一个水稻盐敏感突变体的生理鉴定及基因定位
一个水稻盐敏感突变体的生理鉴定及基因定位[20200614172056]
摘要：盐胁迫是造成水稻减产的重要环境因素之一。诱导水稻耐盐性相关突变体材料，克隆耐盐相关基因，对认识水稻的耐盐机理以及育种改良均具有重要意义。本实验以从水稻品种日本晴突变体库中筛选到的一个盐敏感突变体JN60为试验材料，进行了耐盐表型鉴定以及盐胁迫下水稻植株地上和地下部Na+、K+含量测定。筛选出在JN60和窄叶青8号间具有多态性的SSR分子标记引物 103对，并构建了JN60/窄叶青8号F2分离群体第1、2和6染色体的连锁图谱，总长度为713.9cM，标记间平均距离为17.0cM。遗传图谱分子标记均较均匀地分布在3条染色体上，基本满足QTL定位的要求，为JN60基因的定位奠定了基础。
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关键字:盐敏感突变体；JN60；图位克隆；分子标记；连锁图谱
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2耐盐性鉴定方法 3
1.2.1材料培养与胁迫处理3
1.2.2取样，离子测定3
1.3 SSR分子标记3
1.3.1总DNA提取（SDS法）3
1.3.2 SSR标记检测4
1.3.2.1 PCR反应 4
1.3.2.2 PCR产物的检测4
1.4 分子连锁图谱的构建4
2 结果与分析5
2.1盐敏感突变体JN60苗期耐盐性表5
2.2盐胁迫对JN60地上部与地下部Na+、K+含量及K+/Na+的影响6
2.3 JN60/窄叶青8号F2群体分子连锁图谱构建8
2.4 JN60/窄叶青8 F2群体耐盐性鉴定及JN60基因定位9
3讨论 9
3.1 JN60苗期耐盐性生理基础9
3.2 分子连锁图谱构建为基因定位奠定基础10
致谢10
参考文献10
一个水稻盐敏感突变体的生理鉴定及基因定位
引言
引言
土壤盐渍化是限制农作物生长，造成作物减产最严重的非生物胁迫之一。据联合国教科文组织（UNESCO）和粮农组织（FAO）不完全统计，全世界盐渍土面积约 10 亿hm2。我国盐渍土面积约1亿hm2。而在我国的现有耕地中，至少有八百万hm2的土地由于不当的灌溉和施肥，导致土壤中盐分积累，不同程度地影响了作物的产量。通过遗传改良提高作物的抗逆性是解决这一农业问题的最 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
有效途径之一。因此，需要从基因的角度认识自然界中作物耐盐的机制，这将有助于通过分子育种方法提高农作物抵御盐胁迫的能力，对未来农业的发展有着重要的意义。水稻是世界上最大的粮食作物之一，在中国水稻是种植面积最大的粮食作物，种植面积约3000 万hm2，产量占粮食作物总产的 40% 以上，作为中国 65% 以上人口的主食来源，对中国乃至世界粮食安全和社会发展作出了巨大贡献，在国民经济中占有非常重要的地位水稻耐盐基因的遗传及耐盐新品种的选育是目前水稻育种研究的一个重要方向，通过筛选优异耐盐种质作为亲本开展杂交育种，选育耐盐新品种 (品系)；或通过转基因等分子生物技术与常规育种相结合，进而培育耐盐新品种；同时研究耐盐基因的遗传规律，为更好的开展耐盐育种奠定基础。水稻是一种对盐浓度中度敏感的作物，耐盐性状是受多基因控制的数量性状，易受环境条件等影响。早期，一些研究者利用水稻突变体进行耐盐性基因定位研究。张耕耘等对九个EMS诱变的耐盐性突变体进行RFLP分析，表明RG4、RG711和R16三个位点有可能与耐盐性突变相关[5]。丁海媛等将粳稻77-170的耐盐突变体M20的耐盐主效基因定位在第7染色体上[6]。但这些研究未见有后续报道。
