拟南芥ABi4基因过表达载体的构建
拟南芥ABi4基因过表达载体的构建[20200614170057]
摘要：ABI4(Abscisic Acid Insensitive 4)是一种ABA（脱落酸）非敏感型的转录因子，诱导一系列ABA相关反应基因的表达，ABi4对植物种子的萌发以及侧根的发育、抗激素、抗胁迫等都有着重要的影响，包括种子的成熟、植物体激素的应答、新陈代谢、胁迫应答等。因此，研究和探索ABi4作用机制，并进行转基因的研究，对于农业的发展于建设具有十分重要的意义。本实验以野生型拟南芥为材料，提取、扩增ABi4基因，构建拟南芥ABi4的过表达载体，为后续的转基因实验做准备。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关键字:ABi4基因拟南芥过表达载体
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
key words 1
引言1
1、材料与方法4
1.1材料4
1.1.1材料培养4
1.1.2 菌株及质粒载体4
1.1.3 主要试剂4
1.1.4 主要仪器设备4
1.2 试验方法5
1.2.1 RNA的提取5
1.2.2 引物设计6
1.2.3 cDNA的合成6
1.2.4 PCR的扩增 6
1.2.5 DNA片段的凝胶回收.7
1.2.6 重组载体的构建7
1.2.7 感受态细胞的制备8
1.2.8 重组载体的热激转化..9
1.2.9 碱裂法提取质粒DNA 9
1.2.10 重组子的筛选和鉴定 9
2、结果与分析10
2.1确定ABi4的序列10
2.2 设计引物10
2.3 提取RNA结果 11
2.4 PCR扩增结果11
2.5 大肠杆菌菌液PCR结果 11
3、讨论12
3.1 实验结论 12
3.2 本实验的创新之处 12
致谢 12
参考文献 13
拟南芥ABI4基因表达载体的构建
生物技术101班 周义东
引言
1、ABi4转录因子的功能和研究概况：
ABi4(Abscisic Acid Insensitive 4)是一种脱落酸(ABA)非敏感型的转录 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
因子，诱导一系列ABA相关反应基因的表达，影响着植物的生长发育，诱导的基因功能包括种子成熟、激素应答、新陈代谢、胁迫应答、蛋白稳定、信号转导等。ABi4拥有3个结构域: AP2结构域是结合DNA和蛋白质二聚体的部位; 富含脯氨酸的结构域是转录激活部位; 2个富含Lys/Arg的部位可能是核定位信号[1]。ABI4 诱导的基因启动子多数含有ABI4 特征性结合的基序，如CE1 或S box。近期对ABI4 直接转录目标的研究表明，ABI4结合其靶基因对结合基序的特异性要求不高，凝胶阻滞实验显示，某些不含ABI4 特征性结合基序的基因依然表现出可以与ABI4 相互结合的特性。ABI4 转录因子通过与某些bZIPs类转录因子相互作用调控基因表达，表现出正或负的调控活性[1]。
近年来已有多组实验证明了ABi4与植物生长发育之间的联系，ABi4在萌发中的种子中强烈表达，也能影响植物的侧根发育。
2. ABi4转录因子与植物侧根的发育：
植物的侧根发育受很多因素的影响，其中最主要的促进因素是生长素的极性分布。这里必须先介绍一下植物特异性蛋白PIN，PIN家族一共有8种蛋白，其中PIN1，PIN2，PIN3，PIN4，PIN7能够参与生长素运输。而仅有PIN1与植物的侧根发育相关。研究表明，PIN1 被ABI4 明显抑制，ABI4 基因超表达株系中PIN1 基因表达降低，推测ABI4 通过调控PIN1 基因表达来调控生长素的极性分布，从而调控植物侧根发育[2]。
4.ABi4在植物种子中的表达：
