灵芝菌丝体氧化胁迫的缓解机制研究
：本实验通过在培养基中添加乙酸使灵芝菌丝体处于氧化胁迫环境中，并通过还原剂富氢水（HRW）预处理灵芝菌丝体，缓解其氧化胁迫程度。通过检测其生长速度、丙二醛（MDA）含量、ROS、超氧化物歧化酶（SOD）与过氧化氢酶(CAT)酶活，观察菌落及菌丝球生长形态，确定富氢水对于灵芝菌丝体氧化胁迫的缓解作用。探究富氢水对灵芝菌丝体氧化胁迫的缓解机制的影响，为探究灵芝菌丝体氧化还原代谢与相关基因表达及作用的关系做了铺垫。关键字：ROS；富氢水；灵芝；氧化胁迫Study on the mechanism of alleviating oxidative stress of Ganoderma lucidumBiology Class 111 Xu lingjunTutor Ren AngAbstract: In the study, we add acetic acid in the culture medium to make the Ganoderma lucidum in oxidative stress, and alleviate the degree of oxidation stress by pretreating Ganoderma lucidum with hydrogen-rich water(HRW). To ensure hydrogen-rich water can relieve the oxidative stress in Ganoderma lucidum, we detect growth rate, the content of MDA, the content of ROS, the activity of SOD and CAT, and observe the mycelial morphology and colony. Exploring the function that hydrogen-rich water in alleviating oxidative stress in Ganoderma lucidum, we pave the way for research the relationship in Ganoderma lucidum between redox metabolism and rela
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ted genetic expression and function.灵芝是一种大型真菌，属担子菌纲、多孔菌科、灵芝属（Ganoderma），是我国的一种传统的名贵药材，在民间有悠久而广泛的应用，中医学认为它起滋补强壮、扶正固本的作用。灵芝含有的复杂化学成分使其具有多方面的生理活性和药理活性，目前对于灵芝的研究多处于对灵芝三萜等药用成份的分析，灵芝三萜被广泛认为是灵芝最有效药理成分之一[1]。对于灵芝的基因测序与蛋白种类鉴定也基本完成。对于灵芝的基础研究，检测ROS含量、分离计算特定蛋白酶活、分离次级代谢产物及鉴定、进行基因干扰等技术也相对成熟，可以基本满足现在的需求。灵芝在自然生长和人工栽培中都易受到氧化胁迫，氧化胁迫会使灵芝菌丝体细胞受到氧损伤，会严重影响灵芝的生长发育。氧化胁迫是指细胞中存在高浓度的活性氧，如超氧化自由基， 羟基自由基和过氧化氢会氧化损伤生物分子，如脂质蛋白质和核酸等，破坏细胞的新陈代谢[2]。富氢水又叫水素水,即把通常溶解度极低的氢气通过特殊工艺溶解到水中，具有氢气浓度高，稳定性能好等特点。富氢水具有抗衰老、抗氧化、延缓细胞凋亡等作用。富氢水在当前研究历史中是一个新生事物，其研究历史并不长，对于富氢水的研究热自2007在《自然医学》第一篇氢气生物学论文开始[3]。被广泛研究用于代谢清除人体内的ROS。目前认为富氢水中所溶解的氢对于人体没有任何毒性，而且其对于人体有益，动植物是由细胞所组成的，疾病和衰老也是由于细胞老化或坏死所造成的，造成细胞病态或者老化的主要元凶就是过剩的ROS。在过去的研究中发现，富氢水具有广泛的还原性，可以还原ROS，清除体内过量的ROS。例如德国的诺尔登瑙洞窟神奇之水就带有非常丰富的氢，对老年痴呆、糖尿病、忧郁症、关节炎、皮肤病、过敏症、高血脂、心脑血管、动脉硬化、溃疡、脚气等都具有明显的疗效。本课题就是假定灵芝菌丝体受到乙酸引起的氧化胁迫，通过富氢水预处理，探究富氢水对于灵芝菌丝体处于氧化胁迫的环境中的效果。由于灵芝菌丝体在氧损伤程度不同的情况下，其生长速度、分叉程度、细胞内ROS含量、酶活性及次级代谢产物含量均有不同表现[4]，故通过测量记录菌落大小、ROS荧光染色、检测超氧化物歧化酶酶活与过氧化氢酶酶活及丙二醛与灵芝三萜含量，判断富氢水在灵芝菌丝体氧化还原代谢中的重要影响作用[5] [6]。1 材料与方法 1．1 材料1．1．1 供试菌株 WT菌种保存于大学生命科学学院应用真菌实验室。1．1．2 CYM培养基 液体发酵培养基：葡萄糖20 g 蛋白胨2 g 酵母膏2 g 七水硫酸镁0.5 g 磷酸氢二钾1.0 g 磷酸二氢钾 0.46 g，定容至1000 mL，在115 ℃下灭菌30 min后使用。固体培养基：将2 %琼脂加入液体培养基中，115 ℃下灭菌30 min后使用。1．1．3 主要试剂与溶液1．1．3．1 主要试剂 盐酸、高氯酸、95 %乙醇、无水乙醇、冰醋酸、ABTS、富氢水。1．1．3．