随着分子标记技术的建立和基因组测序工作的顺利进行，不少研究者构建饱和分子连锁图谱，在全基因组范围内扫描耐盐性相关的QTL，以全面准确地对该性状进行剖析。龚继明等利用窄叶青8号/京系17的DH群体，在水稻第1染色体上检测到一个贡献率较大的主效QTL[7]。顾兴友等利用Pokkali与Peta配制的回交群体，定位到4个控制苗期耐盐性和7个控制成熟期耐盐性的QTL[8]。Lin等利用特三矮2号/CB组合构建的重组自交系群体，发现一个位于第5染色体的位点显著与耐盐性有连锁[9]。Prasad等利用IR64/Azucena的DH群体，检测到7个控制苗期耐盐性的QTL，其中位于第6染色体上的一个控制根长的QTL的效应较大[10]。Sabouri等定位到14个与耐盐生理相关的QTL，但是仅有少数几个与耐盐相关的基因被克隆[11]。Ammar等定位到25个与盐相关的QTL，分别位于水稻第1、2、3、8染色体上[12]。Haq等利用co39/Moroberekan的RILs 群体，定位到1个位于第1染色体11.07-14.6Mbp范围内与苗期水稻叶片中Na+ 的QTL[13]。对这些研究结果进行分析，可以看出，虽然有不少控制水稻耐盐性的QTL被发现，但其贡献率普遍较小，均未超过30%，这为QTL的分离克隆工作带来较大困难。
为了寻找对耐盐性有较大影响的主效QTL，Lin等利用高度耐盐的籼稻品种Nona Bokra与盐敏感的粳稻品种Koshihikari构建的F2群体及相应的F23群体，进行耐盐相关性状的QTL分析，鉴定到11个与耐受盐胁迫有关的QTL[14]。其中，2个分别控制地上部Na+含量和K+含量的QTL（qSNC-7和qSKC-1）效应较大，分别解释总表型变异的48.5%和40.1%。随后，他们采用图位克隆的方法，成功分离了SKC-1[15]，该基因编码一个HKT家族的离子转运蛋白，专一性地运输Na+，不参与K+、Li+等其它阳离子的运输。SKC-1在盐胁迫下调节水稻地上部的K+/Na+平衡，即维持高钾、低钠的状态，从而增加水稻的耐盐性。同时，Huang等也从水稻品种中花11 EMS诱变的突变体库中，获 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
得了一份较强抗旱、耐盐，且稳定遗传的水稻突变体dst(drought and salt tolerance)，并图位克隆了DST 基因[16]。该基因编码一个含一个C2H2类型锌指结构域的蛋白，它是一个新型的核转录因子。DST编码蛋白的二个氨基酸的变异显著地降低了DST 的转录激活活性。DST 作为抗逆性的负调控因子，当其功能缺失时可直接下调过氧化氢代谢相关基因(如过氧化物酶基因)的表达，使清除过氧化氢的能力下降从而增加过氧化氢在保卫细胞中的累积，促使叶片气孔关闭，减少水分蒸发，最终提高水稻的耐盐能力。同时研究发现，抗逆性增强的dst 突变体在正常生长情况下，其产量等一些重要的农艺性状与对照品种(野生型)相比没有明显的变化，这使该基因在作物抗逆育种中尤显其实用价值。
本课题所研究的材料为一个盐敏感突变体JN60，盐胁迫下，该突变体比野生型表现出更严重的萎蔫现象。本研究将对该突变体的生理和遗传基础进行分析。
1. 材料与方法
1. 1 材料
野生型水稻日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica var. Nipponbare)；
从EMS诱变的日本晴突变体库中筛选到的一个水稻盐敏感突变体JN60；
JN60与籼稻品种窄叶青8号的杂交F2群体202株。
1. 2 耐盐性鉴定方法
PCR反应参考Chen等的方法[20]，略作改动。95℃变性5min、95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共进行35次循环；72℃延伸5min，10℃保存。PCR反应在东胜创新EDC-810PCR仪中进行。
1. 3. 2. 2 PCR产物的检测
（1） 聚丙烯酰胺凝胶电泳
20 ml（单块胶） 37.5ml（单槽） 80ml（2槽） 150ml（4槽）
dH2O 14 ml 26.25ml 56 ml 105 ml
10×TBE 2ml 3.75 ml 8 ml 15 ml