赤霉素 (GA)和脱落酸 (ABA)是调控种子休眠和萌发的主要植物激素。ABA抑制萌发, 诱导休眠; GA促进萌发, 是拮抗ABA的主要因子,为种子萌发所必需; 乙烯和油菜素内酯 (BR) 促进萌发, 但与GA相比, BR不是种子萌发的必需因子, 可能也是通过拮抗ABA 而促进萌发。
拟南芥中的ABI4, 通过与ABI3和ABI5的相互作用, 参与脱落酸(ABA)的信号转导(Soderman et al., 2000)。ABI4 只在胚中表达,是胚中ABA反应的主要接受因子, 具有抑制胚中脂质降解的作用(Penfield et al., 2006)。abi4突变体的种子对ABA抑制萌发的作用不敏感, 而ABI4的异位表达导致根的生长对ABA 抑制作用更加敏感。此外, abi4 突变体还具有抗盐和抗糖的特性。
3. ABi4转录因子的表达与调控：
ABI4 基因主要在发育的种子中强烈表达，在营养组织中存在较低水平的表达。营养生长中，ABI4基因的表达并不受ABA或胁迫的诱导[3]。ABI4 基因编码一种具有AP2/ERF 结构域的转录因子，参与种子发育和发芽期间ABA信号途径[4]。ABI4 作为ABA和糖信号的重要参与者，在早期幼苗生长中起重要调控作用[5]。种子发育和幼苗生长早期，ABI4 等位基因突变表现出对渗透胁迫及盐胁迫的抗性[6]。研究表明，在幼苗发育中转录因子ABI4 是其自身基因的基础调控者，ABI4 通过与ABI4 基因的启动子直接结合调控ABI4 基因的表达[5]。
ABI4 基因在拟南芥根部成熟区域表达机制：其表达模式与侧根发育区域有关，其超表达减弱了侧根的发育，及超表达型侧根密度与长度都会小于WT型，而ABI4 突变体 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
侧根密度与长度均优于野生型[6]。ABI4 基因的表达受到ABA、CTK和生长素三种植物激素相互调节，对不同激素处理后ABI4 基因表达分析显示，ABA和CTK处理可加强根部ABI4 基因的表达，而生长素则抑制其表达，ABI4 反过来也可以影响ABA和CTK反应。ABI4 突变体中侧根的发育并没有受到ABA和CTK 影响，而ABI4 基因超表达株系中侧根的发育明显被抑制。进一步对侧根形成的不同阶段侧根数量研究显示，ABI4 抑制侧根形成的初始阶段，即从侧根原基细胞起始分裂到侧根形成长度小于0.5 mm这一阶段，而当侧根长度大于0.5 mm后，其随后的发育阶段并不受ABI4 影响，即ABI4 影响LRP的形成和刚出现的LRs的伸长[11]。ABI4 影响侧根发育的关键在于根部生长素和CTK的定位和水平，其作用机制是影响了生长素的极性运输[8]。
4.总结
ABi4在植物的生长发育、尤其是种子萌发阶段具有极其重要的作用，它不仅影响着植物种子的萌发，还能对侧根的生长、激素的应答、胁迫应答起到调控作用。因此，研究拟南芥ABi4序列的调控机制具有十分重要的意义，本实验以拟南芥为实验对象，进行ABi4基因的克隆与过表达载体的构建，为之后的转基因工作做好充足的准备。
1.材料与方法
1.1.材料
1.1.1材料培养
本实验以WT型拟南芥（购自ABRC）为供试材料，将拟南芥种子用75%乙醇表面消毒2min月以后，再用2.0%次氯酸钠消毒20min。随后用灭菌去离子水充分清洗，置于4℃冰箱内春化。春化2d后将种子点种于1/2MS（Murashige and Skoog）固体培养基（含1%琼脂糖和1%蔗糖，pH5.8），并转移至光照培养箱内（恒温22℃，光周期16/8h（昼夜），光照强度120μmolm-2s-1）培养。培养5d后移苗于花盆中进行土培，日后用于拟南芥RNA的提取。
1.2.1RNA的提取[13]
1.2.9碱裂法提取质粒DNA[13]
1、挑取目的菌种的单菌落，接种于含1.0ml的LB液体培养基（含相应抗生素）的离心管中，37℃，200rpm震荡培养12~16h。
