家限制标准（表1），肥料的安全性还是可靠的。可能的原因是有机肥的来源受到了重金属的污染[25]，例如家畜禽的饲料中添加了一些重金属元素(Cu、Zn、Mn、Co、Se等)，其目的是使禽畜更好的吸收饲料，提高其利用率，所以会造成禽畜排泄物也含有一定量的重金属，而家畜禽排泄物是有机肥的重要来源之一，故会造成有机肥中含有一定量的重金属[26]，还有可能是被重金属污染的淤泥，如水质重金属超标的塘里的淤泥，可能被用作有机肥。故控制好有机肥的来源很关键。在土壤营养状况的实验中，数据表明，土壤有机质含量、硝态氮和全氮含量均呈上升趋势，有机无机肥混合的施用土壤中铵态氮、全钾和全磷的含量并无显著正相关性。观察可知铵态氮、全钾和全磷均为可溶性物质，故可能的原因是这些物质随着雨水流失了，而常熟地区是多雨性气候，且土壤来源稻田，这些物质随雨水流失的可能性很大[27]。实验中还发现单独施加无机肥时，施氮量与土壤电导率呈正相关关系，因为无机肥主要是大量可溶性的NO3-、SO42-和Cl-离子，所以施入土壤后能增加电导率[28]。从实验结果图来看，在无机肥与有机肥的混合施加时，在一定程度上会增大土壤电导率，和大多数已有的实验结果相符合[29]，是因为有机肥中存在大量的N元素，在土壤微生物的代谢过程中形成硝酸盐，故会增加其导电率[30]。其中电导率增加的幅度也不一样，增加量的不同可能反映了有机肥来源的不同。通过三个实验表明，有机肥和无机肥的复合施加不仅能增加土壤中营养物质的含量，能为植物提供充足的营养，还能改变土壤微生物的多样性。5.2混合施肥的重要性及未来的发展随着我们经济水平的提升，农业、养殖业和化工业的规模越来越大，随着而来的副产品，如禽畜粪便、污泥和生活垃圾也越来越多，若这些废弃物没有得到合理的处理，则造成环境污染，同时也会影响人类生活中的卫生健康。假如通过目前普遍的堆肥技术，将这些废弃物发酵后制成生物有机肥料，不仅能缓解当前的环境问题，还可以投入农业生产进行再次利用，从而建立良好的生态循环体系，与我国可持续发展的理念相符合。另一方面，未来提高产量，传统化肥的大框使用，已经造成了十分严重的环境问题，直接的影响就是土地肥力的下降，这也就间接导致了农产品产量和质量的下降。有机肥和无机肥的搭配混合施用在很大程度上减少了化肥的使用量，既能保证农作物拥有很好的生长物质可供提供，还能通过其大量的有机质有效的改善土壤内环境，提供土壤保持肥力的能力，从而间接地提升了地力。未来复合施肥可以继续改进的地方主要有以下几点。一、控制有机肥的来源。由于有机肥的来源不同，使一些有机肥存在重金属污染的可能性，从而间接的污染环境，可以通过控制动物饲料品质，减少使用存在重金属污染的地区的污泥等措施加以缓解。二、可通过分子生物技术改造工程菌，在堆肥时，可以利用这些工程菌进一步发酵有机肥，使有机肥的有机质更为丰富。若中国广阔的乡村地区都推广有机无机混合施肥的方法，大量的农业副产品的处理问题可以得到很好的解决，一方面有机肥的使用，减少了化肥的使用，也就间接的减少了耕地成本，另一方面，有机肥使用大大减少了在使用这些农副产品时对环境的污染，是生态农业循环中必不可少的重要环节，实现了环境友好，国家可持续发展的战略目标之一。致谢在实验室日常工作期间，陆敏师兄和张佳楠师姐给予了我很大的帮助和关心，为实验的完成也是尽心尽力，在此向他们表达我的感激之情。另外也感谢我的家人，他们的理解、鼓励和支持伴我顺利完成毕业设计和论文。参考文献：[1]李华栋. 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目录
摘要1
关键字1
Abstract1
Key words2
第一章引言3
第二章土壤重金属污染风险5
2.1材料与方法5
2.1.1土壤的采集和处理5
2.1.2土壤金属元素和大量元素测定分析5
2.2实验结果与分析5
2.2.1施加不同含氮水平的无机肥对稻田土壤重金属元素和大量元素含量的影响5
2.2.2施加不同剂量的有机肥对稻田土壤重金属元素和大量元素含量的影响5
2.2.3施加几种不同复合肥料对稻田土壤重金属元素和大量元素含量的影响5
2.3结论8
第三章中长期施肥对土壤营养状况的影响9
3.1材料与方法9
3.1.1土壤有机质含量的测定9
3.1.2土壤铵态氮、硝态氮以及总氮测定10
3.1.3土壤全钾含量的测定11
3.1.4土壤全磷含量的测定11
3.1.5土壤pH测定12
3.1.6土壤电导率测定12
3.2结果分析12
第四章土壤微生物多样性检测和分析13
4.1材料与方法13
4.1.1MiSeq测序实验流程13
4.1.2测序类型以及引物的选择13
4.1.3生物多样性指数13
4.2细菌16s MiSeq分析结果14
4.3真菌ITS分析结果20
第五章讨论25
5.1实验中的总结25
5.2混合施肥的重要性及未来的发展25
致谢26
参考文献26
不同施肥方式对常熟区域稻田土壤微生物类群的影响
引言
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
er on paddy fields in Changshu region. The results showed that organic?fertilizer or inorganic?fertilizer?applied alone?did not cause the?soil heavy metals?accumulation. while mixed application of organic and inorganic fertilizers resulted in the accumulation of cadmium in soil, but not exceeding the standards formulated by the state, and other heavy metal elements and other common elements, such as nitrogen, phosphorus and potassium element content changes in the soil of different modes of fertilization was not significant. In addition, a blend of organic fertilizer and inorganic fertilizer applied and individually applied organic fertilizer and inorganic fertilizer compared, can effectively improve the content of soil organic matter, nitrate nitrogen and total nitrogen, but not improve soil ammonium nitrogen, total potassium