过量铜及甲基紫精对msr的表达调控研究
为了研究Cu及甲基紫精（methyl viologen , MV）对甲硫氨酸亚砜还原酶(methionine sulfoxide reductase，MSRs)表达的影响，本文首先通过qPCR发现过量Cu和MV处理会影响水稻MSR基因家族中OsMSRA4.1基因的表达。为了进一步了解其调控机理，本文克隆了MSR基因家族中的OsMSRA4.1和OsMSRB3基因上游启动子区序列，分别将启动子（ProA4 和 ProB3）通过GateWay方法导入载体pGWB3中，成功构建了ProA4-pGWB3和ProB3-pGWB3重组载体。通过农杆菌转化的方式，将两个重组载体分别导入水稻的愈伤中。其中，转ProB3-pGWB3基因愈伤已分化出阳性转基因水稻幼苗。但是对转ProB3-pGWB3基因水稻幼苗的GUS染色中，水稻并没有表现出GUS活性，原因有待进一步分析。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.2 实验方法 3
2 结果与分析5
2.1 Cu和MV处理下OsMSRA4.1基因相对表达量的测定5
2.2 启动子序列克隆6
2.3 启动子pGWB3重组载体的构建6
2.4 ProA4及ProB3的序列分析7
2.5 含启动子pGWB3重组载体的农杆菌构建8
2．6 含启动子pGWB3基因农杆菌侵染愈伤并诱导分化9
2.7 转启动子pGWB3基因水稻幼苗的鉴定9
2.8 Cu及MV处理对GUS活性的影响 10
3 讨论10
3.1 转启动子pGWB3基因水稻苗的构建 10
3.2 分析转ProB3pGWB3基因水稻幼苗无GUS活性的原因 11
3.3 启动子上游短引物的设计 11
3.4 创新之处 11
致谢11
参考文献11
过量铜及甲基紫精对MSR的表达调控研究
引言
引言
甲硫氨酸（methio *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
nine，Met）是多肽和蛋白质中重要的含硫氨基酸残基。由于硫很容易与活性氧（reactive oxygen species，ROS）反应，因此Met易被臭氧、过氧化氢及羟自由基等活性氧氧化成为甲硫氨酸亚砜(MetSO)，这会使其构成的蛋白质生物学活性降低或丧失。但是，甲硫氨酸亚讽还原酶可以将生物体内的MetSO还原为Met，使其所在蛋白质重新恢复活性,并且可以间接清除ROS[1]。
大多数的生物都拥有A型（MARAs）和B型（MARBs）两种类型的MARs蛋白，两者分别特异性的作用于S构型和R构型的MetSO，但两种类型的MARs在序列上或结构上并没有相似性[2,3]，两种类型的MARs将MetSO维持在一个较低的水平。
尽管MSRAs和MSRBs之间缺乏相似性，但两种通常共享一套包含三个步骤的反应机制：a.半胱氨酸的每还原一摩尔的甲硫氨酸亚砜就形成一摩尔的亚磺酸中间体。b.在半胱氨酸另一个巯基的作用下两者形成分子内二硫键。c.最后通过还原剂还原二硫键，重新形成半胱氨酸（图1A）[4]。而对于1Cys MSRBs，由于它只有一个具有氧化还原活性的半胱氨酸，无法形成分子内二硫键，因而只能与还原剂作用形成分子间二硫键。参与这一特殊反应的还原剂有硫氧还蛋白，谷氧还蛋白（Grx）以及谷胱甘肽（GSH）（图1B）[5]。
图1 MSRs蛋白还原MetSO机制
