乙羧氟草醚降解菌的分离鉴定及降解特性研究
：采集长期生产乙羧氟草醚的农药厂污泥样本，经富集后，从中分离到一株乙羧氟草醚降解菌，命名为KS-1。根据其表型特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列相似性分析，鉴定其属为Lysinibacillus sp.。KS-1在3d对于50mg/L乙羧氟草醚的降解率为85.25%。菌株KS-1最适生长及降解温度为30 °C，最适生长及降解温度pH值为7.0。KS-1生长最适碳源为葡萄糖，最适氮源为蛋白胨。Zn2+、Cu2+对降解效果有明显的抑制作用。乙羧氟草醚的初始浓度大于150mg/L时，菌株的降解效果受到影响。
目录
摘要1
关键词1
引言1
1材料与方法2
1.1培养基与试剂2
1.2 降解菌株的筛选和分离2
1.3 菌体培养与生长量的测定2
1.4 菌株对乙羧氟草醚降解效果的测定2
1.5 降解菌株的16S rRNA基因序列分析2
1.5.1 菌体总DNA的提取2
1.5.2 降解菌16S rRNA的PCR扩增3
1.5.3 PCR产物的T/A克隆3
1.5.4 普通感受态细胞的制备和转化3
1.5.5 16S rRNA的序列测定4
1.6 降解菌株系统发育地位的确定4
1.7 降解菌株KS1的降解曲线测定4
1.8 环境条件对菌株KS1生长的影响4
1.8.1 不同温度对菌株KS1生长的影响4
1.8.2 不同pH值对菌株KS1生长的影响4
1.8.3 不同碳源对菌株KS1生长的影响4
1.8.4 不同氮源对菌株KS1生长的影响4
1.9 不同影响因子对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响4
1.9.1 不同温度对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响4
1.9.2 不同初始pH值对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响4
1.9.3 不同金属离子对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响4
1.9.4 不同起始浓度对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响5
2. 结果与分析5
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2.1 污染土壤中乙羧氟草醚降解菌株的分离筛选5
2.2 降解菌株KS1的菌落形态及生理生化特征5
2.3 降解菌株KS116S rRNA的系统发育树分析6
2.4 乙羧氟草醚降解菌KS1的降解特性7
2.5 环境条件对降解菌株KS1生长情况的影响8
2.5.1 不同温度对菌株KS1生长的情况影响8
2.5.2 不同pH值对菌株KS1生长情况的影响8
2.5.3 不同碳源对菌株KS1生长情况的影响8
2.5.4 不同氮源对菌株KS1生长情况的影响9
2.6 不同影响因子对降解菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响的测定9
2.6.1 不同温度对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响的测定9
2.6.2 不同初始pH值对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响的测定10
2.6.3 不同金属离子对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响的测定10
2.6.4 不同起始浓度对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响的测定10
3 讨论11
参考文献11
乙羧氟草醚降解菌的分离鉴定及降解特性研究
引言
引言：乙羧氟草醚（Fluoroglycofen）是二苯醚类除草剂中的一种重要农药。其化学名称为O〔5(2氯a,a,a三氟对甲苯氧基)2硝基苯甲酞基〕氧乙酸乙酯，分子式为C18H9ClF3NO3，分子量为447.8[1]。乙羧氟草醚是一种触杀型除草剂，是原卟啉氧化酶抑制剂，主要适用于小麦、大豆、水稻田间杂草的去除。乙羧氟草醚被作物吸收后，其逐渐积累会使植物细胞膜消失，最终导致植物内含物的渗透引起植物的死亡[2]。虽然乙羧氟草醚价廉高效，但其在土壤中残留期长，对后茬敏感作物及非靶标植物存在较严重的药害问题，造成经济损失，也严重影响了稻田等的耕作以及葡萄园的正常运转[34]。另外，在对小麦田低温期用药、用药量过大或是喷洒药的浓度过高，容易对作物产生药害[6]。此类农药在土壤和水体环境中的残留，对生态环境和人体健康也会构成潜在威胁[5]。
