水稻卷叶突变体的特性分析与基因定位
水稻卷叶株型指的是水稻的叶片适当卷曲而使得叶片不披垂的一种株型。水稻的卷叶性状作为高产水稻的一种标志，有利于新型超级稻的开发和粮食的增产。本实验对从Co60诱变的水稻品种日本晴突变体库中筛选到的一个新的卷叶突变体rl1进行了农艺学、叶片细胞学结构以及叶绿素含量的分析。实验结果发现，相对于野生型，突变体呈现出农艺学性状指标普遍偏低、叶绿素含量偏低、叶片卷曲度显著性升高、泡状细胞面积普遍偏低等特点。分析表明,造成rl1突变体卷叶表型的原因可能是泡状细胞的面积的变化。此外，利用分子标记技术，本研究将控制rl1突变体的卷叶基因初步定位在了一个691kb的区间内，为下一步的精细定位打下了坚实的基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法5
1.1 材料 5
1.2 实验方法 5
1.2.1突变体农艺性状的测定5
1.2.2 突变体泡状细胞的结构分析5
1.2.3叶片卷叶指数的测定5
1.2.4叶绿素含量的测定5
1.2.5 总DNA提取（SDS法）5
1.2.6 SSR标记检测6
2 结果与分析7
2.1 卷叶突变体的表型7
2.2 叶片细胞形态学分析9
2.3 卷叶突变体基因的定位10
3讨论 11
3.1 水稻卷叶突变体 rl1的特性分析11
3.2 水稻卷叶突变体rl1控制基因的定位11
致谢11
参考文献12
水稻卷叶突变体的特性分析与基因定位
引言
引言
水稻叶片形态主要是通过叶长、叶宽、叶片卷曲度、比重叶、叶角披垂度和叶面积等形态学指标进行界定。水稻卷叶的形态学效应主要体现在两个方面：增加叶片的直立程度和降低叶片披垂度。在自然种群中，水稻的卷叶性状存在着丰富的资源。水稻叶片的卷曲类型而言,有正卷的（向叶近轴面卷曲），也有反卷的；前人的研究表明，有全株上下叶片均正卷（简称为全卷）的水稻材料，也有仅剑叶不同程度正卷（简称为剑卷 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
）的材料。平展叶对全卷叶为显性，剑卷叶对全卷叶为显性或不完全显性，RIL（卷叶指数）值小对RIL值大为显性或不完全显性，卷叶性状的遗传受一对主基因控制。剑卷型的遗传机理比较复杂，它与叶片全卷的水稻进行杂交，F2代剑卷∶全卷呈1∶1，推测剑卷型是平展向全卷发展的一种过渡类型。而事实上能够影响水稻叶片的卷曲与否的基因非常之多，而这些基因的作用机制也非常的复杂。从表型的角度上来看，目前将已发现的卷叶突变体主要分为两个大类：一类正卷叶：叶片向近轴面卷曲；另一类是反卷叶，叶片向远轴面卷曲。
水稻作为一种单子叶禾本科植物，其叶片的结构有着与双子叶植物叶片相区别的非常明显的特征。水稻的叶由叶片和叶鞘两部分组成，由于叶片相对于叶鞘在结构上要复杂很多，所以学界对叶片的结构研究较多。禾本科植物的叶片叶肉由排列紧密的薄壁细胞构成，叶脉由维管束构成。水稻叶片表皮细胞为一层，形状规则，主要由长细胞和短细胞两种细胞构成。在叶片的上表皮中还分布着一种大型细胞，被称为泡状细胞。泡状细胞的细胞壁比较薄，有着较大的液泡，通常几个排列在一起，分布在两个维管束之间。泡状细胞是水稻等禾本科植物所特有的一种抗性细胞，在抗旱方面有着特殊的作用。由于泡状细胞有着较大的充满水的液泡，因此在植株缺水时，泡状细胞会首先失水皱缩，最终导致叶片呈卷筒状卷曲，蒸腾作用减小，达到保水的目的。因此，有研究表明，泡状细胞与禾本科植物的叶片运动有着很紧密的联系。
人们通过对水稻资源的筛选，利用物理和化学手段诱变以及转基因等手段获得很多卷叶资源和突变体材料。以这些材料为介质，越来越多的控制水稻卷叶的基因位点被发现。随着对水稻卷叶的分子遗传学的研究深入，目前有很多的控制水稻卷叶的基因已经被克隆了出来[25]。
对这些基因的功能，学界也进行了相关的研究。综合前人的研究发现，决定卷叶性状的因素并不是单一的，卷叶的形成是体外的环境因子和植物体内严格的遗传调控系统相互作用的结果。近年来，随着分子生物学技术的快速发展和对于水稻的研究的日益深入，学界对水稻的卷叶形成机制有了相当的进展。根据已有研究结果，初步推测叶片发生卷曲，最有可能直接与叶片的近轴 Z 远轴化发育有关，包括 PHAN、HDZIPⅢ、YABBY和KANAD基因家族中的基因[23]。这些控制卷叶性状的基因在单子叶和双子叶作物中存在较高的保守性。下面列举前人已发现的一些与水稻卷叶性状有关的基因及其功能。