MSR蛋白在细菌、酵母或哺乳动物细胞耐受胁迫或衰老的过程中发挥其基础功能。在酵母菌中，MSRA基因的缺失或过表达会分别导致酵母菌生存能力的降低或上升。不同于MSRA基因，MSRB基因的缺失对酵母菌寿命影响并不明显，但是，MSRA和MSRB的双缺陷株在生存能力上显著弱于MSRA缺陷株，这表明MSRA和MSRB这两类基因都非常重要[6]。在哺乳动物细胞中，MSR基因的丰度随着机体的衰老和疾病而下降。MSRA基因的表达随着环境的变化而调整，这一现象表明它参与到了机体抵抗氧胁迫的活动中。此外，人类线粒体上MSRB基因的过表达已被证实会保护急性淋巴白血病细胞免受蛋白损伤，同时也可以细胞在氧胁迫下的生存能力。以上研究表明MSR基因是保护机体在疾病和衰老情况下免受氧胁迫伤害的关键组份。
重金属是指元素密度在5.0 g/cm3以上的金属，包括Hg、Cd、Cu、Pb、Zn、Cr、Ni、Fe、Co、Ag、Mo、Sn、Au等。虽然有些重金属如Zn、Cu、Fe、Co等是生物体的必需微量元素，但重金属一旦过量就会对植物产生毒害，轻则导致植物体代谢紊乱，抑制生长发育，重则致其死亡[7]。
铜（Cu）是主要的土壤重金属之一，同时也是重要的环境污染物。Cu因为具有氧化还原性，铜离子的氧化会造成超氧根离子的形成，进而导致H2O2和OH的生成，因此铜损伤植物的作用机理之一是引起植物的氧化胁迫伤害。过量Cu容易引起植物的氧化胁迫和活性氧（ROS）积累。以往研究表明Cu胁迫会引起水稻甲硫氨酸亚讽还原酶（OsMSR)的表达显著增加,这说明OsMSRs可能参与了水稻对铜胁迫的响应[8]。而甲基紫精是一种非选择性接触性除草剂，被发现能够诱导化MSR基因家族中OsMSRA2.1和OsMSRB5的上调表达，在根系中尤其明显[9]。
目前有关重金属胁迫下MSR发挥何种作用的研究相对较少。相比其他生物体，高等植物拥有复杂的MSR基因家族。水稻的MSR基因家族包括4种MSRA基因和3种MSRB基因,分别是OsMSRA2.1、OsMSRA2.2、OsMSRA4（4.1和4.2）、OsMSRA5和OsMSRB1（1.1和1.2）、OsMSRB3、OsMSRB5，主要定位于叶绿体和细胞质中[10]。本文试通过构建ProA4pGWB3和ProB3pGWB3重组载体，并侵染入水稻。通过转启动子pGWB3基因水稻苗GUS水解酶的表达情况，了解过量Cu和MV胁迫下，OsMSRA4和OsMSRB3基因的表达情况。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.2 实验方法 3
2 结果与分析5
2.1 Cu和MV处理下OsMSRA4.1基因相对表达量的测定5
2.2 启动子序列克隆6
2.3 启动子pGWB3重组载体的构建6
2.4 ProA4及ProB3的序列分析7
2.5 含启动子pGWB3重组载体的农杆菌构建8
2．6 含启动子pGWB3基因农杆菌侵染愈伤并诱导分化9
2.7 转启动子pGWB3基因水稻幼苗的鉴定9
2.8 Cu及MV处理对GUS活性的影响 10
3 讨论10
3.1 转启动子pGWB3基因水稻苗的构建 10
3.2 分析转ProB3pGWB3基因水稻幼苗无GUS活性的原因 11
3.3 启动子上游短引物的设计 11
3.4 创新之处 11
致谢11
参考文献11
过量铜及甲基紫精对MSR的表达调控研究
引言
引言
甲硫氨酸（methio *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
nine，Met）是多肽和蛋白质中重要的含硫氨基酸残基。由于硫很容易与活性氧（reactive oxygen species，ROS）反应，因此Met易被臭氧、过氧化氢及羟自由基等活性氧氧化成为甲硫氨酸亚砜(MetSO)，这会使其构成的蛋白质生物学活性降低或丧失。但是，甲硫氨酸亚讽还原酶可以将生物体内的MetSO还原为Met，使其所在蛋白质重新恢复活性,并且可以间接清除ROS[1]。