利用降解菌快速降解土壤中的农药残留已成为国内外研究热点。目前国内外有关乙羧氟草醚在土壤中降解动态方面开展了一些研究工作，如吴凌云等发现此种农药的降解动态速度与土壤本身的温度和pH关系较大，适当的升高温度和pH有利于乙羧氟草醚的降解[7]。Aldo Laganà等分析和测定了自然界水体中乙羧氟草醚的代谢产物[8]。
有研究证明[911]，自然界中存在的多种微生物往往是环境中农药残留分解的重要因素。本研究从长期生产乙羧氟草醚的农药厂中分离筛选到一株乙羧氟草醚降解菌株，命名为KS1，并研究该菌株的生物学特性和降解特性，可为乙羧氟草醚污染农田土壤的生物修复提供新的资源与方法。
1材料与方法
1.1培养基与试剂
LB培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，加去离子水至1000 mL，pH=7.0。固体LB培养基：液体LB培养基加1.6%的琼脂粉。
无机盐培养基(MM)：NH4NO3 1.0 g/L，K2HPO4 1.5g/L，KH2PO4 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO4 0.2 g/L，加去离子水至1000 mL，pH =7.0。固体MM加入1.6%的琼脂粉。
乙羧氟草醚原药均用甲醇溶解配制成10000 mg/L的储存液备用。甲醇（色谱纯），二氯甲烷等化学试剂购自南京宁氏试剂有限公司，分子生物学试剂购于Takara公司。
1.2 降解菌株的筛选和分离
富集样品来源为长期生产乙羧氟草醚农药厂的污水处理池。取5 g生化污泥于250 mL三角瓶里、加入100mL含50mg/L的酵母汁、50 mg/L乙羧氟草醚的无机盐培养基中，30°C、150 rpm摇床中培养7天。7天以5%的接种量再接种到50 mg/L乙羧氟草醚无机盐培养基中，连续传代3次。富集液进过萃取后通过紫外和液相进行检测，如果发现有降解效果，对富集液进行梯度稀释，并将稀释后的富集液0.2mL分别涂布在100 mg/L的乙羧氟草醚无机盐固体培养基平板上，于30°C培养箱中培养，发现有菌落产生了透明圈，对该菌落划线3次进行纯化，纯化后得到单一的单菌落，挑取少量的单菌接种到LB培养基中扩大培养，制作菌体种子液，再以5 %的接种量转接到50 mg/L乙羧氟草醚的无机盐培养基中，于30°C、150 rpm摇床培养，验证菌株的降解效果。
目录
摘要1
关键词1
引言1
1材料与方法2
1.1培养基与试剂2
1.2 降解菌株的筛选和分离2
1.3 菌体培养与生长量的测定2
1.4 菌株对乙羧氟草醚降解效果的测定2
1.5 降解菌株的16S rRNA基因序列分析2
1.5.1 菌体总DNA的提取2
1.5.2 降解菌16S rRNA的PCR扩增3
1.5.3 PCR产物的T/A克隆3
1.5.4 普通感受态细胞的制备和转化3
1.5.5 16S rRNA的序列测定4
1.6 降解菌株系统发育地位的确定4
1.7 降解菌株KS1的降解曲线测定4
1.8 环境条件对菌株KS1生长的影响4
1.8.1 不同温度对菌株KS1生长的影响4
1.8.2 不同pH值对菌株KS1生长的影响4
1.8.3 不同碳源对菌株KS1生长的影响4
1.8.4 不同氮源对菌株KS1生长的影响4
1.9 不同影响因子对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响4
1.9.1 不同温度对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响4
1.9.2 不同初始pH值对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响4
1.9.3 不同金属离子对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响4
1.9.4 不同起始浓度对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响5
2. 结果与分析5
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2.1 污染土壤中乙羧氟草醚降解菌株的分离筛选5
2.2 降解菌株KS1的菌落形态及生理生化特征5