and total phosphorus content. Organic fertilizer or?inorganic fertilizer?applied alone?and mixed fertilization?did not?result in significant?differences in soil?pH value?and conductivity. Through analysis on of high-throughput sequencing of the ribosomal 16S and 18S using miseq technique, bacterial and fungal community diversity were detected.?Results show that the?composition?is influenced by the environment?of complex?soil microbial community, different fertilization on bacterial community abundance and diversity has little effect, whlie significantly affects on the microbial communities in fungi. Applying organic?fertilizer to reduce?fungal diversity of?microbial communities,?and?greatly?changed?the microbial community structure.粮食问题是我国建国以来一直密切关注的重点，提高粮食产量的研究也是一直备受研究者的青睐。在众多的措施中，施肥是提升农作物产量和土地肥力最直接、最有效的措施。从目前我国的国情来看，施肥对于提高产量的贡献率已经上升到50%以上[1]。现有的研究表明长期使用无机肥破坏了土壤的构造，存在土壤板结、土壤质量和土壤生产力下等一系列问题，而且会影响土壤众多的生物化学转化的过程[2]，使土壤生态系统遭受了一定程度的破坏，进而降低了肥料的利用率。虽然无机肥能短时间内大量提高作物所需的大量元素，但化肥也存在一些缺点，如营养单一、微量元素含量低等，更严重的是无机肥的大量使用还会使多余的N、P、K等大量元素，渗透至地下水，最终造成江河湖泊大量水体富营养化，间接造成环境污染。近些年，有机肥的出现在一定程度上缓解了目前的单一使用无机肥所带来的诟病。有机肥不仅有各种农作物生长发育所需的大量元素和多种微量元素，还具有多种对植物生长发育有帮助的有机质，如蛋白质、氨基酸、纤维素、半纤维素、脂肪等物质。有机肥可以为农作物提供生长所需的养分、维持土壤肥沃的肥力、更新土壤中沉淀的有机质、促进微生物大量繁殖、增强土壤的保水保肥能力和保护农业生态环境、促进生态农业的可持续发展等方面有着重要积极的作用[3]。此外，有机肥的来源十分广泛，其主要有五种来源：畜禽生活粪便、作物性残体、农产品加工后产生的废弃物、人类的生活污泥和生活垃圾。而另一方面，随着人们生活及生产水平的提高，各种有机废弃物、排泄物的量也逐年增长，这些却是有机肥的重要来源。可见，推广有机肥的大范围的使用，不仅能提高粮食产量同时保持土壤生态平衡，还有促进资源更再次利用的的特点。但近年来的研究表明，使用沼渣用于有机肥料存在一定的土壤重金属污染风险[4]。可能的原因是日常生活中的生活污泥和生活垃圾中含有有害的重金属污染物，从而导致此类的有机肥的来源存在很大的局限性。例如动物饲料中加入一些常见的重金属元素，如铜、锌等，从而导致家畜排泄物中对应的重金属含量升高，长期使用这样的有机肥可导致土壤中的可溶态重金属元素浓度升高，故存在一定的土壤重金属污染风险[5]。总的来说，有机肥不但给农作物生长提供多种营养元素和某些活性有机物，还可以通过某些作用将土壤中一些难以利用的养分元素活化，以提高农作物对土壤养分的利用，进而促进农作物的生长。有机肥在被施入土壤后，其养分释放较慢，存在不能及时为农作物提供充足营养物质的可能性，所以可以将有机肥和化肥配合施用，兼顾两者的双重优点，在减少化肥元素的流失的同时，还能是土壤保持稳定的提供氮元素的能力。一些研究表明，在较长时间内有机肥和化肥的合理配合使用，能够在提高农作物的产量的同时保持土壤的可持续生产力[6]。土壤微生物是推动土壤中各种复杂的新陈代谢反应进行的动力，在土壤生态系统中发挥着不可替代的作用。所以土壤肥力和土壤微生物生物多样性有着密切的关系，常被用于衡量土壤质量变化的相关指标之一[7]。土壤微生物群落的变化，对土壤中养分的循环转化，提高肥料利用率以及抵抗一些不良环境，维持土壤生态系统的稳定性有很大的影响。因此，土壤微生物的生物量和群落数是衡量土壤生态环境好坏的重要指标。研究表明，长期的化肥施用能降低该区域土壤的微生物总量，可能的原因是大量的化肥抑制了微生物的生长繁殖并且抑制了其生长代谢的活性[8]。其他的实验结果则指出，有机肥的施加不仅增加了土壤微生物生物量碳，氮，磷，还增加了土壤中真菌麦角固醇和CO2的含量[9]。同时，有机肥和化肥配合施用的施肥方式能明显的提高了稻田土壤微生物中N、C元素的含量[10]。其他研究者的研究表明在施用化肥之后施用有机肥可以明显增加土壤中微生物的种群数目和活性，同时土壤中微生物活性在一定程度上也会受到不同有机肥种类的影响；研究还发现在施用化肥后能一定程度提高根际间土壤生物量中碳和氮的含量[11]。所以从土壤微生物量和土壤微生物种群数的方面来看，研究有机肥和化肥的配合施加是十分有益的。有机无机肥的配合施用在一定程度上能有效的减少化肥的使用量，能在保证农作物产量的同时改善土壤结构，提高土壤持续肥力，从而提高土壤的可耕种性。土壤微生物是维持土壤健康和保持土壤生态平衡的重要因素，也被作为衡量土壤质量的重要依据。我们可以通过土壤微生物对于长期不同施肥方式的反应，初步得出高效、绿色、环保的施肥方式，进一步实现可持续发展。第二章·土壤重金属污染风险分析 近年来研究发现，使用沼渣作为有机肥的来源存在一定的重金属污染风险。生活垃圾与生活污泥含有难以降解的污染，病原菌，以及重金属污染物，使有机肥的来源收到了很大的局限性。本章主要探讨连续不同施肥处理下，每个处理组土壤重金属含量的测定。2.1材料与方法2.1.1土壤的采集和处理取江苏省常熟市有机肥试验地提前筛选好的各处理小区采集耕作层，深度为0-25 cm的土样。运用梅花形布点法（在地势平坦，土壤分布均匀的田块，取两条对角线上的样点），采集每个处理小区5个样点的土壤，混合均匀，四分法留取约1kg混合土样。土壤样品带回实验室后，自然风干并除去植物残体及碎石颗粒，在研体中磨细并用直径2 mm尼龙筛过滤，再用四分法取部分土样用玛瑙研钵进一步研磨，过0.15 mm尼龙筛，保存备用。