水稻stop1同源基因的功能分析
： 拟南芥转录因子STOP1同时参与了抗铝毒和耐H+毒害。STOP1在水稻中有6个同源基因，其中Os01g0871200（ART2）与STOP1同源性最高，其次为ART1。ART2在水稻中的生物功能目前还不清楚，而ART1被报道参与水稻抗铝毒但不参与水稻对H+的耐性。为了探究ART1和ART2的功能异同点，本课题采用突变体stop1表型回补的方式来研究ART1和ART2在拟南芥中抗铝毒和耐H+毒害的功能差异，即将STOP1启动子分别与ART1和ART2融合再转入stop1中，然后分析转基因株系对铝毒和H+毒害的耐性。结果显示，ART1和ART2在拟南芥中均能恢复stop1对铝毒和H+毒害的耐性，这说明ART1、ART2在拟南芥中与STOP1具有相似功能，都能调控下游抗铝毒和H+毒相关基因的表达。因此，我们推测ART1和ART2之间的蛋白序列差异导致抗铝毒相关蛋白不能与ART2进行相互作用，从而使只有ART1参与水稻的抗铝毒；而在耐H+毒害方面，ART1和ART2可能存在功能冗余，从而使任一基因的突变都不影响水稻对H+毒害的耐性。下一步我们将通过创建ART1、ART2功能缺失的双突变体株系，然后对其进行表型分析来验证我们的假说。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 拟南芥 3
1.1.2 载体 3
1.1.3 感受态 . 3
1.1.4 试剂盒 3
1.1.5 试剂配制 4
1.2 ART1五个同源基因在水稻中的表达 4
1.2.1 水稻苗培养 4
1.2.2 RNA提取以及反转录 5
1.2.3 荧光定量PCR 6
1.3 载体构建 6
1.3.1 pSTOP1ART1 6
1.3.2 pSTOP1ART2 6
1.4 获得转基因株纯合种子 7
1.4.1 农杆菌转化法 7
1.4.2 潮霉素平板筛选 7
1.5 抗铝毒表型和生理分析
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
7
1.5.1 植物材料水培 7
1.5.2 根长测量 8
2 结果分析 8
2.1 水稻中ART1 5个同源基因的表达 8
2.2 氨基酸序列比对结果 9
2.3 根长表型分析 9
2.3.1 pSTOP1ART1转基因系铝处理根长表型分析 9
2.2.2 pSTOP1 ART2转基因系铝处理根长表型分析 10
2.3.3 pSTOP1ART1转基因系不同pH处理根长表型分析 12
3 讨论 13
致谢 14
参考文献 14
水稻STOP1同源基因的功能分析
引言
铝（Al3+）和低pH（H +）的毒害是酸性土壤上限制作物产量的主要因素。离子态铝（主要是Al3+）在低浓度时就会损害植物根细胞结构和功能[1], 从而抑制根伸长，危害作物对水分和养分的吸收。铝毒主要作用在根尖的分生区和伸长区之间的过渡区，也是根对铝最敏感的区域[2]。铝会结合在细胞壁和细胞膜，也会进入细胞结合大多数负电位点，破坏胞内的细胞骨架、信号转导以及DNA。酸毒害同样严重破坏根的生长，但H +造成根的损伤模式是另一种方式，与铝毒导致的不同[3]。近来，有些研究表明在某些植物种类中抗铝毒和酸毒的遗传上有一定相关性[4]，虽然两种毒害模式不同，但酸性土壤中两种毒害共存，植物适应环境在解毒途径上可能会受某个共同的成分控制。
筛选拟南芥酸敏感突变体的研究证明了这种猜想，突变体stop1对H+ 非常敏感，同时又对铝毒有高敏感性[5]。STOP1是一类有C2H2锌指结构的转录因子，microarray分析表明STOP1同时调控下游39个Al和H相关基因，抗铝基因如苹果酸分泌蛋白基因AtALMT1 [6]，柠檬酸分泌蛋白基因AtMATE [7]，编码ABC转运蛋白跨膜结构的基因ALS3 [8]等。苹果酸分泌是拟南芥外部抗铝毒的最重要机制，突变体atalmt1对铝毒高敏感，但对低pH并不敏感，AtMATE参与柠檬酸分泌抗铝毒，ALS3参与Al从敏感部位向外转移，都与抗酸毒无关，说明STOP1参与抗铝和酸毒是分别调控两组不同功能的基因，适应酸铝两种不同的毒害模式。STOP1调控的其他基因包括参与细胞壁稳定的PGIP1和PGIP2，离子平衡的CIPK23和SULTR3;5等都是抗酸毒的基因[9]。拟南芥STOP1另有一个同源基因STOP2， STOP2能够回补stop1对低pH的敏感性，但对于对铝毒的敏感性回补较少，利用STOP1 promoter::STOP2回补不能恢复stop1中ALMT1的表达，STOP2仅能协助STOP1发挥抗酸毒的作用，并且这可能与STOP2的C端结构截短有关[12]。