首先，ND1基因编码一个类纤维素合成酶蛋白D4。在ndl突变体中，细胞壁中充满高离子密度的材料的薄壁组织被发现异常增厚，最后导致叶片狭窄以及卷曲。RL14被发现编码一个2OGFe (II)氧化蛋白酶，在rl14突变体中，植株的次生细胞壁受到消极调控，同时植株的水分运输也受到消极影响。因此，植株叶片表皮的泡状细胞和气孔复合体开始萎缩，导致叶片卷曲。ADL1编码一个类钙蛋白酶半胱氨酸蛋白酶，它的突变导致HDZIPIII在成熟叶片中的表达模式的变化。通常，HDZIPII仅在在叶片的近轴面表达，并且是决定叶片的近轴层面的重要因子。但是，在ADL1基因的突变体中，本来仅在叶片近轴面生长的泡状细胞被发现长满了整个叶片的表面，并因此使得叶片近轴卷曲。ROC5基因编码一种包含在亮氨酸拉链域中的蛋白质，这个基因与拟南芥中的GLABRA2同源，并且曾经被证明能够消极调泡状细胞的发育。当ROC5基因被敲除，叶片表皮的泡状细胞的数量和面积都有明显上升，并导致叶片的卷曲。ACL1基因编码一种功能目前还未知的蛋白，在ACL1的突变体中，ACL1基因的表达显著地高于野生型。在这种突变体中，泡状细胞的数目和面积的增加同样是导致叶片卷曲的原因。在最近，编码一个具有锌指结构的转录因子 OsZHD1被报道，该基因突变会引起叶片的反卷[8]。
虽然目前已有十多个水稻卷叶相关基因被克隆，但人们对控制卷叶性状的遗传基础和分子机理还知之甚少。为了鉴定新的水稻卷叶相关基因，我们对Co60诱变的水稻日本晴突变体进行了卷叶性状筛选，结果分离到一个正卷叶突变体，命名为rl1。本项目通过连锁分析法等方法初步定位一个新的控制水稻卷叶性状的基因，并通过农艺学性状的指标测量，叶片叶绿素的含量分析，叶片细胞学结构的分析较全面的研究rl1这一新的突变体。
1 材料与方法
1．1 材料
野生型水稻日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica var. Nipponbare)。
从Co60诱变的日本晴突变体库中筛选到的一个水稻卷叶突变体rl1。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法5
1.1 材料 5
1.2 实验方法 5
1.2.1突变体农艺性状的测定5
1.2.2 突变体泡状细胞的结构分析5
1.2.3叶片卷叶指数的测定5
1.2.4叶绿素含量的测定5
1.2.5 总DNA提取（SDS法）5
1.2.6 SSR标记检测6
2 结果与分析7
2.1 卷叶突变体的表型7
2.2 叶片细胞形态学分析9
2.3 卷叶突变体基因的定位10
3讨论 11
3.1 水稻卷叶突变体 rl1的特性分析11
3.2 水稻卷叶突变体rl1控制基因的定位11
致谢11
参考文献12
水稻卷叶突变体的特性分析与基因定位
引言
引言
水稻叶片形态主要是通过叶长、叶宽、叶片卷曲度、比重叶、叶角披垂度和叶面积等形态学指标进行界定。水稻卷叶的形态学效应主要体现在两个方面：增加叶片的直立程度和降低叶片披垂度。在自然种群中，水稻的卷叶性状存在着丰富的资源。水稻叶片的卷曲类型而言,有正卷的（向叶近轴面卷曲），也有反卷的；前人的研究表明，有全株上下叶片均正卷（简称为全卷）的水稻材料，也有仅剑叶不同程度正卷（简称为剑卷 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
）的材料。平展叶对全卷叶为显性，剑卷叶对全卷叶为显性或不完全显性，RIL（卷叶指数）值小对RIL值大为显性或不完全显性，卷叶性状的遗传受一对主基因控制。剑卷型的遗传机理比较复杂，它与叶片全卷的水稻进行杂交，F2代剑卷∶全卷呈1∶1，推测剑卷型是平展向全卷发展的一种过渡类型。而事实上能够影响水稻叶片的卷曲与否的基因非常之多，而这些基因的作用机制也非常的复杂。从表型的角度上来看，目前将已发现的卷叶突变体主要分为两个大类：一类正卷叶：叶片向近轴面卷曲；另一类是反卷叶，叶片向远轴面卷曲。