2 主要溶液 CAT反应液：30 mlPBS+46μl 30 %过氧化氢；丙二醛反应液：质量分数0.6 %硫代巴比妥酸（TBA）：先加少量的氢氧化钠溶解，再用10%的三氯乙酸（TCA）定容；1．1．4 主要仪器设备 28 ℃恒温培养箱、烘箱、分析天平、天平、小型种子打碎机、摇床、超声波清洗仪、无菌超净台、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、722可见分光光度计、酶标仪、激光共聚焦显微镜、荧光定量PCR仪等。1．2 方法1．2．1 菌种平板活化 将斜面培养基保存的母种接种至平板培养基上，置于28 ℃恒温培养至菌丝长满平板。1．2．2 液体种子摇瓶培养 将100 mL CYM培养基装入250 mL三角瓶，选取长势较好的平板，用直径为6 mm的无菌打孔器在其上打孔，将12块平板母种接种于三角瓶中，放入150 r/min，28 ℃摇床培养7天。1．2．3 乙酸处理培养基的配制 取29 μl冰醋酸加入100 ml CYM培养基中，摇匀获得浓度为5 mM的经过乙酸处理的CYM培养基溶液，低温避光待用。1．2．4 富氢水制备通过氢生成气体发生器（shc-300；赛克赛斯氢能源有限公司，山东，中国）获取纯化后的氢气（99.99 %，v/v），把获取的氢气通入无菌去离子水中，速度为150 mL每分钟，通入 60分钟[3]。1．2．5 二次摇瓶发酵培养 小型种子打碎机将摇瓶培养的液体种子匀浆打碎，将100 mL液体培养基装入250 mL摇瓶，接种量10 %。放入150 r/min, 28 ℃摇床培养7天。1．2．6 灵芝菌丝生物量及生长情况测定 1．2．6 .1 菌丝生物量测定 发酵结束后，将菌丝球用20 目筛网收集起来，将培养基完全洗干净。将烘干至恒重的培养皿放入干燥器中冷却后称重，将洗净后的灵芝菌丝收集到编号培养皿中，放入60 ℃烘箱中烘干至恒重，称重，计算菌丝生物量。1．2．6 .1 生长情况测定 从CYM培养基装入250 mL三角瓶，选取长势较好的平板，用直径为6 mm的无菌打孔器在其上打孔，将菌块接种于含有乙酸处理的固体CYM培养基平板，放入28 ℃温箱培养5 天，每天记录菌丝直径。1．2．7 灵芝三萜含量的测定1．2．7．1 齐墩果酸标准曲线制备 分别将齐墩果酸标准液0、100、200、400、600、800、1000 μL缴入各试管，放入60 ℃烘箱中挥干乙醇。每管依次加入0.10 mL 95 %乙醇，0.20 mL香草醛，0.50 mL高氯酸，摇匀，60℃水浴20 min，取出后立即冰浴10 min，加5 mL冰醋酸，混匀后于550 nm处测定吸光值（以0号管为空白对照）。以OD550为纵坐标，齐墩果酸含量为横坐标（六个点为10、20、40、60、80、100 ug），在坐标轴上绘制标准曲线，利用标准曲线查出回归方程。1．2．7．2 样品制备 在25 mL容量瓶中加入烘干的菌丝粉0.50 g左右，加95%乙醇定容至刻度，用超声波破碎中超声破壁2.0 h后，取超声提取液4000 r/min离心10 min，取上清液备用。1．2．7．3 灵芝菌丝三萜含量测定 将提取的0.10 mL上清加入10 mL具塞试管中，依次加入0.20 mL香草醛，0.50 mL高氯酸，混匀，60 ℃水浴20 min，取出立即冷却，加入冰醋酸5.00 mL，混匀后于550 nm处测定吸光度[7]。1．2．8 CAT酶活性检测1．2．8．1 酶提取液制备 液氮速冷菌丝球，放在预冷研钵中，加入0.5 ml CAT提取缓冲液PBS在冰上研磨至液体，取1.5 ml离心管，12000 r/min在4 ℃下离心5 min，取上清液。1．2．8．2 CAT酶活性测定 每分钟在240 nm处吸光度变化0.001需要酶量为1酶活单位， 把100 μl样品放入3 ml CAT反应液中，记录在240 nm下40 s吸光度变化。1．2．9 SOD酶活性检测1．2．9.1 酶提取液制备 液氮速冷菌丝球，称量1克菌丝球加入3mL 0.05 mol/L pH 7.8磷酸钠缓冲液，加入少量石英砂，于冰浴中的研钵内研磨成匀浆，定容到5 mL 刻度离心管中，于12000 r/min冷冻离心5 min，回收上清液即为SOD酶粗提液。1．2．9．2 SOD酶活性测定 以50 %抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活力单位（U）。配制梯度浓度样品在波长为560 nm下测量吸光值，通过计算抑制百分比得到SOD酶活性。1．2．10 胞内ROS荧光检测菌丝的染色显微观察采用方法如下：将盖玻片灭菌后斜插入菌丝生长的培养基中，待菌丝爬到盖玻片。H2O2的荧光检测采用DCHF-DA（2′, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate）荧光探针结合荧光显微镜进行观察。将长有菌丝的盖玻片孵育于10 μM DCHF-DA持续15分钟，用10 mM 磷酸钠缓冲液，pH 7.5洗涤2-3次去除残余染液后置于荧光显微镜下观察。1．2．11 丙二醛含量检测1．2．11.1 样品提取液制备 称取干燥菌丝球1 g，加入2 ml 10 % TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8 ml TCA研磨，匀浆在4000 r/min离心10 min，上清液为样品提取液。1．2．