一株琼脂降解菌的分离、鉴定与生化特性的研究
一株琼脂降解菌的分离、鉴定与生化特性的研究[20200614171759]
摘要：琼脂广泛用于微生物培养的支持介质，琼脂糖经琼脂酶水解后形成琼胶寡糖。新琼寡糖具有许多有意义的生理功能特性，例如抗病毒，抗氧化，增殖益生菌和增湿美白平等作用。但是目前产业化应用价格昂贵，所以琼脂降解菌的关研究具有重要意义。
本文通过琼脂降解菌的分离、筛选和鉴定，得到一株具有较高活性的琼脂降解菌LGH，旨在对琼脂降解进行初步探究，为寡糖的制备奠定基础。经16s rDNA鉴定，确定该菌株为柯恩氏菌（Cohnella）。通过对Cohnella sp.LGH培养条件的优化，得到Cohnella sp.LGH最佳生长条件:初始pH8.0，温度30℃，Nacl浓度1%，碳源：蔗糖，氮源：(NH4)2SO4，最适碳氮比为1/5。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:琼脂糖,琼脂降解菌,柯恩氏菌,培养条件优化
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1.材料与方法 3
1.1实验材料 3
1.1.1土壤样品 3
1.1.3 PCR相关引物 3
1.1.4 培养基 3
1.1.5生化试剂 3
1.1.6实验仪器 3
1.2实验方法 3
1.2.1菌种分离 3
1.2.2菌株纯化 3
1.2.3菌株降解验证 3
1.2.4菌株的16sDNA鉴定 4
1.2.5菌株的形态学特征 5
1.2.6生长曲线测定 5
1.2.7 培养条件对菌株生长的影响 5
2结果与分析 6
2.1琼脂降解菌的筛选 6
2.2形态特征 7
2.3 菌株的16Sr DNA的分子学鉴定 8
2.4 Cohnella sp.LGH的生长曲线测定 9
2.5 培养条件对Cohnella sp.LGH的生长影响 11
2.5.1 不同初始pH对Cohnella sp.LGH生长的影响 11
2.5.2 不同温度对Cohnella sp.LGH生长的影响 12
2.5.3 不同初始盐浓度对Cohnella sp.LGH生长的影响 12
2.5.4不同碳源对Cohnella sp.LGH生长的影响 13
2.3.5不同氮源对Cohnella sp.LGH生长的影响 13
2.3.6 不同C/N比对Cohnella sp.LGH生长的影响 1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
4
2.3.7 不同通气量对Cohnella sp.LGH生长的影响 14
3.讨论 15
参考文献 16
致谢 18
一株琼脂降解菌的分离、鉴定与生化特性的研究
生物技术101 李根
引言
引言
随着人类对资源的不断探索和利用，陆地资源越来越匮乏，现在人们逐步把目光转移到蕴藏巨量资源的海洋。海洋约占地球总面积的71%，拥有丰富的藻类资源，主要有红藻，蓝藻，硅藻，绿藻等，人们通过物理，化学和生物方法从藻类中提取各种具有价值的物质，琼脂就是其中一种。琼脂也可称作琼胶，是从红藻类海藻中提取的一类天然多糖物质[1]。在实验室里，琼脂作为一种难以降解利用的惰性物质，具有很好的稳定性，常作为培养基的支持介质。得益于其稳定性，在食品工业上琼脂作为增稠剂、稳定剂、悬浮剂、凝固剂和乳化剂等使用[2]，是工业用途最为广泛的海藻胶之一。在我国琼脂的生产主要来源于江篱。