STOP1在水稻中有6个同源基因，其中Os01g0871200（ART2）与STOP1同源性最高，其次为ART1。ART2在水稻中的生物功能目前还不清楚，而ART1被报道参与水稻抗铝毒但不参与水稻对H+的耐性。ART1调控下游31个铝相关基因，包括AtMATE和ALS3的同源基因，除此之外与STOP1调控的基因有些不同[11]。水稻存在着与拟南芥相似但又有不同的抗铝机制，从水稻有机酸分泌很少也可看出，单个ART1没有抗酸毒的功能。
为了探究ART1和ART2的功能异同点，本实验采用突变体stop1表型回补的方式，分析ART1和ART2对铝毒和H+毒害的耐性，研究水稻中只有ART1参与抗铝毒功能的原因，在耐H+毒害方面ART1和ART2是否存在功能冗余，2个基因共同影响水稻对H+毒害的耐性，探究C2H2锌指转录因子调控抗酸铝毒的机制在水稻和拟南芥系统中的异同。
图1.水稻和拟南芥中ART1同源的C2H2型锌指蛋白的进化树（Yamaji et al.,2009）
Figure 1．Phylogenic tree of ART1like C2H2 zinc finger proteins in rice (Os) and Arabidopsis (At).
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 水稻日本晴 拟南芥TDNA突变体stop1
1.1.2 载体 pZH2B
1.1.3 感受态
Trans1T1感受态细胞；农杆菌感受态；
农杆菌感受态制备方法：
1）GV3101在平板上接种划线，加抗生素庆大霉素和利福平，28℃培养2d
2）挑单克隆接种于5mL LB中，28℃摇菌过夜
3）取500μL菌液接种于50mL LB中, 28℃摇菌过夜
4) 冰上30min
5）分装成45mL，4000rpm 4℃,10min
6) 弃上清，用5 mL预冷的20mM CaCl2溶液悬浮
7）4000rpm 4℃,5min，1mL预冷的20mM CaCl2溶液悬浮
8）每管分装200μL，放入液氮，然后转移到80℃冰箱保存。
1.1.4 试剂盒
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 拟南芥 3
1.1.2 载体 3
1.1.3 感受态 . 3
1.1.4 试剂盒 3
1.1.5 试剂配制 4
1.2 ART1五个同源基因在水稻中的表达 4
1.2.1 水稻苗培养 4
1.2.2 RNA提取以及反转录 5
1.2.3 荧光定量PCR 6
1.3 载体构建 6
1.3.1 pSTOP1ART1 6
1.3.2 pSTOP1ART2 6
1.4 获得转基因株纯合种子 7
1.4.1 农杆菌转化法 7
1.4.2 潮霉素平板筛选 7
1.5 抗铝毒表型和生理分析
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
7
1.5.1 植物材料水培 7
1.5.2 根长测量 8
2 结果分析 8
2.1 水稻中ART1 5个同源基因的表达 8
2.2 氨基酸序列比对结果 9
2.3 根长表型分析 9
2.3.1 pSTOP1ART1转基因系铝处理根长表型分析 9
2.2.2 pSTOP1 ART2转基因系铝处理根长表型分析 10
2.3.3 pSTOP1ART1转基因系不同pH处理根长表型分析 12
3 讨论 13
致谢 14
参考文献 14
水稻STOP1同源基因的功能分析
引言