11.2 丙二醛含量测定 吸取离心的上清液2 ml，以加入2 ml去离子水为空白对照组，分别加入2 ml 0.6 % TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15 min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450 nm波长下的吸光度。2 结果与分析2．1富氢水和乙酸对菌丝球形态的影响用单独添加5 % HRW处理、 5 mM HAc处理的发酵培养基培养的灵芝菌丝体，及HRW和HAc共同处理的菌丝作为实验组，把不添加HRW和HAc处理的菌丝作为空白对照组，收获培养后的菌丝球用于观察形态。实验结果如下图。图2-1 富氢水和乙酸对菌丝球形态的影响图2-1，野生型灵芝在未经HRW及HAc处理后的菌丝球菌丝呈放射状生长，形状极不规则；经过HAc单独处理后获取的菌丝球几乎成圆形， HAc单独处理使灵芝液体菌丝球形态发生明显变化，表明HAc单独处理可以影响灵芝菌丝的生长发育；经过HRW单独处理的菌丝球呈放射状菌丝，包围中间核，菌丝球形态无影响，说明HRW 单独处理对菌丝生长的影响不显著；使用HRW和HAc共同处理的菌丝获取的菌丝球，形态部分特征恢复，说明HRW预处理可以影响菌丝球在HAc处理后的生长及形态。2．2 富氢水和乙酸对ROS积累的影响我们准备好添加了如同观察菌丝球形态实验相同浓度的HRW及HAc的固体平板培养基，用直径为6 mm的无菌打孔器在菌丝生长旺盛的平板上打孔，获取大小相同的菌块，接种于平板培养基中央，插片获取的菌丝可以用于观察ROS荧光。ROS积累通常会引起菌丝细胞的氧损伤，故我们检测了丙二醛含量[6] [8]。实验结果如下图。图2-2 富氢水和乙酸对野生型灵芝细胞内ROS积累的影响我们使用ROS荧光染料DCFH-DA处理，在蓝色荧光下激发成绿光，绿光越强，表示ROS含量越多。图2-2 a 显示，相比于未经HRW和HAc处理的菌丝， HAc单独处理的样品荧光较强，说明HAc处理会促进ROS积累；HRW 单独处理后的菌丝荧光较未经处理的样品略弱，说明富氢水可以清除部分ROS积累；经HRW预处理后获取的菌丝荧光亮度明显低于未经预处理的样品，说明HRW预处理可以显著缓解由HAc引起的灵芝菌丝体细胞内的ROS激增。图2-2 b中，丙二醛是膜脂受活性氧作用产生的物质,测定其含量可以作为判断灵芝菌丝体氧损伤程度的指标。HAc单独处理可以显著提高灵芝菌丝体氧损伤程度；HRW单独处理与未经HRW和HAc处理的样品相比，丙二醛积累差异不显著，说明HRW单独处理对灵芝菌丝体未造成氧损伤；经HRW预处理的菌丝与HAc单独处理的样品对比，丙二醛的含量显著降低，说明经过HRW预处理的灵芝菌丝体与未经HRW处理的样品相比，在添加HAc后的CYM培养基中培养的菌丝氧损伤程度显著下降。2．3 富氢水和乙酸对次级代谢产物的影响我们把发酵培养获取的菌丝球用液氮速冻，研磨至匀浆后烘干，收集烘干后的粉末，用于检测次级代谢产物的含量，推断HRW和HAc对次级代谢产物的影响。我们以灵芝三萜为例，实验结果如下图。图2-3 富氢水和乙酸对次级代谢产物含量的影响图2-3，用经过HAc单独处理的菌丝体获取的样品，检测出的三萜含量显著高于未经HAc处理的样品，说明HAc处理可以提高灵芝菌丝体的次级代谢；经HRW单独处理的菌丝与未经HRW和HAc处理的样品对比，三萜含量变化不显著，说明HRW单独处理灵芝菌丝体时，对灵芝菌丝体细胞次级代谢的影响不显著；经HRW预处理与未经HRW处理的菌丝相比，在用HAc处理后检测发现，次级代谢产物含量显著降低，HRW预处理对灵芝菌丝体细胞次级代谢产生了影响，说明HRW预处理可以显著缓解由HAc引起的灵芝菌丝体次级代谢产物含量的提高[9]。2．4 富氢水和乙酸对酶活性的影响通过上述实验，我们认为HRW可以缓解由HAc引起的灵芝菌丝体氧化胁迫，并推测HRW的缓解作用与灵芝菌丝体细胞内的氧化还原酶有关。为了验证HRW、HAc与酶活性的关系，我们检测了不同处理下的两种酶的活性，实验结果如下图。图2-4 富氢水和乙酸对酶活性变化的影响图2-4 a，是指超氧化物歧化酶在不同条件下的酶活性变化，图2-10 b，是指过氧化氢酶在不同条件下的酶活性变化。在不添加HAc的情况下，可以发现HRW对于超氧化物歧化酶与过氧化氢酶酶活影响不显著；HAc可以引起氧化胁迫，在添加HAc后超氧化物歧化酶酶活显著提高，而过氧化氢酶酶活显著降低；实验可知，用HRW预处理后的灵芝菌丝体，在添加HAc后，酶活性显著改变，其中超氧化物歧化酶酶活与未处理时没有显著差别，而过氧化氢酶酶活仍比未处理时显著偏低，说明HRW可以缓解由HAc引起的灵芝菌丝体细胞氧化胁迫，且灵芝菌丝体氧损伤程度与超氧化物歧化酶酶活关系更为密切；而用HRW预处理后，过氧化氢酶酶活显著提高。本实验通过HRW预处理灵芝菌丝体，检测其受到氧化胁迫并缓解后的酶活性大小变化，可推出HRW对于氧化胁迫的缓解作用是由于其可以影响灵芝菌丝体细胞中氧化还原平衡过程中的相关酶活性，然后对氧化胁迫产生缓解作用。3 讨论3．1 HRW对灵芝菌丝体氧化胁迫的缓解作用，可能的机制是HRW可以提高灵芝菌丝体细胞中的氧化还原酶活性。实验中主要检测了用HAc处理的CYM培养基培养灵芝菌丝体的ROS、丙二醛含量、超氧化物歧化酶与过氧化氢酶酶活，通过对经HRW预处理的灵芝菌丝体样品与未经HRW预处理的灵芝菌丝体样品指标含量进行对比，发现用经过HAc处理后，经HRW预处理的样品更接近于未经处理的野生型灵芝菌丝体，而ROS、丙二醛、三萜含量与超氧化物歧化酶与过氧化氢酶酶活等指标仍与未经处理的样品相应指标有差异，例如ROS检测仍明显较正常生长的绿色荧光明亮，说明表现型是在众多指标及其一定范围内综合的表现。