琼脂是由具有凝胶性质的琼脂糖（agarose）和非凝胶性质的琼脂胶（agaropectin）构成的混合物，并以琼脂糖为主。琼脂糖的化学构成是由β-D-半乳糖和3,6-内醚-α-L-半乳糖等组成的链状线性聚合物（图1），其中硫酸基的含量低于0.15%。琼脂胶的结构与琼脂糖相似，但3,6-内醚-α-L-半乳糖上的羟基被硫酸基、甲氧基、丙酮基等基团替代，硫酸基的含量较高，可达5%-8%。硫酸酯和丙酮酸的存在会使凝胶强度减弱，若基团链接在C6上，可通过碱处理或硫酸酯酶的作用脱硫，转化为琼脂糖，提高凝胶强度。
图1.琼脂糖结构
新琼寡糖是琼脂经琼脂酶水解后形成聚合度为 2～20 的海洋功能性低聚糖，主要由琼脂二糖的重复单位连接而成。琼脂粘度高，不溶于水，难以分解利用，新琼寡糖则有很好的水溶性，易于人体吸收利用。随着研究的不断进展和深入，人们逐渐发现新琼寡糖并且具有很多有意义的生理功能特性。新琼寡糖具有抗癌症，抗炎症，抗病毒[3,4]，抗氧化[5.6]，抗龋齿，预防糖尿病，增殖肠道益生菌[7,8]和美白保湿[9]等生理功能。这表明新琼寡糖在医用药物，保健品，功能饲料和化妆品等方面有着很好的应用前景。
目前获得新琼寡糖的主要方法有酸解法和酶解法，而酸解法存在污染大和效率低等缺点，酶解法有着效率高，污染小和反应条件温和等优势，代替酸解法是未来的趋势。本文通过土壤细菌的分离和筛选获得一株具有琼脂降解能力的菌株，为降解琼脂，新琼寡糖的制备和研究做基础探索工作。
1.材料与方法
1.1实验材料
1.1.1土壤样品
2013年10月在南京麒麟镇采集土样，迅速收集好带回实验室，包装好并置于4℃保存，用于后续菌株的分离和筛选。
1.1.2 质粒载体和感受态细胞
pMDTM 19-T Vector 购于TaKaRa公司
DH5α 购于TaKaRa公司
1.1.3 PCR相关引物
27F: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’
1492R: 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’
m13r：5-CAGGAAACAGCTATGACC-3
m13f：5-TGT *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
AAAACGACGGCCAGT-3
1.1.4 培养基
LB培养基：蛋白胨10g，Nacl 10g，酵母膏5g，琼脂15g溶于1L纯水，121℃灭菌20min。
无机盐培养基：Nacl 1g,K2HPO4 1.5g，KH2PO4 0.5g，蔗糖 5g，(NH4)2SO4 2g ，MgSO4 0.2g，Cacl2 0.2g，琼脂15g溶于1L纯水，121℃灭菌20min。
琼脂筛选培养基：Nacl 1g,K2HPO4 1.5g，KH2PO4 0.5g，(NH4)2SO4 2g ，MgSO4 0.2g，Cacl2 0.2g，琼脂15g溶于1L纯水，121℃灭菌20min.
改良LB培养基：蛋白胨10g，Nacl 10g，酵母膏5g，蔗糖20g，琼脂15g溶于1L纯水，121℃灭菌20min。
1.1.5生化试剂
卢戈氏碘液：碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml.
草酸铵结晶紫染液：结晶紫2.5g溶于95%乙醇20ml,1%草酸铵水溶液80ml,将两液混匀,过滤.
95%乙醇.
番红复染液：番红0.25g,95%乙醇10ml,蒸馏水90ml.