铝（Al3+）和低pH（H +）的毒害是酸性土壤上限制作物产量的主要因素。离子态铝（主要是Al3+）在低浓度时就会损害植物根细胞结构和功能[1], 从而抑制根伸长，危害作物对水分和养分的吸收。铝毒主要作用在根尖的分生区和伸长区之间的过渡区，也是根对铝最敏感的区域[2]。铝会结合在细胞壁和细胞膜，也会进入细胞结合大多数负电位点，破坏胞内的细胞骨架、信号转导以及DNA。酸毒害同样严重破坏根的生长，但H +造成根的损伤模式是另一种方式，与铝毒导致的不同[3]。近来，有些研究表明在某些植物种类中抗铝毒和酸毒的遗传上有一定相关性[4]，虽然两种毒害模式不同，但酸性土壤中两种毒害共存，植物适应环境在解毒途径上可能会受某个共同的成分控制。
筛选拟南芥酸敏感突变体的研究证明了这种猜想，突变体stop1对H+ 非常敏感，同时又对铝毒有高敏感性[5]。STOP1是一类有C2H2锌指结构的转录因子，microarray分析表明STOP1同时调控下游39个Al和H相关基因，抗铝基因如苹果酸分泌蛋白基因AtALMT1 [6]，柠檬酸分泌蛋白基因AtMATE [7]，编码ABC转运蛋白跨膜结构的基因ALS3 [8]等。苹果酸分泌是拟南芥外部抗铝毒的最重要机制，突变体atalmt1对铝毒高敏感，但对低pH并不敏感，AtMATE参与柠檬酸分泌抗铝毒，ALS3参与Al从敏感部位向外转移，都与抗酸毒无关，说明STOP1参与抗铝和酸毒是分别调控两组不同功能的基因，适应酸铝两种不同的毒害模式。STOP1调控的其他基因包括参与细胞壁稳定的PGIP1和PGIP2，离子平衡的CIPK23和SULTR3;5等都是抗酸毒的基因[9]。拟南芥STOP1另有一个同源基因STOP2， STOP2能够回补stop1对低pH的敏感性，但对于对铝毒的敏感性回补较少，利用STOP1 promoter::STOP2回补不能恢复stop1中ALMT1的表达，STOP2仅能协助STOP1发挥抗酸毒的作用，并且这可能与STOP2的C端结构截短有关[12]。
STOP1在水稻中有6个同源基因，其中Os01g0871200（ART2）与STOP1同源性最高，其次为ART1。ART2在水稻中的生物功能目前还不清楚，而ART1被报道参与水稻抗铝毒但不参与水稻对H+的耐性。ART1调控下游31个铝相关基因，包括AtMATE和ALS3的同源基因，除此之外与STOP1调控的基因有些不同[11]。水稻存在着与拟南芥相似但又有不同的抗铝机制，从水稻有机酸分泌很少也可看出，单个ART1没有抗酸毒的功能。
为了探究ART1和ART2的功能异同点，本实验采用突变体stop1表型回补的方式，分析ART1和ART2对铝毒和H+毒害的耐性，研究水稻中只有ART1参与抗铝毒功能的原因，在耐H+毒害方面ART1和ART2是否存在功能冗余，2个基因共同影响水稻对H+毒害的耐性，探究C2H2锌指转录因子调控抗酸铝毒的机制在水稻和拟南芥系统中的异同。
图1.水稻和拟南芥中ART1同源的C2H2型锌指蛋白的进化树（Yamaji et al.,2009）
Figure 1．Phylogenic tree of ART1like C2H2 zinc finger proteins in rice (Os) and Arabidopsis (At).
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 水稻日本晴 拟南芥TDNA突变体stop1
1.1.2 载体 pZH2B
1.1.3 感受态
Trans1T1感受态细胞；农杆菌感受态；
农杆菌感受态制备方法：
1）GV3101在平板上接种划线，加抗生素庆大霉素和利福平，28℃培养2d
2）挑单克隆接种于5mL LB中，28℃摇菌过夜
3）取500μL菌液接种于50mL LB中, 28℃摇菌过夜
4) 冰上30min
5）分装成45mL，4000rpm 4℃,10min
6) 弃上清，用5 mL预冷的20mM CaCl2溶液悬浮
7）4000rpm 4℃,5min，1mL预冷的20mM CaCl2溶液悬浮
8）每管分装200μL，放入液氮，然后转移到80℃冰箱保存。
1.1.4 试剂盒
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/smkx/361.html