ROS 积累较多，会引起灵芝菌丝体细胞氧损伤，且呈正相关，可以显著降低灵芝菌丝体整体生长速度，菌丝球呈正圆形；而经HRW预处理的菌丝球形状呈放射状，说明经HRW处理的菌丝细胞在ROS积累量高时，可以显著促进菌丝生长，在ROS积累量低时，对菌丝生长影响不显著。灵芝菌丝体细胞的氧化还原水平由环境和自身氧化还原代谢直接影响，而自身氧化还原代谢由各种氧化还原酶控制。本实验通过选取两种特征酶，即超氧化物歧化酶与过氧化氢酶，发现HRW预处理可以降低超氧化物歧化酶在菌丝体在氧化胁迫环境中的活性，使其恢复正常水平。HRW显著恢复了过氧化氢酶的活性。可以推测HRW可以影响过氧化氢酶基因表达，以促进其酶活性提高。3．2 本实验对于灵芝菌丝体氧化胁迫的缓解机制在基因水平探索研究的作用通过实验，我们确定了不同氧化还原酶在灵芝菌丝体处于氧化胁迫环境中时，活性变化不一定都相同。本实验中，过氧化氢酶活性在氧化胁迫环境中显著降低，可以推测灵芝菌丝体细胞受到氧损伤时，过氧化氢酶基因表达受阻，导致过氧化氢酶活性显著下降；而经HRW预处理后，过氧化氢酶活性获得显著恢复，可以推测HRW可以促进过氧化氢酶基因表达，但受到的氧损伤依然对其有影响。对于灵芝菌丝体氧化胁迫的缓解机制在基因水平探索研究中，我们可以控制相关基因的表达，通过表现型与检测指标的变化，判断富氢水的缓解作用机制、寻找表达关键酶的基因对酶促反应缓解氧化胁迫的影响及作用机制。特别感谢：首先我要感谢大学、生命科学学院对我的培养和关怀，使我在大学四年不断成长，感受到家的温暖。生科院给我提供了一个良好平台以及许多接触社会接触科研的机会，比如野外实习、企业实习、科研训练、SRT等，让我在学习工作中不断进步，同时寻找自己兴趣的方向。在这大学四年的学习中，总体是充实而又快乐的。寓教于乐的学习过程，不仅让我获得诸多知识，还拥有了许多难忘的回忆。黄山一行，于我而言，不仅仅是一次野外实习的学习机会，还是我身处自然，感知自己心灵成长的一次试炼。在翠绿而又一望无际的深山之中，个人无疑是渺小的，但同时我们又在积极的做着我们该做的事情，我们在努力的认知着这个神秘的世界，对我们能感受到的一切事物进行着标记，而我们所学习的就是去更准确的认识标记这个世界，让后人减少迷茫。实践的机会总是好的，实验课教会了我们大部分的实验技能，并让我们初步获得了动手操作的能力，可以亲眼看见课本上诸多著名的实验是如何发生的、是怎样的过程与结果，而不仅仅是通过视频甚至是想象去认识我们的知识。帮助我们更牢固的掌握了我们虽然短浅，却十分重要的基础理论知识。这也让我对科学和研究的崇拜一步一步提升，科学总是神秘而又美好的，投身其中，我也可以更好的认识自己，帮助自己更好的生活。最后我要感谢我的父母和我身边支持我的人。为人父母不易，我作为子女，上学期间并不能贴补家用，反而生活支出连年提高，加重了父母的负担，但是却不能很好为他们解决困难，我应该更加努力，提高自己。不过，正是有了多人的帮助，我才能更好的完成学业。参考文献：[1] 牛君仿，方正等。灵芝有效化学成分研究进展。河北农业大报：1000-1573（2002）S1-0051-04[2] 薛鑫，张芊，吴金霞．植物体内活性氧的研究及其在植物抗逆方面的应用[J]．生物技术通报，2013(10)[3] Weiti Cuia, Cunyi Gaoa, Peng Fanga, Guoqing Linb, Wenbiao Shen. Alleviation of cadmium toxicity in Medicago sativa by hydrogen-rich Water. Journal of Hazardous Materials. [J], 2013:715-724.[4] 景红娟，李翠香，王俊峰，郭晓东，王石雷，田航宇，王乐飞．Noxs生成的活性氧对根生长和发育调控的研究进展[J]．植物生理学报，2013，49(5)：417-424[5] 赵晓玉，薛娴，卢存福，林金星，万迎朗．植物中活性氧信号转导及其检测方法研究进展[J]．电子显微学报，2014，33(2)[6] 陆朝晖. 有氧运动与氢水对非酒精性脂肪肝SOD&MDA的影响[D].上海体育学院,2013.[7] Fang Q. H., J. J. Zhong, Effect of initial pH on production of ganoderic acid and polysaccharide by submerged fermentation of Ganoderma lucidum[J ], Proc. Biochem., 2002, 37:769–774[8] Hiscock S,Bright J,McInnis S M,et a1．Signaling on the stigma：Potential new roles for ROS and NO in plant cell signaling[J]．Plant Signal Behav，2007，2(1)：23 —24．[9]Wang MY, Liu Q , Che QM, et al . Effects of triterpen oidsfrom Ganoderma lucidum Karst on three different experimental liver injury models in mice [J ] . Acta Pharm Sin , 2000, 35 (5) :326 - 329.