摘要：ABI4(Abscisic Acid Insensitive 4)是一种ABA（脱落酸）非敏感型的转录因子，诱导一系列ABA相关反应基因的表达，ABi4对植物种子的萌发以及侧根的发育、抗激素、抗胁迫等都有着重要的影响，包括种子的成熟、植物体激素的应答、新陈代谢、胁迫应答等。因此，研究和探索ABi4作用机制，并进行转基因的研究，对于农业的发展于建设具有十分重要的意义。本实验以野生型拟南芥为材料，提取、扩增ABi4基因，构建拟南芥ABi4的过表达载体，为后续的转基因实验做准备。
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关键字:ABi4基因拟南芥过表达载体
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
key words 1
引言1
1、材料与方法4
1.1材料4
1.1.1材料培养4
1.1.2 菌株及质粒载体4
1.1.3 主要试剂4
1.1.4 主要仪器设备4
1.2 试验方法5
1.2.1 RNA的提取5
1.2.2 引物设计6
1.2.3 cDNA的合成6
1.2.4 PCR的扩增 6
1.2.5 DNA片段的凝胶回收.7
1.2.6 重组载体的构建7
1.2.7 感受态细胞的制备8
1.2.8 重组载体的热激转化..9
1.2.9 碱裂法提取质粒DNA 9
1.2.10 重组子的筛选和鉴定 9
2、结果与分析10
2.1确定ABi4的序列10
2.2 设计引物10
2.3 提取RNA结果 11
2.4 PCR扩增结果11
2.5 大肠杆菌菌液PCR结果 11
3、讨论12
3.1 实验结论 12
3.2 本实验的创新之处 12
致谢 12
参考文献 13
拟南芥ABI4基因表达载体的构建
生物技术101班 周义东
引言
1、ABi4转录因子的功能和研究概况：
ABi4(Abscisic Acid Insensitive 4)是一种脱落酸(ABA)非敏感型的转录 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
因子，诱导一系列ABA相关反应基因的表达，影响着植物的生长发育，诱导的基因功能包括种子成熟、激素应答、新陈代谢、胁迫应答、蛋白稳定、信号转导等。ABi4拥有3个结构域: AP2结构域是结合DNA和蛋白质二聚体的部位; 富含脯氨酸的结构域是转录激活部位; 2个富含Lys/Arg的部位可能是核定位信号[1]。ABI4 诱导的基因启动子多数含有ABI4 特征性结合的基序，如CE1 或S box。近期对ABI4 直接转录目标的研究表明，ABI4结合其靶基因对结合基序的特异性要求不高，凝胶阻滞实验显示，某些不含ABI4 特征性结合基序的基因依然表现出可以与ABI4 相互结合的特性。ABI4 转录因子通过与某些bZIPs类转录因子相互作用调控基因表达，表现出正或负的调控活性[1]。
近年来已有多组实验证明了ABi4与植物生长发育之间的联系，ABi4在萌发中的种子中强烈表达，也能影响植物的侧根发育。
2. ABi4转录因子与植物侧根的发育：
植物的侧根发育受很多因素的影响，其中最主要的促进因素是生长素的极性分布。这里必须先介绍一下植物特异性蛋白PIN，PIN家族一共有8种蛋白，其中PIN1，PIN2，PIN3，PIN4，PIN7能够参与生长素运输。而仅有PIN1与植物的侧根发育相关。研究表明，PIN1 被ABI4 明显抑制，ABI4 基因超表达株系中PIN1 基因表达降低，推测ABI4 通过调控PIN1 基因表达来调控生长素的极性分布，从而调控植物侧根发育[2]。
4.ABi4在植物种子中的表达：
赤霉素 (GA)和脱落酸 (ABA)是调控种子休眠和萌发的主要植物激素。ABA抑制萌发, 诱导休眠; GA促进萌发, 是拮抗ABA的主要因子,为种子萌发所必需; 乙烯和油菜素内酯 (BR) 促进萌发, 但与GA相比, BR不是种子萌发的必需因子, 可能也是通过拮抗ABA 而促进萌发。