摘要：盐胁迫是造成水稻减产的重要环境因素之一。诱导水稻耐盐性相关突变体材料，克隆耐盐相关基因，对认识水稻的耐盐机理以及育种改良均具有重要意义。本实验以从水稻品种日本晴突变体库中筛选到的一个盐敏感突变体JN60为试验材料，进行了耐盐表型鉴定以及盐胁迫下水稻植株地上和地下部Na+、K+含量测定。筛选出在JN60和窄叶青8号间具有多态性的SSR分子标记引物 103对，并构建了JN60/窄叶青8号F2分离群体第1、2和6染色体的连锁图谱，总长度为713.9cM，标记间平均距离为17.0cM。遗传图谱分子标记均较均匀地分布在3条染色体上，基本满足QTL定位的要求，为JN60基因的定位奠定了基础。
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关键字:盐敏感突变体；JN60；图位克隆；分子标记；连锁图谱
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2耐盐性鉴定方法 3
1.2.1材料培养与胁迫处理3
1.2.2取样，离子测定3
1.3 SSR分子标记3
1.3.1总DNA提取（SDS法）3
1.3.2 SSR标记检测4
1.3.2.1 PCR反应 4
1.3.2.2 PCR产物的检测4
1.4 分子连锁图谱的构建4
2 结果与分析5
2.1盐敏感突变体JN60苗期耐盐性表5
2.2盐胁迫对JN60地上部与地下部Na+、K+含量及K+/Na+的影响6
2.3 JN60/窄叶青8号F2群体分子连锁图谱构建8
2.4 JN60/窄叶青8 F2群体耐盐性鉴定及JN60基因定位9
3讨论 9
3.1 JN60苗期耐盐性生理基础9
3.2 分子连锁图谱构建为基因定位奠定基础10
致谢10
参考文献10
一个水稻盐敏感突变体的生理鉴定及基因定位
引言
引言
土壤盐渍化是限制农作物生长，造成作物减产最严重的非生物胁迫之一。据联合国教科文组织（UNESCO）和粮农组织（FAO）不完全统计，全世界盐渍土面积约 10 亿hm2。我国盐渍土面积约1亿hm2。而在我国的现有耕地中，至少有八百万hm2的土地由于不当的灌溉和施肥，导致土壤中盐分积累，不同程度地影响了作物的产量。通过遗传改良提高作物的抗逆性是解决这一农业问题的最 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
有效途径之一。因此，需要从基因的角度认识自然界中作物耐盐的机制，这将有助于通过分子育种方法提高农作物抵御盐胁迫的能力，对未来农业的发展有着重要的意义。水稻是世界上最大的粮食作物之一，在中国水稻是种植面积最大的粮食作物，种植面积约3000 万hm2，产量占粮食作物总产的 40% 以上，作为中国 65% 以上人口的主食来源，对中国乃至世界粮食安全和社会发展作出了巨大贡献，在国民经济中占有非常重要的地位水稻耐盐基因的遗传及耐盐新品种的选育是目前水稻育种研究的一个重要方向，通过筛选优异耐盐种质作为亲本开展杂交育种，选育耐盐新品种 (品系)；或通过转基因等分子生物技术与常规育种相结合，进而培育耐盐新品种；同时研究耐盐基因的遗传规律，为更好的开展耐盐育种奠定基础。水稻是一种对盐浓度中度敏感的作物，耐盐性状是受多基因控制的数量性状，易受环境条件等影响。早期，一些研究者利用水稻突变体进行耐盐性基因定位研究。张耕耘等对九个EMS诱变的耐盐性突变体进行RFLP分析，表明RG4、RG711和R16三个位点有可能与耐盐性突变相关[5]。丁海媛等将粳稻77-170的耐盐突变体M20的耐盐主效基因定位在第7染色体上[6]。但这些研究未见有后续报道。