目录
引言 3
1 材料与方法 4
1．1 材料 4
1．1．1 供试菌株 4
1．1．2 CYM培养基 4
1．1．3 主要试剂与溶液 4
1．1．4 主要仪器设备 4
1．2 方法 5
1．2．1 菌种平板活化 5
1．2．2 液体种子摇瓶培养 5
1．2．3 乙酸处理培养基的配制 5
1．2．4 富氢水制备 5
1．2．5 二次摇瓶发酵培养 5
1．2．6 灵芝菌丝生物量及生长情况测定 5
1．2．7 灵芝三萜含量的测定 5
1．2．8 CAT酶活性检测 6
1．2．9 SOD酶活性检测 6
1．2．10 胞内ROS荧光检测 6
1．2．11 丙二醛含量检测 6
2 结果与分析 7
2．1 富氢水和乙酸对菌丝球形态的影响 7
2．2 富氢水和乙酸对ROS积累的影响 7
2．3 富氢水和乙酸对次级代谢产物的影响 8
2．4 富氢水和乙酸对酶活性的影响 9
3 讨论 10
3．1 HRW对灵芝菌丝体氧化胁迫的缓解作用，可能的机制是HRW可以提高灵芝菌丝体细胞中的氧化还原酶活性。 10
3．2 本实验对于灵芝菌丝体氧化胁迫的缓解机制在基因水平探索研究的作用 10
特别感谢 11
参考文献： 12
灵芝菌丝体氧化胁迫的缓解机制研究
生物科学111班 许灵俊
引言
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
ted genetic expression and function.灵芝是一种大型真菌，属担子菌纲、多孔菌科、灵芝属（Ganoderma），是我国的一种传统的名贵药材，在民间有悠久而广泛的应用，中医学认为它起滋补强壮、扶正固本的作用。灵芝含有的复杂化学成分使其具有多方面的生理活性和药理活性，目前对于灵芝的研究多处于对灵芝三萜等药用成份的分析，灵芝三萜被广泛认为是灵芝最有效药理成分之一[1]。对于灵芝的基因测序与蛋白种类鉴定也基本完成。对于灵芝的基础研究，检测ROS含量、分离计算特定蛋白酶活、分离次级代谢产物及鉴定、进行基因干扰等技术也相对成熟，可以基本满足现在的需求。灵芝在自然生长和人工栽培中都易受到氧化胁迫，氧化胁迫会使灵芝菌丝体细胞受到氧损伤，会严重影响灵芝的生长发育。氧化胁迫是指细胞中存在高浓度的活性氧，如超氧化自由基， 羟基自由基和过氧化氢会氧化损伤生物分子，如脂质蛋白质和核酸等，破坏细胞的新陈代谢[2]。富氢水又叫水素水,即把通常溶解度极低的氢气通过特殊工艺溶解到水中，具有氢气浓度高，稳定性能好等特点。富氢水具有抗衰老、抗氧化、延缓细胞凋亡等作用。富氢水在当前研究历史中是一个新生事物，其研究历史并不长，对于富氢水的研究热自2007在《自然医学》第一篇氢气生物学论文开始[3]。被广泛研究用于代谢清除人体内的ROS。目前认为富氢水中所溶解的氢对于人体没有任何毒性，而且其对于人体有益，动植物是由细胞所组成的，疾病和衰老也是由于细胞老化或坏死所造成的，造成细胞病态或者老化的主要元凶就是过剩的ROS。在过去的研究中发现，富氢水具有广泛的还原性，可以还原ROS，清除体内过量的ROS。例如德国的诺尔登瑙洞窟神奇之水就带有非常丰富的氢，对老年痴呆、糖尿病、忧郁症、关节炎、皮肤病、过敏症、高血脂、心脑血管、动脉硬化、溃疡、脚气等都具有明显的疗效。本课题就是假定灵芝菌丝体受到乙酸引起的氧化胁迫，通过富氢水预处理，探究富氢水对于灵芝菌丝体处于氧化胁迫的环境中的效果。由于灵芝菌丝体在氧损伤程度不同的情况下，其生长速度、分叉程度、细胞内ROS含量、酶活性及次级代谢产物含量均有不同表现[4]，故通过测量记录菌落大小、ROS荧光染色、检测超氧化物歧化酶酶活与过氧化氢酶酶活及丙二醛与灵芝三萜含量，判断富氢水在灵芝菌丝体氧化还原代谢中的重要影响作用[5] [6]。1 材料与方法 1．1 材料1．1．1 供试菌株 WT菌种保存于大学生命科学学院应用真菌实验室。1．1．2 CYM培养基 液体发酵培养基：葡萄糖20 g 蛋白胨2 g 酵母膏2 g 七水硫酸镁0.5 g 磷酸氢二钾1.0 g 磷酸二氢钾 0.46 g，定容至1000 mL，在115 ℃下灭菌30 min后使用。固体培养基：将2 %琼脂加入液体培养基中，115 ℃下灭菌30 min后使用。1．1．3 主要试剂与溶液1．1．3．1 主要试剂 盐酸、高氯酸、95 %乙醇、无水乙醇、冰醋酸、ABTS、富氢水。1．1．3．2 主要溶液 CAT反应液：30 mlPBS+46μl 30 %过氧化氢；丙二醛反应液：质量分数0.6 %硫代巴比妥酸（TBA）：先加少量的氢氧化钠溶解，再用10%的三氯乙酸（TCA）定容；1．1．4 主要仪器设备 28 ℃恒温培养箱、烘箱、分析天平、天平、小型种子打碎机、摇床、超声波清洗仪、无菌超净台、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、722可见分光光度计、酶标仪、激光共聚焦显微镜、荧光定量PCR仪等。1．2 方法1．2．1 菌种平板活化 将斜面培养基保存的母种接种至平板培养基上，置于28 ℃恒温培养至菌丝长满平板。1．2．2 液体种子摇瓶培养 将100 mL CYM培养基装入250 mL三角瓶，选取长势较好的平板，用直径为6 mm的无菌打孔器在其上打孔，将12块平板母种接种于三角瓶中，放入150 r/min，28 ℃摇床培养7天。1．2．3 乙酸处理培养基的配制 取29 μl冰醋酸加入100 ml CYM培养基中，摇匀获得浓度为5 mM的经过乙酸处理的CYM培养基溶液，低温避光待用。1．2．