大多数的生物都拥有A型（MARAs）和B型（MARBs）两种类型的MARs蛋白，两者分别特异性的作用于S构型和R构型的MetSO，但两种类型的MARs在序列上或结构上并没有相似性[2,3]，两种类型的MARs将MetSO维持在一个较低的水平。
尽管MSRAs和MSRBs之间缺乏相似性，但两种通常共享一套包含三个步骤的反应机制：a.半胱氨酸的每还原一摩尔的甲硫氨酸亚砜就形成一摩尔的亚磺酸中间体。b.在半胱氨酸另一个巯基的作用下两者形成分子内二硫键。c.最后通过还原剂还原二硫键，重新形成半胱氨酸（图1A）[4]。而对于1Cys MSRBs，由于它只有一个具有氧化还原活性的半胱氨酸，无法形成分子内二硫键，因而只能与还原剂作用形成分子间二硫键。参与这一特殊反应的还原剂有硫氧还蛋白，谷氧还蛋白（Grx）以及谷胱甘肽（GSH）（图1B）[5]。
图1 MSRs蛋白还原MetSO机制
MSR蛋白在细菌、酵母或哺乳动物细胞耐受胁迫或衰老的过程中发挥其基础功能。在酵母菌中，MSRA基因的缺失或过表达会分别导致酵母菌生存能力的降低或上升。不同于MSRA基因，MSRB基因的缺失对酵母菌寿命影响并不明显，但是，MSRA和MSRB的双缺陷株在生存能力上显著弱于MSRA缺陷株，这表明MSRA和MSRB这两类基因都非常重要[6]。在哺乳动物细胞中，MSR基因的丰度随着机体的衰老和疾病而下降。MSRA基因的表达随着环境的变化而调整，这一现象表明它参与到了机体抵抗氧胁迫的活动中。此外，人类线粒体上MSRB基因的过表达已被证实会保护急性淋巴白血病细胞免受蛋白损伤，同时也可以细胞在氧胁迫下的生存能力。以上研究表明MSR基因是保护机体在疾病和衰老情况下免受氧胁迫伤害的关键组份。
重金属是指元素密度在5.0 g/cm3以上的金属，包括Hg、Cd、Cu、Pb、Zn、Cr、Ni、Fe、Co、Ag、Mo、Sn、Au等。虽然有些重金属如Zn、Cu、Fe、Co等是生物体的必需微量元素，但重金属一旦过量就会对植物产生毒害，轻则导致植物体代谢紊乱，抑制生长发育，重则致其死亡[7]。
铜（Cu）是主要的土壤重金属之一，同时也是重要的环境污染物。Cu因为具有氧化还原性，铜离子的氧化会造成超氧根离子的形成，进而导致H2O2和OH的生成，因此铜损伤植物的作用机理之一是引起植物的氧化胁迫伤害。过量Cu容易引起植物的氧化胁迫和活性氧（ROS）积累。以往研究表明Cu胁迫会引起水稻甲硫氨酸亚讽还原酶（OsMSR)的表达显著增加,这说明OsMSRs可能参与了水稻对铜胁迫的响应[8]。而甲基紫精是一种非选择性接触性除草剂，被发现能够诱导化MSR基因家族中OsMSRA2.1和OsMSRB5的上调表达，在根系中尤其明显[9]。
目前有关重金属胁迫下MSR发挥何种作用的研究相对较少。相比其他生物体，高等植物拥有复杂的MSR基因家族。水稻的MSR基因家族包括4种MSRA基因和3种MSRB基因,分别是OsMSRA2.1、OsMSRA2.2、OsMSRA4（4.1和4.2）、OsMSRA5和OsMSRB1（1.1和1.2）、OsMSRB3、OsMSRB5，主要定位于叶绿体和细胞质中[10]。本文试通过构建ProA4pGWB3和ProB3pGWB3重组载体，并侵染入水稻。通过转启动子pGWB3基因水稻苗GUS水解酶的表达情况，了解过量Cu和MV胁迫下，OsMSRA4和OsMSRB3基因的表达情况。
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