1.1.6实验仪器
离心机，pcr仪，超净工作台，恒温摇床，培养箱，高压灭菌锅等。
1.2实验方法
1.2.1菌种分离
称取10g从麒麟镇采集的土壤样品，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，振荡约20min，使土样和无菌水充分混匀，得到土壤悬浮液。用灭菌的枪头吸取1ml悬液，加入到盛有9ml无菌水的试管中反复吹打使溶液充分混匀，以此类推采用梯度稀释的方法，选取10-3、10-4、10-53个梯度吸取稀释液0.1ml涂布于LB平板，30℃倒置培养，观察平板的凹陷情况，初步挑取具有降解琼脂能力的菌株，在LB平板上划线单独培养，观察平板的凹陷情况。
2.3 菌株的16Sr DNA的分子学鉴定
将分离菌株LGH的16Sr DNA序列在GenBank中BLAST进行比对，发现该菌株的16S rDNA与Cohnella phaseoli strain GSPC1相似度达99%。确定该菌株是柯恩氏菌（Cohnella ）。根据南京思普金生物科技有限公司进行测序结果，→菌株的16S rDNA序列如表2-1所示。
摘要：琼脂广泛用于微生物培养的支持介质，琼脂糖经琼脂酶水解后形成琼胶寡糖。新琼寡糖具有许多有意义的生理功能特性，例如抗病毒，抗氧化，增殖益生菌和增湿美白平等作用。但是目前产业化应用价格昂贵，所以琼脂降解菌的关研究具有重要意义。
本文通过琼脂降解菌的分离、筛选和鉴定，得到一株具有较高活性的琼脂降解菌LGH，旨在对琼脂降解进行初步探究，为寡糖的制备奠定基础。经16s rDNA鉴定，确定该菌株为柯恩氏菌（Cohnella）。通过对Cohnella sp.LGH培养条件的优化，得到Cohnella sp.LGH最佳生长条件:初始pH8.0，温度30℃，Nacl浓度1%，碳源：蔗糖，氮源：(NH4)2SO4，最适碳氮比为1/5。
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关键字:琼脂糖,琼脂降解菌,柯恩氏菌,培养条件优化
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1.材料与方法 3
1.1实验材料 3
1.1.1土壤样品 3
1.1.3 PCR相关引物 3
1.1.4 培养基 3
1.1.5生化试剂 3
1.1.6实验仪器 3
1.2实验方法 3
1.2.1菌种分离 3
1.2.2菌株纯化 3
1.2.3菌株降解验证 3
1.2.4菌株的16sDNA鉴定 4
1.2.5菌株的形态学特征 5
1.2.6生长曲线测定 5
1.2.7 培养条件对菌株生长的影响 5
2结果与分析 6
2.1琼脂降解菌的筛选 6
2.2形态特征 7
2.3 菌株的16Sr DNA的分子学鉴定 8
2.4 Cohnella sp.LGH的生长曲线测定 9
2.5 培养条件对Cohnella sp.LGH的生长影响 11
2.5.1 不同初始pH对Cohnella sp.LGH生长的影响 11
2.5.2 不同温度对Cohnella sp.LGH生长的影响 12
2.5.3 不同初始盐浓度对Cohnella sp.LGH生长的影响 12
2.5.4不同碳源对Cohnella sp.LGH生长的影响 13
2.3.5不同氮源对Cohnella sp.LGH生长的影响 13
2.3.6 不同C/N比对Cohnella sp.LGH生长的影响 1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
4
2.3.7 不同通气量对Cohnella sp.LGH生长的影响 14
3.讨论 15
参考文献 16
致谢 18
一株琼脂降解菌的分离、鉴定与生化特性的研究
生物技术101 李根
引言
引言
随着人类对资源的不断探索和利用，陆地资源越来越匮乏，现在人们逐步把目光转移到蕴藏巨量资源的海洋。海洋约占地球总面积的71%，拥有丰富的藻类资源，主要有红藻，蓝藻，硅藻，绿藻等，人们通过物理，化学和生物方法从藻类中提取各种具有价值的物质，琼脂就是其中一种。琼脂也可称作琼胶，是从红藻类海藻中提取的一类天然多糖物质[1]。在实验室里，琼脂作为一种难以降解利用的惰性物质，具有很好的稳定性，常作为培养基的支持介质。得益于其稳定性，在食品工业上琼脂作为增稠剂、稳定剂、悬浮剂、凝固剂和乳化剂等使用[2]，是工业用途最为广泛的海藻胶之一。在我国琼脂的生产主要来源于江篱。