4 富氢水制备通过氢生成气体发生器（shc-300；赛克赛斯氢能源有限公司，山东，中国）获取纯化后的氢气（99.99 %，v/v），把获取的氢气通入无菌去离子水中，速度为150 mL每分钟，通入 60分钟[3]。1．2．5 二次摇瓶发酵培养 小型种子打碎机将摇瓶培养的液体种子匀浆打碎，将100 mL液体培养基装入250 mL摇瓶，接种量10 %。放入150 r/min, 28 ℃摇床培养7天。1．2．6 灵芝菌丝生物量及生长情况测定 1．2．6 .1 菌丝生物量测定 发酵结束后，将菌丝球用20 目筛网收集起来，将培养基完全洗干净。将烘干至恒重的培养皿放入干燥器中冷却后称重，将洗净后的灵芝菌丝收集到编号培养皿中，放入60 ℃烘箱中烘干至恒重，称重，计算菌丝生物量。1．2．6 .1 生长情况测定 从CYM培养基装入250 mL三角瓶，选取长势较好的平板，用直径为6 mm的无菌打孔器在其上打孔，将菌块接种于含有乙酸处理的固体CYM培养基平板，放入28 ℃温箱培养5 天，每天记录菌丝直径。1．2．7 灵芝三萜含量的测定1．2．7．1 齐墩果酸标准曲线制备 分别将齐墩果酸标准液0、100、200、400、600、800、1000 μL缴入各试管，放入60 ℃烘箱中挥干乙醇。每管依次加入0.10 mL 95 %乙醇，0.20 mL香草醛，0.50 mL高氯酸，摇匀，60℃水浴20 min，取出后立即冰浴10 min，加5 mL冰醋酸，混匀后于550 nm处测定吸光值（以0号管为空白对照）。以OD550为纵坐标，齐墩果酸含量为横坐标（六个点为10、20、40、60、80、100 ug），在坐标轴上绘制标准曲线，利用标准曲线查出回归方程。1．2．7．2 样品制备 在25 mL容量瓶中加入烘干的菌丝粉0.50 g左右，加95%乙醇定容至刻度，用超声波破碎中超声破壁2.0 h后，取超声提取液4000 r/min离心10 min，取上清液备用。1．2．7．3 灵芝菌丝三萜含量测定 将提取的0.10 mL上清加入10 mL具塞试管中，依次加入0.20 mL香草醛，0.50 mL高氯酸，混匀，60 ℃水浴20 min，取出立即冷却，加入冰醋酸5.00 mL，混匀后于550 nm处测定吸光度[7]。1．2．8 CAT酶活性检测1．2．8．1 酶提取液制备 液氮速冷菌丝球，放在预冷研钵中，加入0.5 ml CAT提取缓冲液PBS在冰上研磨至液体，取1.5 ml离心管，12000 r/min在4 ℃下离心5 min，取上清液。1．2．8．2 CAT酶活性测定 每分钟在240 nm处吸光度变化0.001需要酶量为1酶活单位， 把100 μl样品放入3 ml CAT反应液中，记录在240 nm下40 s吸光度变化。1．2．9 SOD酶活性检测1．2．9.1 酶提取液制备 液氮速冷菌丝球，称量1克菌丝球加入3mL 0.05 mol/L pH 7.8磷酸钠缓冲液，加入少量石英砂，于冰浴中的研钵内研磨成匀浆，定容到5 mL 刻度离心管中，于12000 r/min冷冻离心5 min，回收上清液即为SOD酶粗提液。1．2．9．2 SOD酶活性测定 以50 %抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活力单位（U）。配制梯度浓度样品在波长为560 nm下测量吸光值，通过计算抑制百分比得到SOD酶活性。1．2．10 胞内ROS荧光检测菌丝的染色显微观察采用方法如下：将盖玻片灭菌后斜插入菌丝生长的培养基中，待菌丝爬到盖玻片。H2O2的荧光检测采用DCHF-DA（2′, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate）荧光探针结合荧光显微镜进行观察。将长有菌丝的盖玻片孵育于10 μM DCHF-DA持续15分钟，用10 mM 磷酸钠缓冲液，pH 7.5洗涤2-3次去除残余染液后置于荧光显微镜下观察。1．2．11 丙二醛含量检测1．2．11.1 样品提取液制备 称取干燥菌丝球1 g，加入2 ml 10 % TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8 ml TCA研磨，匀浆在4000 r/min离心10 min，上清液为样品提取液。1．2．11.2 丙二醛含量测定 吸取离心的上清液2 ml，以加入2 ml去离子水为空白对照组，分别加入2 ml 0.6 % TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15 min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450 nm波长下的吸光度。2 结果与分析2．1富氢水和乙酸对菌丝球形态的影响用单独添加5 % HRW处理、 5 mM HAc处理的发酵培养基培养的灵芝菌丝体，及HRW和HAc共同处理的菌丝作为实验组，把不添加HRW和HAc处理的菌丝作为空白对照组，收获培养后的菌丝球用于观察形态。实验结果如下图。图2-1 富氢水和乙酸对菌丝球形态的影响图2-1，野生型灵芝在未经HRW及HAc处理后的菌丝球菌丝呈放射状生长，形状极不规则；经过HAc单独处理后获取的菌丝球几乎成圆形， HAc单独处理使灵芝液体菌丝球形态发生明显变化，表明HAc单独处理可以影响灵芝菌丝的生长发育；经过HRW单独处理的菌丝球呈放射状菌丝，包围中间核，菌丝球形态无影响，说明HRW 单独处理对菌丝生长的影响不显著；使用HRW和HAc共同处理的菌丝获取的菌丝球，形态部分特征恢复，说明HRW预处理可以影响菌丝球在HAc处理后的生长及形态。2．