激发子psxeg1蛋白原核表达的摸索
：大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆疫霉根腐病是威胁全世界大豆生产毁灭性的病害之一，每年给全世界的大豆生产带来巨大经济损失。植物先天免疫系统由两种主要的免疫反应组成，包括植物识别病原相关模式分子(pathogen/microbe-associated molecular patterns, PAMPs/MAMPs)引起的PTI(PAMP Triggered Immunity)和识别效应分子引起的ETI(Effector Triggered Immunity)。植物病原菌的病原相关模式分子是一类重要的信号分子，以PTI为基础的抗病性具有广谱、稳定和持久的特点，了解植物识别病原相关模式分子的分子机制对病害的防治具有非常重要的意义。本研究中的PsXEG1是一个新发现的疫霉菌病原相关模式分子。本实验通过构建PsXEG1的pET28a原核表达载体，利用大肠杆菌原核表达，希望获得大量可溶性的PsXEG1蛋白，为进一步研究该蛋白的功能和其在寄主中的作用机制提供基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 3
1.2.1提取pET28a质粒3
1.2.2 载体构建流程3
1.2.3将构建好的载体pET28a转入大肠杆菌BL21中6
1.2.4 蛋白原核表达6
1.2.5 Western Blot6
1.2.6 注射烟草8
2 结果与分析8
2.1克隆PsXEG1基因所用引物8
2.2 载体构建过程中电泳图分析8
2.3原核表达的蛋白电泳图及蛋白上清液Western分析9
2.4蛋白上清液注射烟草结果9
3 讨论 9
致谢10
参考文献10
激发子PsXEG1蛋白原核表达的摸索
引言
引言 大豆疫霉(Phtophthora sojae)引起的大豆疫霉根腐病是威胁全世界大豆生产毁灭性的病害之一，每年导致全球十几亿美元
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
的直接经济损失[1]。大豆疫霉隶属于茸鞭生物界卵菌门疫霉属，是一类营半活体营养的病原卵菌，能在大豆的各个生育期造成危害。卵菌与真菌具有相似但不完全相同的侵染过程：卵菌一般产生游动孢子，游动孢子接触到寄主植物表面就会吸附到寄主植物表面并萌发产生附着胞，附着胞进一步产生侵入钉，穿透寄主细胞防御系统，进入寄主细胞后形成吸器，开始短暂的活体营养阶段，之后不断调控寄主细胞的状态，最终杀死寄主细胞发展到死体营养阶段，从而引起病害。不同于真菌病害和细菌病害，疫霉菌基因组较大并且遗传转化困难，对疫霉菌致病机理的研究进展非常缓慢。在农业生产上，卵菌病害防治的特效药比较少，一些防治真菌的药物对疫霉的防治效果也不是很突出。对于卵菌病害，目前最有效的方法是培育抗病品种，从分子生物学的手段研究大豆疫霉与植物互作的机制对于寻找新的杀菌剂靶标意义重大，有助于开发新的杀菌剂，为防止该病原菌制定策略提供理论依据[2,11]。
在自然界，植物长期受到病原微生物的侵袭，在与病原微生物共同进化的过程中逐渐形成了先天免疫系统。该系统由两层主要的免疫反应组成：第一层防御系统是基于细胞表面的模式识别受体(Patternrecognition receptors,PRRs)对病原相关模式分子(Pathogenassociated molecular patterns, PAMPs)的识别，在此过程中植物对许多病原微生物中普遍存在的分子作出识别及应答，该免疫过程被称为病原相关模式分子触发的免疫(PAMPtriggered immunity, PTI) [2,3]。其次，病原微生物会产生一类效应分子，它能够抑制宿主的这种识别，帮助病原微生物侵染。针对病原微生物的效应分子，植物进化出了反击机制，即第二层防御系统，主要依靠抗病基因(Resistance gene, R gene)编码的蛋白产物直接或间接识别某些类别的效应分子(无毒蛋白，avrR)，在侵染位点启动快速强烈的防御应答，即Effectortriggered immunity(ETI)[2]。PTI和ETI均是重要的植物抗性反应，PTI抗性可以抑制大范围的病原菌感染[4]， ETI抗性则能在植物体内形成过敏反应，造成侵染位点的细胞迅速死亡，这种抗性即称为基因对基因抗性(geneforgene resistance)。PTI和ETI的产生将抑制甚至完全阻断病原菌的继续扩展[1,2]。这两层免疫应答的分子机制各不相同，但又相互联系，充分体现了植物与病原微生物互作的复杂性。