随着分子标记技术的建立和基因组测序工作的顺利进行，不少研究者构建饱和分子连锁图谱，在全基因组范围内扫描耐盐性相关的QTL，以全面准确地对该性状进行剖析。龚继明等利用窄叶青8号/京系17的DH群体，在水稻第1染色体上检测到一个贡献率较大的主效QTL[7]。顾兴友等利用Pokkali与Peta配制的回交群体，定位到4个控制苗期耐盐性和7个控制成熟期耐盐性的QTL[8]。Lin等利用特三矮2号/CB组合构建的重组自交系群体，发现一个位于第5染色体的位点显著与耐盐性有连锁[9]。Prasad等利用IR64/Azucena的DH群体，检测到7个控制苗期耐盐性的QTL，其中位于第6染色体上的一个控制根长的QTL的效应较大[10]。Sabouri等定位到14个与耐盐生理相关的QTL，但是仅有少数几个与耐盐相关的基因被克隆[11]。Ammar等定位到25个与盐相关的QTL，分别位于水稻第1、2、3、8染色体上[12]。Haq等利用co39/Moroberekan的RILs 群体，定位到1个位于第1染色体11.07-14.6Mbp范围内与苗期水稻叶片中Na+ 的QTL[13]。对这些研究结果进行分析，可以看出，虽然有不少控制水稻耐盐性的QTL被发现，但其贡献率普遍较小，均未超过30%，这为QTL的分离克隆工作带来较大困难。
为了寻找对耐盐性有较大影响的主效QTL，Lin等利用高度耐盐的籼稻品种Nona Bokra与盐敏感的粳稻品种Koshihikari构建的F2群体及相应的F23群体，进行耐盐相关性状的QTL分析，鉴定到11个与耐受盐胁迫有关的QTL[14]。其中，2个分别控制地上部Na+含量和K+含量的QTL（qSNC-7和qSKC-1）效应较大，分别解释总表型变异的48.5%和40.1%。随后，他们采用图位克隆的方法，成功分离了SKC-1[15]，该基因编码一个HKT家族的离子转运蛋白，专一性地运输Na+，不参与K+、Li+等其它阳离子的运输。SKC-1在盐胁迫下调节水稻地上部的K+/Na+平衡，即维持高钾、低钠的状态，从而增加水稻的耐盐性。同时，Huang等也从水稻品种中花11 EMS诱变的突变体库中，获 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
得了一份较强抗旱、耐盐，且稳定遗传的水稻突变体dst(drought and salt tolerance)，并图位克隆了DST 基因[16]。该基因编码一个含一个C2H2类型锌指结构域的蛋白，它是一个新型的核转录因子。DST编码蛋白的二个氨基酸的变异显著地降低了DST 的转录激活活性。DST 作为抗逆性的负调控因子，当其功能缺失时可直接下调过氧化氢代谢相关基因(如过氧化物酶基因)的表达，使清除过氧化氢的能力下降从而增加过氧化氢在保卫细胞中的累积，促使叶片气孔关闭，减少水分蒸发，最终提高水稻的耐盐能力。同时研究发现，抗逆性增强的dst 突变体在正常生长情况下，其产量等一些重要的农艺性状与对照品种(野生型)相比没有明显的变化，这使该基因在作物抗逆育种中尤显其实用价值。
本课题所研究的材料为一个盐敏感突变体JN60，盐胁迫下，该突变体比野生型表现出更严重的萎蔫现象。本研究将对该突变体的生理和遗传基础进行分析。
1. 材料与方法
1. 1 材料
野生型水稻日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica var. Nipponbare)；
从EMS诱变的日本晴突变体库中筛选到的一个水稻盐敏感突变体JN60；
JN60与籼稻品种窄叶青8号的杂交F2群体202株。
1. 2 耐盐性鉴定方法
PCR反应参考Chen等的方法[20]，略作改动。95℃变性5min、95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共进行35次循环；72℃延伸5min，10℃保存。PCR反应在东胜创新EDC-810PCR仪中进行。
1. 3. 2. 2 PCR产物的检测
（1） 聚丙烯酰胺凝胶电泳
20 ml（单块胶） 37.5ml（单槽） 80ml（2槽） 150ml（4槽）
dH2O 14 ml 26.25ml 56 ml 105 ml
10×TBE 2ml 3.75 ml 8 ml 15 ml
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