2 富氢水和乙酸对ROS积累的影响我们准备好添加了如同观察菌丝球形态实验相同浓度的HRW及HAc的固体平板培养基，用直径为6 mm的无菌打孔器在菌丝生长旺盛的平板上打孔，获取大小相同的菌块，接种于平板培养基中央，插片获取的菌丝可以用于观察ROS荧光。ROS积累通常会引起菌丝细胞的氧损伤，故我们检测了丙二醛含量[6] [8]。实验结果如下图。图2-2 富氢水和乙酸对野生型灵芝细胞内ROS积累的影响我们使用ROS荧光染料DCFH-DA处理，在蓝色荧光下激发成绿光，绿光越强，表示ROS含量越多。图2-2 a 显示，相比于未经HRW和HAc处理的菌丝， HAc单独处理的样品荧光较强，说明HAc处理会促进ROS积累；HRW 单独处理后的菌丝荧光较未经处理的样品略弱，说明富氢水可以清除部分ROS积累；经HRW预处理后获取的菌丝荧光亮度明显低于未经预处理的样品，说明HRW预处理可以显著缓解由HAc引起的灵芝菌丝体细胞内的ROS激增。图2-2 b中，丙二醛是膜脂受活性氧作用产生的物质,测定其含量可以作为判断灵芝菌丝体氧损伤程度的指标。HAc单独处理可以显著提高灵芝菌丝体氧损伤程度；HRW单独处理与未经HRW和HAc处理的样品相比，丙二醛积累差异不显著，说明HRW单独处理对灵芝菌丝体未造成氧损伤；经HRW预处理的菌丝与HAc单独处理的样品对比，丙二醛的含量显著降低，说明经过HRW预处理的灵芝菌丝体与未经HRW处理的样品相比，在添加HAc后的CYM培养基中培养的菌丝氧损伤程度显著下降。2．3 富氢水和乙酸对次级代谢产物的影响我们把发酵培养获取的菌丝球用液氮速冻，研磨至匀浆后烘干，收集烘干后的粉末，用于检测次级代谢产物的含量，推断HRW和HAc对次级代谢产物的影响。我们以灵芝三萜为例，实验结果如下图。图2-3 富氢水和乙酸对次级代谢产物含量的影响图2-3，用经过HAc单独处理的菌丝体获取的样品，检测出的三萜含量显著高于未经HAc处理的样品，说明HAc处理可以提高灵芝菌丝体的次级代谢；经HRW单独处理的菌丝与未经HRW和HAc处理的样品对比，三萜含量变化不显著，说明HRW单独处理灵芝菌丝体时，对灵芝菌丝体细胞次级代谢的影响不显著；经HRW预处理与未经HRW处理的菌丝相比，在用HAc处理后检测发现，次级代谢产物含量显著降低，HRW预处理对灵芝菌丝体细胞次级代谢产生了影响，说明HRW预处理可以显著缓解由HAc引起的灵芝菌丝体次级代谢产物含量的提高[9]。2．4 富氢水和乙酸对酶活性的影响通过上述实验，我们认为HRW可以缓解由HAc引起的灵芝菌丝体氧化胁迫，并推测HRW的缓解作用与灵芝菌丝体细胞内的氧化还原酶有关。为了验证HRW、HAc与酶活性的关系，我们检测了不同处理下的两种酶的活性，实验结果如下图。图2-4 富氢水和乙酸对酶活性变化的影响图2-4 a，是指超氧化物歧化酶在不同条件下的酶活性变化，图2-10 b，是指过氧化氢酶在不同条件下的酶活性变化。在不添加HAc的情况下，可以发现HRW对于超氧化物歧化酶与过氧化氢酶酶活影响不显著；HAc可以引起氧化胁迫，在添加HAc后超氧化物歧化酶酶活显著提高，而过氧化氢酶酶活显著降低；实验可知，用HRW预处理后的灵芝菌丝体，在添加HAc后，酶活性显著改变，其中超氧化物歧化酶酶活与未处理时没有显著差别，而过氧化氢酶酶活仍比未处理时显著偏低，说明HRW可以缓解由HAc引起的灵芝菌丝体细胞氧化胁迫，且灵芝菌丝体氧损伤程度与超氧化物歧化酶酶活关系更为密切；而用HRW预处理后，过氧化氢酶酶活显著提高。本实验通过HRW预处理灵芝菌丝体，检测其受到氧化胁迫并缓解后的酶活性大小变化，可推出HRW对于氧化胁迫的缓解作用是由于其可以影响灵芝菌丝体细胞中氧化还原平衡过程中的相关酶活性，然后对氧化胁迫产生缓解作用。3 讨论3．1 HRW对灵芝菌丝体氧化胁迫的缓解作用，可能的机制是HRW可以提高灵芝菌丝体细胞中的氧化还原酶活性。实验中主要检测了用HAc处理的CYM培养基培养灵芝菌丝体的ROS、丙二醛含量、超氧化物歧化酶与过氧化氢酶酶活，通过对经HRW预处理的灵芝菌丝体样品与未经HRW预处理的灵芝菌丝体样品指标含量进行对比，发现用经过HAc处理后，经HRW预处理的样品更接近于未经处理的野生型灵芝菌丝体，而ROS、丙二醛、三萜含量与超氧化物歧化酶与过氧化氢酶酶活等指标仍与未经处理的样品相应指标有差异，例如ROS检测仍明显较正常生长的绿色荧光明亮，说明表现型是在众多指标及其一定范围内综合的表现。ROS 积累较多，会引起灵芝菌丝体细胞氧损伤，且呈正相关，可以显著降低灵芝菌丝体整体生长速度，菌丝球呈正圆形；而经HRW预处理的菌丝球形状呈放射状，说明经HRW处理的菌丝细胞在ROS积累量高时，可以显著促进菌丝生长，在ROS积累量低时，对菌丝生长影响不显著。灵芝菌丝体细胞的氧化还原水平由环境和自身氧化还原代谢直接影响，而自身氧化还原代谢由各种氧化还原酶控制。本实验通过选取两种特征酶，即超氧化物歧化酶与过氧化氢酶，发现HRW预处理可以降低超氧化物歧化酶在菌丝体在氧化胁迫环境中的活性，使其恢复正常水平。HRW显著恢复了过氧化氢酶的活性。可以推测HRW可以影响过氧化氢酶基因表达，以促进其酶活性提高。3．2 本实验对于灵芝菌丝体氧化胁迫的缓解机制在基因水平探索研究的作用通过实验，我们确定了不同氧化还原酶在灵芝菌丝体处于氧化胁迫环境中时，活性变化不一定都相同。本实验中，过氧化氢酶活性在氧化胁迫环境中显著降低，可以推测灵芝菌丝体细胞受到氧损伤时，过氧化氢酶基因表达受阻，导致过氧化氢酶活性显著下降；而经HRW预处理后，过氧化氢酶活性获得显著恢复，可以推测HRW可以促进过氧化氢酶基因表达，但受到的氧损伤依然对其有影响。