2.1.2土壤金属元素和大量元素测定分析采用王水（VHCl:VHNO3=4:1）湿法消解，用ICP-OES（电感耦合等离子体发射光谱仪，可测定全部金属元素和部分非金属元素）测定Cu、Zn、Ni、As、Fe、Mn、Al、Ca、Mg、K和P的含量[12]，Cd、Cr和Pb元素则可以用ICP-MS（电感耦合等离子体质谱）进行测定分析。 在分析过程中设置空白对照并进行重复，并用国内土壤标准物质（GBW07403）作为进数据分析和实验质量控制[13]。2.2实验结果与分析2.2.1施加不同含氮水平的无机肥对稻田土壤重金属元素和大量元素含量的影响由表1可知实验中大部分土壤pH值都介于6.50~6.90之间。随着施氮量的增加，各个组重金属含量的数据变化量不显著，不与氮施加量形成正相关（表2），因此，有机肥和无机肥的单独施加或混合施加不会造成稻田土壤重金属元素的积累。由表3可知，施氮量的增加并不会导致各种大量元素的增加，故施加氮肥含量的不同以及施肥种类的不同均不会造成稻田土壤大量元素的变化。2.2.2施加不同剂量的有机肥对稻田土壤重金属元素和大量元素含量的影响由表4可知，随着有机肥的施加量的增加，大部分金属元素并没有呈上升趋势，仅在有机肥施用量在3000 kg·hm-2的区域（标为红色字体），土壤Co元素含量显著高于对照水平，可能的原因是此取样区的土壤本身就存在大量Co元素，导致土壤整体Co元素水平的上升，故有机肥施加量的增加一般来说不会造成金属元素的上升。由表5可知，随着有机肥含量的增加，土壤中的大量元素的含量与有机肥含氮量的相关性不显著，故施加不同剂量的有机肥不会引起稻田土壤大量的元素积累。2.2.3施加几种不同复合肥料对稻田土壤重金属元素和大量元素含量的影响 利用6个处理组和一个对照组进行实验，实验中的实验组土壤样品来源有：常熟有机无机复混肥1（OM≥20％）、常熟有机无机复混肥2（OM≥15％）、宜兴有机无机复混肥1（OM≥20％）、宜兴有机无机复混肥2（OM≥15％）、明珠有机无机复混肥1（OM≥20％）、明珠有机无机复混肥2（OM≥15％），其中OM表示Organic Manure， OM≥20%即为有机肥的含量≥20%。由表6可知，与对照组的数据相比，施加常熟有机无机复混肥1（OM≥20％）会引起土壤Cu元素含量的增加；施加宜兴有机无机复混肥2（OM≥15％）引起土壤中Zn元素的积累；施加宜兴有机无机复混肥1（OM≥20％）和宜兴有机无机复混肥2（OM≥15％）均能引起土壤Pb元素的积累；施加宜兴有机无机复混肥1（OM≥20％）引起土壤As元素的积累；施加宜兴有机无机复混肥1（OM≥20％）和宜兴有机无机复混肥2（OM≥15％）则均能引起土壤Mo元素的积累。引起以上结果的原因可能是混合肥中的有机肥来源受到一定的重金属污染，例如动物饲料中会添加一些Cu、Zn元素，对比实验数据可知，存在Cu、Zn元素积累的风险。尽管混合肥的施加有可能引起稻田土壤重金属的积累，但各种重金属元素的增加量仍低于国家限制标准（表1），说明施用这些肥料是相对安全的。由表7可知，有机肥和无机肥的混合使用能使土壤中的大量元素积累，如K、P元素，但积累量之间的差异性不显著，不足以对土壤生态环境影响产生重大影响。故混合肥的施加量与土壤的大量元素的积累存在一定的相关性，但相关性不显著。表1 中国几种重金属元素的土壤环境质量标准*（mg·kg-1） Table 1 Soil environment quality standard of several heavy metal elements in China（mg·kg-1） 项目 pH < 6.5 6.5～7.5 > 7.5 Cu 水作、旱作、蔬菜、柑桔等 ≤ 50 100 100 Pb 水作、旱地、果树等 ≤ 80 80 80 Cd 水作、旱地、果树等 ≤ 0.30 0.30 0.60 Cr 水作 ≤ 250 300 350 As 水作、蔬菜 ≤30 25 20 Zn ≤ 200 250 300 Ni ≤ 40 50 60 注：*摘自《食用农产品产地环境质量评价标准》（HJ332-2006）。 表2施加不同氮水平的无机肥对稻田土壤重金属元素含量（mg·kg-1 干重）的影响 Table 2 Heavy metal content (mg·kg-1 DW) in paddy soil after addition of Nitrogen fertilizer (NF) with different N content 氮水平 (kg·hm-2) Cu Zn Pb Cd Ni Cr As Co Mo 0 35.0±6.2a 119±19a 30.8±2.8a 0.402±0.123a 30.3±0.5a 57.6±3.7a 8.02±0.50ab 12.8±0.9ab 0.489±0.015a 180 33.6±4.3a 114±16a 25.5±1.9ab 0.414±0.110a 26.9±0.5c 43.5±1.8b 6.91±0.07bc 10.9±0.2c 0.383±0.047ab 240 30.6±3.4a 106±13a 25.4±3.1ab 0.367±0.102a 26.9±1.4c 42.3±3.9b 6.67±0.87c 11.0±0.6c 0.351±0.050b 270 34.6±2.5a 109±10a 22.2±2.8b 0.398±0.105a 28.7±0.7b 60.6±8.5a 8.67±0.45a 13.6±1.4a 0.414±0.093ab 300 33.3±4.1a 113±15a 28.8±2.8a 0.360±0.124a 29.6±0.7ab 54.2±3.1a 8.29±0.95a 11.9±0.3bc 0.416±0.059ab 注: “ ±”后数值为标准差，同列数值后不同字母表示LSD检验在0.05 水平差异显著。 Note: The "±" followed with the standard error and values with the various letters in a column indicate significant difference at 0.05 level by LSD test. The same as follows. 表 3施加不同氮水平的无机肥对稻田土壤大量元素含量（g·kg-1 干重）的影响Table 3 Major element content (g·kg-1 DW) in paddy soil after addition of Nitrogen fertilizer (NF) with different N content氮水平(kg·hm-2) Fe Al Ca Mg K P 0 31.9±1.0a 32.3±1.1a 9.04±0.68a 8.60±0.11a 4.94±0.19a 1.22±0.25a 180 28.2±0.8b 24.1±1.2c 8.13±1.12a 7.61±0.27b 2.66±0.19c 1.09±0.11a 240 28.7±0.5b 24.1±0.3c 7.31±0.35a 7.47±0.27b 2.50±0.02c 1.01±0.05a 270 30.9±0.9a 29.6±0.8b 8.68±1.26a 8.18±0.29a 3.65±0.34b 1.15±0.14a 300 31.1±0.8a 32.2±0.4a 8.64±0.72a 8.53±0.30a 4.82±0.07a 1.13±0.11a 表4 施加不同剂量有机肥对稻田土壤重金属元素含量（mg·kg-1 干重）的影响 Table 6 Heavy metal content (mg·kg-1 DW) in paddy soil after addition of Organic fertilizer (OF) with different amount. 