琼脂是由具有凝胶性质的琼脂糖（agarose）和非凝胶性质的琼脂胶（agaropectin）构成的混合物，并以琼脂糖为主。琼脂糖的化学构成是由β-D-半乳糖和3,6-内醚-α-L-半乳糖等组成的链状线性聚合物（图1），其中硫酸基的含量低于0.15%。琼脂胶的结构与琼脂糖相似，但3,6-内醚-α-L-半乳糖上的羟基被硫酸基、甲氧基、丙酮基等基团替代，硫酸基的含量较高，可达5%-8%。硫酸酯和丙酮酸的存在会使凝胶强度减弱，若基团链接在C6上，可通过碱处理或硫酸酯酶的作用脱硫，转化为琼脂糖，提高凝胶强度。
图1.琼脂糖结构
新琼寡糖是琼脂经琼脂酶水解后形成聚合度为 2～20 的海洋功能性低聚糖，主要由琼脂二糖的重复单位连接而成。琼脂粘度高，不溶于水，难以分解利用，新琼寡糖则有很好的水溶性，易于人体吸收利用。随着研究的不断进展和深入，人们逐渐发现新琼寡糖并且具有很多有意义的生理功能特性。新琼寡糖具有抗癌症，抗炎症，抗病毒[3,4]，抗氧化[5.6]，抗龋齿，预防糖尿病，增殖肠道益生菌[7,8]和美白保湿[9]等生理功能。这表明新琼寡糖在医用药物，保健品，功能饲料和化妆品等方面有着很好的应用前景。
目前获得新琼寡糖的主要方法有酸解法和酶解法，而酸解法存在污染大和效率低等缺点，酶解法有着效率高，污染小和反应条件温和等优势，代替酸解法是未来的趋势。本文通过土壤细菌的分离和筛选获得一株具有琼脂降解能力的菌株，为降解琼脂，新琼寡糖的制备和研究做基础探索工作。
1.材料与方法
1.1实验材料
1.1.1土壤样品
2013年10月在南京麒麟镇采集土样，迅速收集好带回实验室，包装好并置于4℃保存，用于后续菌株的分离和筛选。
1.1.2 质粒载体和感受态细胞
pMDTM 19-T Vector 购于TaKaRa公司
DH5α 购于TaKaRa公司
1.1.3 PCR相关引物
27F: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’
1492R: 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’
m13r：5-CAGGAAACAGCTATGACC-3
m13f：5-TGT *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
AAAACGACGGCCAGT-3
1.1.4 培养基
LB培养基：蛋白胨10g，Nacl 10g，酵母膏5g，琼脂15g溶于1L纯水，121℃灭菌20min。
无机盐培养基：Nacl 1g,K2HPO4 1.5g，KH2PO4 0.5g，蔗糖 5g，(NH4)2SO4 2g ，MgSO4 0.2g，Cacl2 0.2g，琼脂15g溶于1L纯水，121℃灭菌20min。
琼脂筛选培养基：Nacl 1g,K2HPO4 1.5g，KH2PO4 0.5g，(NH4)2SO4 2g ，MgSO4 0.2g，Cacl2 0.2g，琼脂15g溶于1L纯水，121℃灭菌20min.
改良LB培养基：蛋白胨10g，Nacl 10g，酵母膏5g，蔗糖20g，琼脂15g溶于1L纯水，121℃灭菌20min。
1.1.5生化试剂
卢戈氏碘液：碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml.
草酸铵结晶紫染液：结晶紫2.5g溶于95%乙醇20ml,1%草酸铵水溶液80ml,将两液混匀,过滤.
95%乙醇.
番红复染液：番红0.25g,95%乙醇10ml,蒸馏水90ml.
1.1.6实验仪器
离心机，pcr仪，超净工作台，恒温摇床，培养箱，高压灭菌锅等。
1.2实验方法
1.2.1菌种分离
称取10g从麒麟镇采集的土壤样品，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，振荡约20min，使土样和无菌水充分混匀，得到土壤悬浮液。用灭菌的枪头吸取1ml悬液，加入到盛有9ml无菌水的试管中反复吹打使溶液充分混匀，以此类推采用梯度稀释的方法，选取10-3、10-4、10-53个梯度吸取稀释液0.1ml涂布于LB平板，30℃倒置培养，观察平板的凹陷情况，初步挑取具有降解琼脂能力的菌株，在LB平板上划线单独培养，观察平板的凹陷情况。
2.3 菌株的16Sr DNA的分子学鉴定
将分离菌株LGH的16Sr DNA序列在GenBank中BLAST进行比对，发现该菌株的16S rDNA与Cohnella phaseoli strain GSPC1相似度达99%。确定该菌株是柯恩氏菌（Cohnella ）。根据南京思普金生物科技有限公司进行测序结果，→菌株的16S rDNA序列如表2-1所示。
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