对于灵芝菌丝体氧化胁迫的缓解机制在基因水平探索研究中，我们可以控制相关基因的表达，通过表现型与检测指标的变化，判断富氢水的缓解作用机制、寻找表达关键酶的基因对酶促反应缓解氧化胁迫的影响及作用机制。特别感谢：首先我要感谢大学、生命科学学院对我的培养和关怀，使我在大学四年不断成长，感受到家的温暖。生科院给我提供了一个良好平台以及许多接触社会接触科研的机会，比如野外实习、企业实习、科研训练、SRT等，让我在学习工作中不断进步，同时寻找自己兴趣的方向。在这大学四年的学习中，总体是充实而又快乐的。寓教于乐的学习过程，不仅让我获得诸多知识，还拥有了许多难忘的回忆。黄山一行，于我而言，不仅仅是一次野外实习的学习机会，还是我身处自然，感知自己心灵成长的一次试炼。在翠绿而又一望无际的深山之中，个人无疑是渺小的，但同时我们又在积极的做着我们该做的事情，我们在努力的认知着这个神秘的世界，对我们能感受到的一切事物进行着标记，而我们所学习的就是去更准确的认识标记这个世界，让后人减少迷茫。实践的机会总是好的，实验课教会了我们大部分的实验技能，并让我们初步获得了动手操作的能力，可以亲眼看见课本上诸多著名的实验是如何发生的、是怎样的过程与结果，而不仅仅是通过视频甚至是想象去认识我们的知识。帮助我们更牢固的掌握了我们虽然短浅，却十分重要的基础理论知识。这也让我对科学和研究的崇拜一步一步提升，科学总是神秘而又美好的，投身其中，我也可以更好的认识自己，帮助自己更好的生活。最后我要感谢我的父母和我身边支持我的人。为人父母不易，我作为子女，上学期间并不能贴补家用，反而生活支出连年提高，加重了父母的负担，但是却不能很好为他们解决困难，我应该更加努力，提高自己。不过，正是有了多人的帮助，我才能更好的完成学业。参考文献：[1] 牛君仿，方正等。灵芝有效化学成分研究进展。河北农业大报：1000-1573（2002）S1-0051-04[2] 薛鑫，张芊，吴金霞．植物体内活性氧的研究及其在植物抗逆方面的应用[J]．生物技术通报，2013(10)[3] Weiti Cuia, Cunyi Gaoa, Peng Fanga, Guoqing Linb, Wenbiao Shen. Alleviation of cadmium toxicity in Medicago sativa by hydrogen-rich Water. Journal of Hazardous Materials. [J], 2013:715-724.[4] 景红娟，李翠香，王俊峰，郭晓东，王石雷，田航宇，王乐飞．Noxs生成的活性氧对根生长和发育调控的研究进展[J]．植物生理学报，2013，49(5)：417-424[5] 赵晓玉，薛娴，卢存福，林金星，万迎朗．植物中活性氧信号转导及其检测方法研究进展[J]．电子显微学报，2014，33(2)[6] 陆朝晖. 有氧运动与氢水对非酒精性脂肪肝SOD&MDA的影响[D].上海体育学院,2013.[7] Fang Q. H., J. J. Zhong, Effect of initial pH on production of ganoderic acid and polysaccharide by submerged fermentation of Ganoderma lucidum[J ], Proc. Biochem., 2002, 37:769–774[8] Hiscock S,Bright J,McInnis S M,et a1．Signaling on the stigma：Potential new roles for ROS and NO in plant cell signaling[J]．Plant Signal Behav，2007，2(1)：23 —24．[9]Wang MY, Liu Q , Che QM, et al . Effects of triterpen oidsfrom Ganoderma lucidum Karst on three different experimental liver injury models in mice [J ] . Acta Pharm Sin , 2000, 35 (5) :326 - 329.
目录
引言 3
1 材料与方法 4
1．1 材料 4
1．1．1 供试菌株 4
1．1．2 CYM培养基 4
1．1．3 主要试剂与溶液 4
1．1．4 主要仪器设备 4
1．2 方法 5
1．2．1 菌种平板活化 5
1．2．2 液体种子摇瓶培养 5
1．2．3 乙酸处理培养基的配制 5
1．2．4 富氢水制备 5
1．2．5 二次摇瓶发酵培养 5
1．2．6 灵芝菌丝生物量及生长情况测定 5
1．2．7 灵芝三萜含量的测定 5
1．2．8 CAT酶活性检测 6
1．2．9 SOD酶活性检测 6
1．2．10 胞内ROS荧光检测 6
1．2．11 丙二醛含量检测 6
2 结果与分析 7
2．1 富氢水和乙酸对菌丝球形态的影响 7
2．2 富氢水和乙酸对ROS积累的影响 7
2．3 富氢水和乙酸对次级代谢产物的影响 8
2．4 富氢水和乙酸对酶活性的影响 9
3 讨论 10
3．1 HRW对灵芝菌丝体氧化胁迫的缓解作用，可能的机制是HRW可以提高灵芝菌丝体细胞中的氧化还原酶活性。 10
3．2 本实验对于灵芝菌丝体氧化胁迫的缓解机制在基因水平探索研究的作用 10
特别感谢 11
参考文献： 12
灵芝菌丝体氧化胁迫的缓解机制研究
生物科学111班 许灵俊
引言
引言
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