有机肥施加 (kg·hm-2) Cu Zn Pb Cd Ni Cr As Co Mo Mn 0 35.0±6.2a 119±19a 30.8±2.8a 0.402±0.123a 30.3±0.5a 57.6±3.7a 8.02±0.50a 12.8±0.9b 0.489±0.015ab 389±31a 1500 38.2±3.7a 120±12a 25.0±1.6b 0.466±0.074a 30.4±1.1a 63.8±0.3a 8.55±0.66a 13.9±0.2ab 0.453±0.033ab 396±27a 3000 39.2±6.1a 133a ±34a 24.1±1.1b 0.463±0.084a 29.6±0.4ab 67.0±1.9a 8.35±0.42a 15.0±0.9a 0.556±0.064a 388±17a 3500 35.3±3.6a 120±17a 24.5±3.4b 0.420±0.090a 28.5±0.5b 59.5±10.6a 8.11±0.32a 13.0±0.8b 0.409±0.096b 385±33a 4500 37.0±2.6a 120±11a 22.4±1.0b 0.420±0.110a 29.1±0.5b 60.5±1.8a 8.59±1.20a 13.7±0.5ab 0.469±0.018ab 401±20 表5 施加不同剂量有机肥对稻田土壤大量元素含量（g·kg-1 干重）的影响 Table 3 Major element content (g·kg-1 DW) in paddy soil after addition of Organic fertilizer (OF) with different amount 有机肥施加量 (kg·hm-2) Fe Al Ca Mg K P 0 31.9±1.0a 32.3±1.1a 9.04±0.68a 8.60±0.11a 4.94±0.19a 1.22±0.25a 1500 32.0±1.4a 30.9±2.9ab 9.34±1.44a 8.81±0.31a 3.90±0.47b 1.08±0.02a 3000 32.2±1.9a 27.2±1.3b 9.70±1.16a 8.89±0.52a 2.69±0.10c 1.21±0.25a 3500 30.7±1.5a 28.1±1.7b 9.57±1.88a 8.57±0.64a 3.22±0.11c 1.17±0.06a 4500 31.5±0.7a 28.4±2.2b 10.0±1.0a 8.81±0.23a 3.16±0.58c 1.13±0.11a 表 6 施加不同肥料对稻田土壤重金属元素含量（mg·kg-1 干重）的影响 Table 4 Heavy metal content (mg·kg-1 DW) in paddy soil after addition of various fertilizers 肥料种类 Cu Zn Pb Cd Ni Cr As Co Mo Mn 未施氮肥 （对照） 31.0±0.1b 98.8±1.6b 21.3±0.9b 0.351±0.005ab 28.2±0.3ab 45.5±2.4ab 6.75±0.65b 11.4±0.1b 0.304±0.014c 317±6a 宜兴有机无机复混肥1 （OM≥20％） 31.6±1.9ab 102±5ab 27.7±6.3a 0.361±0.012ab 29.4±0.8a 46.7±1.0ab 8.25±0.30a 11.9±0.5ab 0.381±0.011ab 341±30a 宜兴有机无机复混肥2 （OM≥15％） 32.1±1.0ab 106±2a 28.8±4.9a 0.336±0.038b 29.6±0.6a 47.6±1.2a 7.27±0.34ab 11.9±0.4ab 0.414±0.039a 320±33a 常熟有机无机复混肥1 （OM≥20％） 33.9±1.2a 103±5ab 21.6±0.8b 0.384±0.023a 29.0±0.6ab 43.6±0.3bc 7.11±0.78ab 12.0±0.3ab 0.343±0.036bc 327±9a 常熟有机无机复混肥2 （OM≥15％） 31.8±2.3ab 97.4±4.1b 21.0±0.5b 0.361±0.009ab 27.9±1.5b 43.3±3.1bc 7.58±0.90ab 13.2±1.7a 0.354±0.019bc 322±19a 明珠有机无机复混肥1 （OM≥20％） 31.5±1.2ab 104±3ab 24.6±1.0ab 0.384±0.023a 29.5±0.5a 46.6±1.0ab 7.75±1.1ab 12.2±0.6ab 0.388±0.019ab 334±30a 明珠有机无机复混肥2 （OM≥15％） 30.6±1.3b 103±3ab 21.2±0. 5b 0.336±0.023b 28.2±0.8ab 41.7±1.3c 6.69±0.55b 11.4±0.9b 0.326±0.051c 296±29a 表 7 施加不同肥料对稻田土壤大量元素含量（g·kg-1 干重）的影响 Table 5 Major element content (g/kg DW) in paddy soil after ddition of various fertilizers 肥料种类 Fe Al Ca Mg K P 未施氮肥 （对照） 30.3±0.8a 27.4±0.6d 6.57±0.07a 7.62±0.11a 3.32±0.10c 1.07±0.04b 宜兴有机无机复混肥1 （OM≥20％） 30.9±1.0a 32.3±1.3ab 6.74±0.43a 7.75±0.20a 4.82±0.12a 1.21±0.12ab 宜兴有机无机复混肥2 （OM≥15％） 32.2±1.5a 33.9±1.2a 6.94±0.79a 8.04±0.42a 4.89±0.08a 1.17±0.07ab 常熟有机无机复混肥1 （OM≥20％） 31.3±0.2a 29.8±0.9bcd 6.85±0.43a 7.92±0.05a 3.56±0.28bc 1.08±0.04b 常熟有机无机复混肥2 （OM≥15％） 30.4±1.8a 29.8±2.7bcd 6.82±0.80a 7.64±0.58a 4.08±0.67abc 1.09±0.02b 明珠有机无机复混肥1 （OM≥20％） 32.1±1.7a 33.3±1.8a 7.19±1.03a 8.04±0.48a 4.74±0.26a 1.23±0.08a 明珠有机无机复混肥2 （OM≥15％） 30.5±1.5a 28.2±0.9cd 6.00±0.68a 7.64±0.45a 3.27±0.15c 1.23±0.06a 2.3结论 综上所述，单独施加无机肥不会引起土壤中重金属元素增加，也不会使稻田土壤大量元素积累；单独施加有机肥时，存在少量重金属元素积累的可能性，整体上有机肥的施加量与重金属积累的相关性不显著，不会造成重金属在土壤中的积累；有机肥和无机肥混合施用时，除土壤中Cd元素存在积累的风险外，土壤中其他重金属元素基本不存在积累现象。