植物病原菌产生的病原相关模式分子(PAMPs)是一类重要的信号分子，它能模仿非亲和互作中植物与病原菌的信号交流，启动不同的级联信号途径，导致过敏反应(HR)，诱发植物产生非寄主广谱抗性，同时还能使寄主产生系统获得性抗性[5]。
激发子最初的概念是指病原真菌的非亲合小种诱导寄主植物合成植物保卫素的小分子化合物，现在激发子所包含的内容远不止这些，而是指能诱导任何防卫反应的分子[6]。即包括上述所提到的PAMPs和效应分子。关于效应分子，无毒效应分子及其在病原物侵染植物造成病害过程中的功能研究已得到了大量的研究资源和线索，也成为目前疫霉研究的热点内容[1,7]，像卵菌中的RXLR和CRN。在植物免疫系统的另一个层面，PAMPTriggered Immunity (PTI)中的PAMPs及其相关功能的研究却进展缓慢。但是随着分子生物学、生物信息学等学科的发展和多个疫霉菌以及大豆基因组测序的完成，为PAMPs的深入研究提供了大量资源。如上文所说，PAMPs非寄主抗病性是植物对病原菌在种或以上分类单元上的抗性，具有抗性稳定持久的特点，因此PAMPs的了解对认识植物非寄主抗病性的分子机制具有更为深远的意义，为植物抗病基因工程提供更为广阔的前景。筛选PAMPs的互作蛋白，利用抗病基因工程技术对这些受体进行改造，研究PAMPs和寄主PAMPs的受体之间的相互作用关系对于理解病原菌的致病机制和植物的抗病机制有着重要的意义，为选育含抗病基因作物品种提供分子水平理论基础。借此获得更加广谱及高效的抗病品种，已经成为抗病育种更具前景的防治病害的方法。
实验室的前期研究已经证明PsXEG1是大豆疫霉外泌蛋白中分离纯化所得的一个55KD的蛋白，它能够诱导烟草过敏性坏死反应，具备激发子特性，是一类纤维素酶类的蛋白质[8]。为了进一步研究该蛋白的功能，本实验把PsXEG1基因从大豆疫霉菌基因组中进行了克隆，然后转入大肠杆菌BL21中进行原核表达，摸索激发子PsXEG1蛋白的原核表达条件。我们通过摸索PsXEG1蛋白的表达条件，为进一步证明PsXEG1是大豆疫霉菌甚至卵菌一类新的PAMPs提供基础。并继续探索其诱导非寄主抗病性的作用位点和受体，有助于理解病原菌致病机制，为大豆抗病育种提供理论基础。
1 材料与方法
1．1 材料
大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株JM109和BL21，由大学植病系真菌实验室保存。
烟草品种为本氏烟(Nicotiana benthamiana)，由大学植病系真菌实验室在温室（16 h光照、25℃；8小时黑暗、20℃）中种植。
本实验研究中所用到的质粒pET28a由大学植病系真菌实验室保存。
培养大肠杆菌的LB培养基：Tryptone(10g/L)+NaCl(10g/L)+ Yeast Extract(5g/L)，LB固体培养基另加Agar 1.5 g/L。121℃高温高压湿热灭菌20min。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 3
1.2.1提取pET28a质粒3
1.2.2 载体构建流程3
1.2.3将构建好的载体pET28a转入大肠杆菌BL21中6
1.2.4 蛋白原核表达6
1.2.5 Western Blot6
1.2.6 注射烟草8
2 结果与分析8
2.1克隆PsXEG1基因所用引物8
2.2 载体构建过程中电泳图分析8
2.3原核表达的蛋白电泳图及蛋白上清液Western分析9
2.4蛋白上清液注射烟草结果9
3 讨论 9
致谢10
参考文献10
激发子PsXEG1蛋白原核表达的摸索
引言
引言 大豆疫霉(Phtophthora sojae)引起的大豆疫霉根腐病是威胁全世界大豆生产毁灭性的病害之一，每年导致全球十几亿美元
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
的直接经济损失[1]。大豆疫霉隶属于茸鞭生物界卵菌门疫霉属，是一类营半活体营养的病原卵菌，能在大豆的各个生育期造成危害。卵菌与真菌具有相似但不完全相同的侵染过程：卵菌一般产生游动孢子，游动孢子接触到寄主植物表面就会吸附到寄主植物表面并萌发产生附着胞，附着胞进一步产生侵入钉，穿透寄主细胞防御系统，进入寄主细胞后形成吸器，开始短暂的活体营养阶段，之后不断调控寄主细胞的状态，最终杀死寄主细胞发展到死体营养阶段，从而引起病害。不同于真菌病害和细菌病害，疫霉菌基因组较大并且遗传转化困难，对疫霉菌致病机理的研究进展非常缓慢。在农业生产上，卵菌病害防治的特效药比较少，一些防治真菌的药物对疫霉的防治效果也不是很突出。对于卵菌病害，目前最有效的方法是培育抗病品种，从分子生物学的手段研究大豆疫霉与植物互作的机制对于寻找新的杀菌剂靶标意义重大，有助于开发新的杀菌剂，为防止该病原菌制定策略提供理论依据[2,11]。