拟南芥中的ABI4, 通过与ABI3和ABI5的相互作用, 参与脱落酸(ABA)的信号转导(Soderman et al., 2000)。ABI4 只在胚中表达,是胚中ABA反应的主要接受因子, 具有抑制胚中脂质降解的作用(Penfield et al., 2006)。abi4突变体的种子对ABA抑制萌发的作用不敏感, 而ABI4的异位表达导致根的生长对ABA 抑制作用更加敏感。此外, abi4 突变体还具有抗盐和抗糖的特性。
3. ABi4转录因子的表达与调控：
ABI4 基因主要在发育的种子中强烈表达，在营养组织中存在较低水平的表达。营养生长中，ABI4基因的表达并不受ABA或胁迫的诱导[3]。ABI4 基因编码一种具有AP2/ERF 结构域的转录因子，参与种子发育和发芽期间ABA信号途径[4]。ABI4 作为ABA和糖信号的重要参与者，在早期幼苗生长中起重要调控作用[5]。种子发育和幼苗生长早期，ABI4 等位基因突变表现出对渗透胁迫及盐胁迫的抗性[6]。研究表明，在幼苗发育中转录因子ABI4 是其自身基因的基础调控者，ABI4 通过与ABI4 基因的启动子直接结合调控ABI4 基因的表达[5]。
ABI4 基因在拟南芥根部成熟区域表达机制：其表达模式与侧根发育区域有关，其超表达减弱了侧根的发育，及超表达型侧根密度与长度都会小于WT型，而ABI4 突变体 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
侧根密度与长度均优于野生型[6]。ABI4 基因的表达受到ABA、CTK和生长素三种植物激素相互调节，对不同激素处理后ABI4 基因表达分析显示，ABA和CTK处理可加强根部ABI4 基因的表达，而生长素则抑制其表达，ABI4 反过来也可以影响ABA和CTK反应。ABI4 突变体中侧根的发育并没有受到ABA和CTK 影响，而ABI4 基因超表达株系中侧根的发育明显被抑制。进一步对侧根形成的不同阶段侧根数量研究显示，ABI4 抑制侧根形成的初始阶段，即从侧根原基细胞起始分裂到侧根形成长度小于0.5 mm这一阶段，而当侧根长度大于0.5 mm后，其随后的发育阶段并不受ABI4 影响，即ABI4 影响LRP的形成和刚出现的LRs的伸长[11]。ABI4 影响侧根发育的关键在于根部生长素和CTK的定位和水平，其作用机制是影响了生长素的极性运输[8]。
4.总结
ABi4在植物的生长发育、尤其是种子萌发阶段具有极其重要的作用，它不仅影响着植物种子的萌发，还能对侧根的生长、激素的应答、胁迫应答起到调控作用。因此，研究拟南芥ABi4序列的调控机制具有十分重要的意义，本实验以拟南芥为实验对象，进行ABi4基因的克隆与过表达载体的构建，为之后的转基因工作做好充足的准备。
1.材料与方法
1.1.材料
1.1.1材料培养
本实验以WT型拟南芥（购自ABRC）为供试材料，将拟南芥种子用75%乙醇表面消毒2min月以后，再用2.0%次氯酸钠消毒20min。随后用灭菌去离子水充分清洗，置于4℃冰箱内春化。春化2d后将种子点种于1/2MS（Murashige and Skoog）固体培养基（含1%琼脂糖和1%蔗糖，pH5.8），并转移至光照培养箱内（恒温22℃，光周期16/8h（昼夜），光照强度120μmolm-2s-1）培养。培养5d后移苗于花盆中进行土培，日后用于拟南芥RNA的提取。
1.2.1RNA的提取[13]
1.2.9碱裂法提取质粒DNA[13]
1、挑取目的菌种的单菌落，接种于含1.0ml的LB液体培养基（含相应抗生素）的离心管中，37℃，200rpm震荡培养12~16h。
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