第三章·中长期施肥对土壤营养状况的影响 土壤是农作物营养物质的最主要来源。土壤营养状况的好坏不仅关系到地上农作物的生长发育，也对土壤微生物的代谢繁殖有着深远的影响。有机肥有作物生长发育的大量元素和微量元素，同时又含有多种有机质，能为作物生长提供充足营养。本章通过对比单独施加氮肥和有机肥和无机肥配合施用后所测试的有机质含量、铵态氮、硝态氮、氮钾磷元素的含量和pH值、土壤电导率等各项指标，来初读推断土壤营养状况变化的差异。3.1材料与方法各处理土样对照(CK)：未施氮肥； 化肥(CF1)：氮总量为180kg·hm-2 ； 化肥(CF2)：氮总量为240kg·hm-2 ； 化肥(CF4)：氮总量为300kg·hm-2 ； 有机无机肥料配施(OMCF1-1)： 氮总量为180kg·hm-2；化肥＋有机肥1500kg·hm-2； 有机无机肥料配施(OMCF1-2)： 氮总量为180kg·hm-2；化肥＋有机肥3000kg·hm-2；有机无机肥料配施(OMCF1-4)： 氮总量为180kg·hm-2；化肥＋有机肥4500kg·hm-2；有机无机肥料配施(OMCF2-1)： 氮总量为240kg·hm-2；化肥＋有机肥1500kg·hm-2；有机无机肥料配施(OMCF2-2)： 氮总量为240kg·hm-2；化肥＋有机肥3000kg·hm-2；有机无机肥料配施(OMCF2-4)： 氮总量为240kg·hm-2；化肥＋有机肥4500kg·hm-2；有机无机肥料配施(OMCF4-1)： 氮总量为300kg·hm-2；化肥＋有机肥1500kg·hm-2；有机无机肥料配施(OMCF4-2)： 氮总量为300kg·hm-2；化肥＋有机肥3000kg·hm-2；有机无机肥料配施(OMCF4-4)： 氮总量为300kg·hm-2；化肥＋有机肥4500kg·hm-2。3.1.1土壤有机质含量的测定 土壤有机质是指土壤中所有含碳元素的物质，包括所有动、植物残体，微生物及其分解和合成的所有有机物质，包括生命体和非生命体，是土壤必不可少的部分[14]。测定时用葡萄糖配制5g/L的有机碳标准溶液，再用此标准溶液配制成含碳量为0、1.25、2.5、3.75、5、6.25、7.5mg的标准工作溶液，并绘制对应的碳元素标准曲线，计算标准回归方程。取上述不同的风干土样0.2g，过2mm筛，采用重铬酸钾-浓硫酸加热法（稀释热法），利用浓硫酸和重络酸钾混合时产生的热逐步氧化土壤有机质中的碳，通过用分光光度计测定氧化后剩余铬的含量来计算有机质的量，其中测定的数据为样品上清液在559nm波长下的吸收值[15]。由图1可知，与对照相比，不同氮水平的无机肥单独施加和无机肥与有机肥混合施加均能显著提高了稻田土壤中有机质含量。另一方面，化肥处理组随着化肥含氮量的增加而出现同步递增的趋势，可能的原因是氮元素的增加，加强了土壤微生物的代谢，导致有机质增加。有机肥和无机肥混合施加对土壤有机质的变化的相关性不显著，可能原因是不同的混合肥有机肥的比例不同，不同的有机肥有机质的比例也不同。3.1.2土壤铵态氮、硝态氮以及总氮测定将各个土壤样品过20目筛，进一步筛选，再通过2mol/L的KCl 溶液抽提土壤中的铵态氮与硝态氮，具体是将吸附在土壤表面上和溶于水中的NH+4，即NH+4被K+取代下来[16]，溶液配比时Vsolution:Msoil=5:1，然后通过连续流动分析仪测定土壤中铵态氮与硝态氮的含量[17]。将各个样品风干并过100目筛，通过浓硫酸-高氯酸消煮法消解样品，使大部分含氮化合物转变成铵态氮，最后用ICP测定土壤总氮的含量[18]。由图2可知，与对照组实验相比，不同氮水平的无机肥单独施加以及无机肥与有机肥混合施加与使稻田土壤中的铵态氮含量相关性不显著，各个实验组铵态氮的含量也不存在显著相关性。可能原因是土壤样品采集后存放时间过久，实验前没有进行密封处理，导致土壤中铵态氮氧化分解；也有可能水稻田中N肥主要铵态氮形式是而被水稻大量吸收，所以铵态氮含量并没有显著上升。由图3可知，与对照组实验相比，不同氮水平的无机肥单独施加以及无机肥与有机肥混合施加一定程度上提高了土壤中硝态氮的含量，但硝态氮上升的量并不是十分明显；当无机肥单独施加量为300kg/hm2时土壤中硝态氮的含量显著提高了；当氮肥总量在300kg/hm2 时，土壤中硝态氮含量随着肥料中有机肥的含量上升而增加。由图4可知，与对照相比，不同氮水平的无机肥单独施加以及无机肥与有机肥混合施加能有效增加稻田土壤中的全氮含量；在氮水平相同时，同时增加有机肥的施加量不能显著提高土壤全氮含量，可能的原因是土壤中总氮达到了饱和状态，或者有机肥的氮元素含量出现饱和状态，所以没有随着有机肥的施加量而出现规律性的增长。3.1.3土壤全钾含量的测定 处理各个样品时，先用硝酸和高氯酸加热氧化，使土壤中的矿物质转变为可溶性的钾离子，再对其含量进行测定。由图5可知，与对照相比，不同氮水平的无机肥单独施加及无机肥与有机肥混合施加对稻田土壤全钾含量的相关性不显著。可能的原因是K元素易溶于水，各个采样点土壤中水分的流动可能不尽相同，导致每个采样点钾元素的流失量也存在差异，故使测定的数据产生差异。3.1.4土壤全磷含量的测定 总磷量的测定，第一步也是讲土壤中所有磷元素转变车可溶性磷，一般使用高氯酸-浓硫酸的消煮方法氧化，在进行测定含量的实验[19]。 由图6可知，与对照相比，不同氮水平的无机肥单独施加及无机肥与有机肥混合施加对稻田土壤中全磷含量的增加无显著影响。但在施氮水平为240kg/hm2和300 kg/hm2，随着有机肥比例的增加，稻田土壤中磷元素的总量也出现上升的趋势。3.1.5土壤pH测定 pH值是土壤自身十分重要的理化性质之一，也是影响土壤肥力的重要因素之一。测定pH值时，先将各个土壤样品过2mm筛，再用0.01 mol/L的CaCl2溶液浸提，使Ca+与土壤表面吸附的H+发生取代[20]，从而使溶液中H+完全释放出来，然后进行测定土壤pH值，其中Vsolution:Msoil=5:1。由图7可知，不同氮水平的无机肥单独施加及无机肥与有机肥混合施加与对照相比，各个实验组的pH值的变化随机性大，增减不一，相关性不显著故对稻田土壤pH值的增大或减小无显著的影响。