水稻作为一种单子叶禾本科植物，其叶片的结构有着与双子叶植物叶片相区别的非常明显的特征。水稻的叶由叶片和叶鞘两部分组成，由于叶片相对于叶鞘在结构上要复杂很多，所以学界对叶片的结构研究较多。禾本科植物的叶片叶肉由排列紧密的薄壁细胞构成，叶脉由维管束构成。水稻叶片表皮细胞为一层，形状规则，主要由长细胞和短细胞两种细胞构成。在叶片的上表皮中还分布着一种大型细胞，被称为泡状细胞。泡状细胞的细胞壁比较薄，有着较大的液泡，通常几个排列在一起，分布在两个维管束之间。泡状细胞是水稻等禾本科植物所特有的一种抗性细胞，在抗旱方面有着特殊的作用。由于泡状细胞有着较大的充满水的液泡，因此在植株缺水时，泡状细胞会首先失水皱缩，最终导致叶片呈卷筒状卷曲，蒸腾作用减小，达到保水的目的。因此，有研究表明，泡状细胞与禾本科植物的叶片运动有着很紧密的联系。
人们通过对水稻资源的筛选，利用物理和化学手段诱变以及转基因等手段获得很多卷叶资源和突变体材料。以这些材料为介质，越来越多的控制水稻卷叶的基因位点被发现。随着对水稻卷叶的分子遗传学的研究深入，目前有很多的控制水稻卷叶的基因已经被克隆了出来[25]。
对这些基因的功能，学界也进行了相关的研究。综合前人的研究发现，决定卷叶性状的因素并不是单一的，卷叶的形成是体外的环境因子和植物体内严格的遗传调控系统相互作用的结果。近年来，随着分子生物学技术的快速发展和对于水稻的研究的日益深入，学界对水稻的卷叶形成机制有了相当的进展。根据已有研究结果，初步推测叶片发生卷曲，最有可能直接与叶片的近轴 Z 远轴化发育有关，包括 PHAN、HDZIPⅢ、YABBY和KANAD基因家族中的基因[23]。这些控制卷叶性状的基因在单子叶和双子叶作物中存在较高的保守性。下面列举前人已发现的一些与水稻卷叶性状有关的基因及其功能。
首先，ND1基因编码一个类纤维素合成酶蛋白D4。在ndl突变体中，细胞壁中充满高离子密度的材料的薄壁组织被发现异常增厚，最后导致叶片狭窄以及卷曲。RL14被发现编码一个2OGFe (II)氧化蛋白酶，在rl14突变体中，植株的次生细胞壁受到消极调控，同时植株的水分运输也受到消极影响。因此，植株叶片表皮的泡状细胞和气孔复合体开始萎缩，导致叶片卷曲。ADL1编码一个类钙蛋白酶半胱氨酸蛋白酶，它的突变导致HDZIPIII在成熟叶片中的表达模式的变化。通常，HDZIPII仅在在叶片的近轴面表达，并且是决定叶片的近轴层面的重要因子。但是，在ADL1基因的突变体中，本来仅在叶片近轴面生长的泡状细胞被发现长满了整个叶片的表面，并因此使得叶片近轴卷曲。ROC5基因编码一种包含在亮氨酸拉链域中的蛋白质，这个基因与拟南芥中的GLABRA2同源，并且曾经被证明能够消极调泡状细胞的发育。当ROC5基因被敲除，叶片表皮的泡状细胞的数量和面积都有明显上升，并导致叶片的卷曲。ACL1基因编码一种功能目前还未知的蛋白，在ACL1的突变体中，ACL1基因的表达显著地高于野生型。在这种突变体中，泡状细胞的数目和面积的增加同样是导致叶片卷曲的原因。在最近，编码一个具有锌指结构的转录因子 OsZHD1被报道，该基因突变会引起叶片的反卷[8]。
虽然目前已有十多个水稻卷叶相关基因被克隆，但人们对控制卷叶性状的遗传基础和分子机理还知之甚少。为了鉴定新的水稻卷叶相关基因，我们对Co60诱变的水稻日本晴突变体进行了卷叶性状筛选，结果分离到一个正卷叶突变体，命名为rl1。本项目通过连锁分析法等方法初步定位一个新的控制水稻卷叶性状的基因，并通过农艺学性状的指标测量，叶片叶绿素的含量分析，叶片细胞学结构的分析较全面的研究rl1这一新的突变体。
1 材料与方法
1．1 材料
野生型水稻日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica var. Nipponbare)。
从Co60诱变的日本晴突变体库中筛选到的一个水稻卷叶突变体rl1。
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