2.3 降解菌株KS116S rRNA的系统发育树分析6
2.4 乙羧氟草醚降解菌KS1的降解特性7
2.5 环境条件对降解菌株KS1生长情况的影响8
2.5.1 不同温度对菌株KS1生长的情况影响8
2.5.2 不同pH值对菌株KS1生长情况的影响8
2.5.3 不同碳源对菌株KS1生长情况的影响8
2.5.4 不同氮源对菌株KS1生长情况的影响9
2.6 不同影响因子对降解菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响的测定9
2.6.1 不同温度对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响的测定9
2.6.2 不同初始pH值对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响的测定10
2.6.3 不同金属离子对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响的测定10
2.6.4 不同起始浓度对菌株KS1降解乙羧氟草醚的影响的测定10
3 讨论11
参考文献11
乙羧氟草醚降解菌的分离鉴定及降解特性研究
引言
引言：乙羧氟草醚（Fluoroglycofen）是二苯醚类除草剂中的一种重要农药。其化学名称为O〔5(2氯a,a,a三氟对甲苯氧基)2硝基苯甲酞基〕氧乙酸乙酯，分子式为C18H9ClF3NO3，分子量为447.8[1]。乙羧氟草醚是一种触杀型除草剂，是原卟啉氧化酶抑制剂，主要适用于小麦、大豆、水稻田间杂草的去除。乙羧氟草醚被作物吸收后，其逐渐积累会使植物细胞膜消失，最终导致植物内含物的渗透引起植物的死亡[2]。虽然乙羧氟草醚价廉高效，但其在土壤中残留期长，对后茬敏感作物及非靶标植物存在较严重的药害问题，造成经济损失，也严重影响了稻田等的耕作以及葡萄园的正常运转[34]。另外，在对小麦田低温期用药、用药量过大或是喷洒药的浓度过高，容易对作物产生药害[6]。此类农药在土壤和水体环境中的残留，对生态环境和人体健康也会构成潜在威胁[5]。
利用降解菌快速降解土壤中的农药残留已成为国内外研究热点。目前国内外有关乙羧氟草醚在土壤中降解动态方面开展了一些研究工作，如吴凌云等发现此种农药的降解动态速度与土壤本身的温度和pH关系较大，适当的升高温度和pH有利于乙羧氟草醚的降解[7]。Aldo Laganà等分析和测定了自然界水体中乙羧氟草醚的代谢产物[8]。
有研究证明[911]，自然界中存在的多种微生物往往是环境中农药残留分解的重要因素。本研究从长期生产乙羧氟草醚的农药厂中分离筛选到一株乙羧氟草醚降解菌株，命名为KS1，并研究该菌株的生物学特性和降解特性，可为乙羧氟草醚污染农田土壤的生物修复提供新的资源与方法。
1材料与方法
1.1培养基与试剂
LB培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，加去离子水至1000 mL，pH=7.0。固体LB培养基：液体LB培养基加1.6%的琼脂粉。
无机盐培养基(MM)：NH4NO3 1.0 g/L，K2HPO4 1.5g/L，KH2PO4 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO4 0.2 g/L，加去离子水至1000 mL，pH =7.0。固体MM加入1.6%的琼脂粉。
乙羧氟草醚原药均用甲醇溶解配制成10000 mg/L的储存液备用。甲醇（色谱纯），二氯甲烷等化学试剂购自南京宁氏试剂有限公司，分子生物学试剂购于Takara公司。
1.2 降解菌株的筛选和分离
富集样品来源为长期生产乙羧氟草醚农药厂的污水处理池。取5 g生化污泥于250 mL三角瓶里、加入100mL含50mg/L的酵母汁、50 mg/L乙羧氟草醚的无机盐培养基中，30°C、150 rpm摇床中培养7天。7天以5%的接种量再接种到50 mg/L乙羧氟草醚无机盐培养基中，连续传代3次。富集液进过萃取后通过紫外和液相进行检测，如果发现有降解效果，对富集液进行梯度稀释，并将稀释后的富集液0.2mL分别涂布在100 mg/L的乙羧氟草醚无机盐固体培养基平板上，于30°C培养箱中培养，发现有菌落产生了透明圈，对该菌落划线3次进行纯化，纯化后得到单一的单菌落，挑取少量的单菌接种到LB培养基中扩大培养，制作菌体种子液，再以5 %的接种量转接到50 mg/L乙羧氟草醚的无机盐培养基中，于30°C、150 rpm摇床培养，验证菌株的降解效果。
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