3.1.6土壤电导率测定将各个组土样后并过20目筛，按水土比为5:1的方法浸提，过滤取上清液用DDS-12A型电导仪测定土壤电导率[21]。由图8可知，与对照组相比，在单独施加无机肥时，肥料的含氮量与土壤的导电率呈正相关关系,即土壤电导率随着肥料含氮量的增加而增加。在无机肥与有机肥的混合施加的情况下，施加的有机肥会在一定程度上降低土壤电导率，可能的原因是有机质的增加使可溶性盐的比例减少，从而导致电导率的下降。但在有机肥的施加量的比例增大时，电导率减少就不再明显。3.2结果分析 综合以上结果，与单独施加无机肥相比，无机肥与有机肥混合施加能有效提高稻田土壤有机质含量，也提高稻田土壤硝态氮和全氮含量；对提高土壤铵态氮、全钾和全磷的含量变化的相关性不显著。同时，混合施肥对土壤pH值和土壤电导率的变化无显著影响，但在有机肥比例处于一定范围之上的时候，能增加土壤的电导率。第四章·土壤微生物多样性检测和信息分析 土壤微生物是土壤生态环境中不可或缺的分解者，对土壤生态系统的物质循环有着十分重要的作用，是土壤质量的灵敏指标。本章通过Miseq技术进行核糖体16s和18s的高通量测序分析，分别检测细菌和真菌的群落多样性，初步得出有机肥和无机肥混合施加后两大微生物种群的变化。4.1材料与方法材料：对照(CK)：未施氮肥； 无机化肥(CF)：氮总量为300kg·hm-2 有机无机肥料配施(OMCF)：氮总量300kg·hm-2 化肥＋有机肥4500kg·hm-2 ；取样时，每个处理选择两个实验小区，取3个采样点，采样地点应避开边行以及头尾。每个采样点采集16个点，并取深度为0-15cm的土样，混合均匀。然后将混合的土样过<2 mm筛，目的是去除植物残渣和小石子，随后储存于-80度冰箱，预备MiSeq高通量测序。 4.1.1MiSeq测序实验流程 从土壤中提取DNA，设计并合成引物接头，PCR扩增DNA并纯化PCR产物，定量PCR产物并使其均一化，制备MiSeq PE文库，进行MiSeq高通量测序。MiSeq测序后，首先得到PE reads，根据overlap关系进行拼接并控制序列质量，区分样品后进行OUT分类，基于OUT可以进行多种多样性指数分析。4.1.2测序类型以及引物的选择细菌的16sRNA分子，约为1540bp大小，这段序列既拥有高度保守的序列又有中度保持和高度变化的序列区域，是用于测序辨别微生物物种的优质序列。这段序列的恒定区域基本保守，可用于设计引物，将16sRNA扩增后，通过高通量，可得到可变区序列的差异，进而鉴别微生物不同的种属。真菌ITS是真菌核糖体RNA基因非转录区的一部分。ITS 片段在真菌的进化过程中所受的自然选择压力很小，因此会常常发生变异，并保留下来。即使当两个物种亲缘关系十分接近时均能在ITS 序列上产生差异，能显示出最新的进化特征。表 7不同引物Table 7?different primers测序类型引物名称引物序列细菌16SDNA真菌ITS 27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTAG-3’338R1737F2043R5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’5’-GCTGCTTCATCGTTCTTCATCG-3’4.1.3生物多样性指数 生物多样性的测定一般分为三个重要的尺度，分别是α多样性、β多样性和γ多样性[22]。其中α多样性主用于区域内均匀生态环境下的物种多样性，即普通群落内的物种多样性指标，后文也是α多样性作为单样本多样性分析的依据。菌群丰度即为群落内物种数目的多少，在不同群落中物种丰度是不同的。微生物一般用菌群丰度表示。用于表示菌群丰度(Community Richness)的指数有Chao和Ace指数，其中Chao算法是利用chao1算法估计群落中OUT的指数，在生态学中常用chao1指数估计一个群落的物种总数。有Chao（1984）第一个提出。Ace指数也用来估计群体中OUT数目的指数并也是由Chao提出，同样运用于生态学的研究。Chao:Schao1=Sobs+ 其中Schao1=实际观察的OUT的数，n1=只有一条序列OTU 的数量，n2=有两条序列OTU 的数量。Ace与chao1算法有所不同：Shannon-Wiener指数和Simpson指数都是反映群落物种多样性(Community diversity)的指数之一[23]，也常用于反映α多样性。 Simpson指数： Shannon-Wiener指数：式中：Ni——第i个种的个体数目，N——群落中所有种的个体总数。区别在于Simpson指数比Shannon-Wiener指数对群落内物种均匀度更加敏感，即Simpson指数主要反映物种在群落的均匀分布情况；Shannon-Wiener指数则对群落内物种的丰富度更为敏感，即Shannon-Wiener指数反映丰富度。故Simpson指数越大，群落多样性越低；Shannon-Wiener指数越大，群落多样性越高[24]。Coverage指文库中的样品序列的覆盖率，如果Coverage的越大，则表明样品中序列的没有被测出的机率越小。即Coverage指数反映的是这个测序结果能否真正能代表样本的真实数据。C=1－n1=只有一条序列OTU 的数量，N=抽样的全部序列数量OTU（Operational Taxonomic Units，运算分类单位）是在系统发生学或群体遗传学研究中，出于分析研究方便的原因，特意给某一个分类单元（分组、品系、属、种等）设置相同的标记位点。在生物信息学的研究过程中，通常来说，测序结果得到的没一条序列都来自一个菌株。故要了解一个提取的样本测序结果中的菌种、菌属等有用的数目信息，就需要对大量序列数据进行归类操作。在进行归类操作后，我们可将互相相似的序列分归为许多不同小组，每一个小组就是一个OTU。可根据实验的要求设定相似度（96%、97%和98%），本实验中指定的相似度为97%，进而可以对所有样品序列进行OUT分类并进行生物信息学的分析。4.2细菌16s分析结果表8 细菌多样性指数表Table 8 The bacterial diversity?index tableSample IDReads0.97AceChaoCoverageShannonSimpsonOTU1_13215342241(2194,2299)2257(2196,2337)0.9813326.58(6.56,6.6)0.0037(0.0035,0.0038)19832_21230262308(2261,2365)2307(2249,2382)0.9828456.58(6.56,6.6)0.0044(0.0042,0.0046)20502_9272422281(2244,2327)2306(2254,2374)0.9875196.63(6.61,6.65)0.0035(0.0033,0.0036)20933_15171932224(2171,2289)2204(2142,2284)0.9748156.58(6.56,6.61)0.0041(0.0039,0.0043)19184_5156652172(2113,2242)2167(2096,2258)0.9710826.59(6.56,6.61)0.0036(0.0034,0.0038)18346_1265742290(2256,2334)2304(2258,2364)0.9881096.77(6.75,6.78)0.0028(0.0026,0.0029)2122其中，Sample ID：样品名称；分别属于对照组、施无机肥组和施混合肥组。