在自然界，植物长期受到病原微生物的侵袭，在与病原微生物共同进化的过程中逐渐形成了先天免疫系统。该系统由两层主要的免疫反应组成：第一层防御系统是基于细胞表面的模式识别受体(Patternrecognition receptors,PRRs)对病原相关模式分子(Pathogenassociated molecular patterns, PAMPs)的识别，在此过程中植物对许多病原微生物中普遍存在的分子作出识别及应答，该免疫过程被称为病原相关模式分子触发的免疫(PAMPtriggered immunity, PTI) [2,3]。其次，病原微生物会产生一类效应分子，它能够抑制宿主的这种识别，帮助病原微生物侵染。针对病原微生物的效应分子，植物进化出了反击机制，即第二层防御系统，主要依靠抗病基因(Resistance gene, R gene)编码的蛋白产物直接或间接识别某些类别的效应分子(无毒蛋白，avrR)，在侵染位点启动快速强烈的防御应答，即Effectortriggered immunity(ETI)[2]。PTI和ETI均是重要的植物抗性反应，PTI抗性可以抑制大范围的病原菌感染[4]， ETI抗性则能在植物体内形成过敏反应，造成侵染位点的细胞迅速死亡，这种抗性即称为基因对基因抗性(geneforgene resistance)。PTI和ETI的产生将抑制甚至完全阻断病原菌的继续扩展[1,2]。这两层免疫应答的分子机制各不相同，但又相互联系，充分体现了植物与病原微生物互作的复杂性。
植物病原菌产生的病原相关模式分子(PAMPs)是一类重要的信号分子，它能模仿非亲和互作中植物与病原菌的信号交流，启动不同的级联信号途径，导致过敏反应(HR)，诱发植物产生非寄主广谱抗性，同时还能使寄主产生系统获得性抗性[5]。
激发子最初的概念是指病原真菌的非亲合小种诱导寄主植物合成植物保卫素的小分子化合物，现在激发子所包含的内容远不止这些，而是指能诱导任何防卫反应的分子[6]。即包括上述所提到的PAMPs和效应分子。关于效应分子，无毒效应分子及其在病原物侵染植物造成病害过程中的功能研究已得到了大量的研究资源和线索，也成为目前疫霉研究的热点内容[1,7]，像卵菌中的RXLR和CRN。在植物免疫系统的另一个层面，PAMPTriggered Immunity (PTI)中的PAMPs及其相关功能的研究却进展缓慢。但是随着分子生物学、生物信息学等学科的发展和多个疫霉菌以及大豆基因组测序的完成，为PAMPs的深入研究提供了大量资源。如上文所说，PAMPs非寄主抗病性是植物对病原菌在种或以上分类单元上的抗性，具有抗性稳定持久的特点，因此PAMPs的了解对认识植物非寄主抗病性的分子机制具有更为深远的意义，为植物抗病基因工程提供更为广阔的前景。筛选PAMPs的互作蛋白，利用抗病基因工程技术对这些受体进行改造，研究PAMPs和寄主PAMPs的受体之间的相互作用关系对于理解病原菌的致病机制和植物的抗病机制有着重要的意义，为选育含抗病基因作物品种提供分子水平理论基础。借此获得更加广谱及高效的抗病品种，已经成为抗病育种更具前景的防治病害的方法。
实验室的前期研究已经证明PsXEG1是大豆疫霉外泌蛋白中分离纯化所得的一个55KD的蛋白，它能够诱导烟草过敏性坏死反应，具备激发子特性，是一类纤维素酶类的蛋白质[8]。为了进一步研究该蛋白的功能，本实验把PsXEG1基因从大豆疫霉菌基因组中进行了克隆，然后转入大肠杆菌BL21中进行原核表达，摸索激发子PsXEG1蛋白的原核表达条件。我们通过摸索PsXEG1蛋白的表达条件，为进一步证明PsXEG1是大豆疫霉菌甚至卵菌一类新的PAMPs提供基础。并继续探索其诱导非寄主抗病性的作用位点和受体，有助于理解病原菌致病机制，为大豆抗病育种提供理论基础。
1 材料与方法
1．1 材料
大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株JM109和BL21，由大学植病系真菌实验室保存。
烟草品种为本氏烟(Nicotiana benthamiana)，由大学植病系真菌实验室在温室（16 h光照、25℃；8小时黑暗、20℃）中种植。
本实验研究中所用到的质粒pET28a由大学植病系真菌实验室保存。
培养大肠杆菌的LB培养基：Tryptone(10g/L)+NaCl(10g/L)+ Yeast Extract(5g/L)，LB固体培养基另加Agar 1.5 g/L。121℃高温高压湿热灭菌20min。
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