对照组：1_13、6_1；无机肥：2_21、4_5；混合肥：2_9、3_15。Reads：被分为所有OUT中的总优化序列数。Ace, Chao, Coverage, Shannon, Simpson分别代表各个指数。0.97：整体相似水平为0.97。由表8可知，各处理间细菌菌落多样性较为一致，故混合施肥对土壤细菌群落多样性并无影响。可能的原因是土壤微生物群落多样性受环境影响复杂，各种因素的相互作用导致细菌的多样性变化不明显。 Shannon-Wiener曲线是反映样本中微生物多样性的指数，利用各样本的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的微生物信息。使用软件：使用97%相似度的OTU，利用mothur计算不同随机抽样下的shannon值，利用R语言工具制作曲线图。由图6可知，各不同施肥处理曲线均趋向平坦，说明各个处理组测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的细菌微生物信息。Venn 图可用于统计多个样本中所共有和独有的OTU 数目，可以比较直观的表现环境样本的OTU 数目组成相似性及重叠情况。通常情况下，分析时选用相似水平为97%的OTU 样本表。并运用R语言工具统计和作图。由图10 可知，细菌各处理间OTU数目的组成相似性较高，有两千多个OUT一致，此外少量OTU是各处理所独有。 Rank-abundance 曲线可用来解释多样性的两个方面，即物种丰度和物种均匀度。在水平方向，物种的丰度由曲线的宽度来反映，物种的丰度越高，曲线在横轴上的范围越大；曲线的形状（平滑程度）反映了样本中物种的均度，曲线越平缓，物种分布越均匀。由图11可知，各处理的细菌物种丰富度均较高，但物种分布太均匀。 PCA 分析(Principal Component Analysis)，即主成分分析，是一种对数据进行简化分析的技术，这种方法可以有效的找出数据中最“主要”的元素和结构，去除噪音和冗余，将原有的复杂数据降维，揭示隐藏在复杂数据背后的简单结构。其优点是简单且无参数限制。通过分析不同样本OTU（97%相似性）组成可以反映样本间的差异和距离，PCA 运用方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴取能够最大反映方差值的两个特征值。如样本组成越相似，反映在PCA 图中的距离越近。不同环境间的样本可能表现出分散和聚集的分布情况，PCA 结果中对样本差异性解释度最高的两个或三个成分可以用于对假设因素进行验证。由图12可知，细菌各处理间未有显著聚类，处理内重复间的差异较大。多样本相似度分析，利用树枝结构描述和比较多个样本间的相似性和差异关系。首先使用描述群落组成关系和结构的算法计算样本间的距离，即根据beta 多样性距离矩阵进行层次聚类（Hierarchical cluatering）分析，使用非加权组平均法UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean）算法构建树状结构，得到树状关系形式用于可视化分析。利用树枝结构描述和比较多个样本间的相似性和差异关系。同样揭示了处理内重复间的差异较大，反映了土壤环境的复杂性，受多因素的控制。 群落结构组分图I，使用统计学的分析方法，观测样本在不同分类水平上的群落结构。将多个样本的群落结构分析放在一起对比时，还可以观测其变化情况。由图14 可知，在结果中包含了两个信息：样本中含有何种微生物；样本中各微生物的序列数，即各微生物的相对丰度。Proteobacteria变形菌门的微生物量最多，其次是chloroflexi绿弯菌门和acidobacteria酸杆菌门以及actinobacteria放线菌门，占了总细菌微生物的80%。但是不同的施肥处理间未有显著规律呈现。各处理组细菌群落的相对丰度在不同的施肥处理间未有显著规律呈现。群落Heatmap图可以用颜色变化来反映二维矩阵或表格中的数据信息，它可以直观地将数据值的大小以定义的颜色深浅表示出来。常根据需要将数据进行物种或样本间丰度相似性聚类，将聚类后数据表示在heatmap 图上，可将高丰度和低丰度的物种分块聚集，通过颜色梯度及相似程度来反映多个样本在各分类水平上群落组成的相似性和差异性。 软件及算法：R 语言vegan 包，vegdist 和hclust 进行距离计算和聚类分析。距离算法：Bray-Curtis，聚类方法：complete。图中颜色梯度可自定为两种或两种以上颜色渐变色。由以上结果可知，有机肥无机肥混合施加的施肥方式与单独施加有机肥或无机肥相比对细菌群落的丰度和多样性影响较小，细菌原有的群落并没有发生很大的变化。4.3真菌ITS MiSeq分析结果表9 真菌多样性指数表Table 9 Fungal diversity?indexSample IDReads0.97OTUAceChaoShannonSimpsonCoverage1_1336534216240(229,262)232(223,254)2.99(2.97,3)0.0903(0.0889,0.0916)0.9990422_2136230231244(237,259)243(236,263)3.13(3.12,3.15)0.0838(0,0824,0.0853)0.9992822_923172219250(236,276)269(242,328)2.9(2.88,2.93)0.1196(0.1172,0.1221)0.9981443_1531308195245(224,282)239(217,284)2.68(2.66,2.7)0.1374(0.1349,0.1399)0.9984034_536908226240(233,256)242(232,267)3.1(3.03,3.11)0.0967(0.0948,0.0986)0.9992686_129472198222(210,245)228(211,245)3.21(3.2,3.23)0.0729(0.0714,0.0745)0.998812其中，Sample ID：样品名称；分别属于对照组、施无机肥组和施混合肥组。对照组：1_13、6_1；无机肥：2_21、4_5；混合肥：2_9、3_15。Reads：被分为所有OUT中的总优化序列数。Ace, Chao, Coverage, Shannon, Simpson分别代表各个指数。0.97：整体相似水平为0.97。由表9可知，各处理间真菌菌落多样性有一定的差异，无机肥处理的群落多样性差异大，其次是对照组和有机肥处理组。表面施加有机肥与真菌群落的多样性呈一定程度的负相关性，可能的原因是对照处理内不同重复间的差异也较大。Shannon-Wiener曲线分析由图16可知，各不同施肥处理曲线均趋向平坦，表明测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的真菌微生物信息。Venn 图分析在Venn 图中，不同的颜色代表不同的样本。重叠区域表示这两个样本均有序列被划入相同的OTU中。由图17可知，真菌个处理间独有OTU较多。Rank-abundance 曲线分析由图18可知，不同施肥处理下的真菌群落各物种分布不均匀。 但物种的丰度较高。PCA 分析多样本相似度分析由图20 可知，该树枝结构可以分成不施有机肥和施有机肥两组。施加有机肥处理组(2_9,3_15)与其余各处理组之间的样本在图上呈现的是完全分离的叉枝，能说明了施加有机肥导致真菌群落组成发生较大的差别。 群落结构组分图I由图19可知样本中各微生物的序列数，即各真菌的相对丰度。Ascomycota子囊菌门的数量最多，其次是basidiomycota担子菌门、zygomycota接合菌门以及chytridiomycota壶菌门。各微生物的相对丰度在不同的施肥处理间未有显著规律呈现。群落Heatmap分析由图21可知，有机肥和无机肥混合施加对真菌生物群落的影响较大，降低了真菌微生物群落的多样性，并且较大的改变了微生物群落的结构。第五章· 讨论5.1实验中的总结土在土壤重金属含量检测中，我们得出的结果是在单独施加有机肥或者化肥时，重金属含量上升是非常少的，当有机无机肥混合施加时，出现了多组土壤重金属元素升高，主要引起Cu、Zn、Pb、As和Mo元素的增加，但增加后的数据低于可国家限制标准（表1），肥料的安全性还是可靠的。可能的原因是有机肥的来源受到了重金属的污染[25]，例如家畜禽的饲料中添加了一些重金属元素(Cu、Zn、Mn、Co、Se等)，其目的是使禽畜更好的吸收饲料，提高其利用率，所以会造成禽畜排泄物也含有一定量的重金属，而家畜禽排泄物是有机肥的重要来源之一，故会造成有机肥中含有一定量的重金属[26]，还有可能是被重金属污染的淤泥，如水质重金属超标的塘里的淤泥，可能被用作有机肥。故控制好有机肥的来源很关键。在土壤营养状况的实验中，数据表明，土壤有机质含量、硝态氮和全氮含量均呈上升趋势，有机无机肥混合的施用土壤中铵态氮、全钾和全磷的含量并无显著正相关性。观察可知铵态氮、全钾和全磷均为可溶性物质，故可能的原因是这些物质随着雨水流失了，而常熟地区是多雨性气候，且土壤来源稻田，这些物质随雨水流失的可能性很大[27]。实验中还发现单独施加无机肥时，施氮量与土壤电导率呈正相关关系，因为无机肥主要是大量可溶性的NO3-、SO42-和Cl-离子，所以施入土壤后能增加电导率[28]。从实验结果图来看，在无机肥与有机肥的混合施加时，在一定程度上会增大土壤电导率，和大多数已有的实验结果相符合[29]，是因为有机肥中存在大量的N元素，在土壤微生物的代谢过程中形成硝酸盐，故会增加其导电率[30]。其中电导率增加的幅度也不一样，增加量的不同可能反映了有机肥来源的不同。通过三个实验表明，有机肥和无机肥的复合施加不仅能增加土壤中营养物质的含量，能为植物提供充足的营养，还能改变土壤微生物的多样性。5.2混合施肥的重要性及未来的发展随着我们经济水平的提升，农业、养殖业和化工业的规模越来越大，随着而来的副产品，如禽畜粪便、污泥和生活垃圾也越来越多，若这些废弃物没有得到合理的处理，则造成环境污染，同时也会影响人类生活中的卫生健康。假如通过目前普遍的堆肥技术，将这些废弃物发酵后制成生物有机肥料，不仅能缓解当前的环境问题，还可以投入农业生产进行再次利用，从而建立良好的生态循环体系，与我国可持续发展的理念相符合。另一方面，未来提高产量，传统化肥的大框使用，已经造成了十分严重的环境问题，直接的影响就是土地肥力的下降，这也就间接导致了农产品产量和质量的下降。有机肥和无机肥的搭配混合施用在很大程度上减少了化肥的使用量，既能保证农作物拥有很好的生长物质可供提供，还能通过其大量的有机质有效的改善土壤内环境，提供土壤保持肥力的能力，从而间接地提升了地力。未来复合施肥可以继续改进的地方主要有以下几点。一、控制有机肥的来源。由于有机肥的来源不同，使一些有机肥存在重金属污染的可能性，从而间接的污染环境，可以通过控制动物饲料品质，减少使用存在重金属污染的地区的污泥等措施加以缓解。二、可通过分子生物技术改造工程菌，在堆肥时，可以利用这些工程菌进一步发酵有机肥，使有机肥的有机质更为丰富。若中国广阔的乡村地区都推广有机无机混合施肥的方法，大量的农业副产品的处理问题可以得到很好的解决，一方面有机肥的使用，减少了化肥的使用，也就间接的减少了耕地成本，另一方面，有机肥使用大大减少了在使用这些农副产品时对环境的污染，是生态农业循环中必不可少的重要环节，实现了环境友好，国家可持续发展的战略目标之一。致谢在实验室日常工作期间，陆敏师兄和张佳楠师姐给予了我很大的帮助和关心，为实验的完成也是尽心尽力，在此向他们表达我的感激之情。另外也感谢我的家人，他们的理解、鼓励和支持伴我顺利完成毕业设计和论文。参考文献：[1]李华栋. 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目录
摘要1
关键字1
Abstract1
Key words2
第一章引言3
第二章土壤重金属污染风险5
2.1材料与方法5
2.1.1土壤的采集和处理5
2.1.2土壤金属元素和大量元素测定分析5
2.2实验结果与分析5
2.2.1施加不同含氮水平的无机肥对稻田土壤重金属元素和大量元素含量的影响5
2.2.2施加不同剂量的有机肥对稻田土壤重金属元素和大量元素含量的影响5
2.2.3施加几种不同复合肥料对稻田土壤重金属元素和大量元素含量的影响5
2.3结论8
第三章中长期施肥对土壤营养状况的影响9
3.1材料与方法9
3.1.1土壤有机质含量的测定9
3.1.2土壤铵态氮、硝态氮以及总氮测定10
3.1.3土壤全钾含量的测定11
3.1.4土壤全磷含量的测定11
3.1.5土壤pH测定12
3.1.6土壤电导率测定12
3.2结果分析12
第四章土壤微生物多样性检测和分析13
4.1材料与方法13
4.1.1MiSeq测序实验流程13
4.1.2测序类型以及引物的选择13
4.1.3生物多样性指数13
4.2细菌16s MiSeq分析结果14
4.3真菌ITS分析结果20
第五章讨论25
5.1实验中的总结25
5.2混合施肥的重要性及未来的发展25
致谢26
参考文献26
不同施肥方式对常熟区域稻田土壤微生物类群的影响
引言
引言
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