利用crisprcas9系统构建拟南芥attlc1基因的突变体
：在植物细胞中，神经酰胺主要由神经酰胺合酶催化二氢鞘氨醇生成。神经酰胺是最简单的鞘脂，是更复杂鞘脂的前体，也是鞘脂合成和降解途径的中心。在动物细胞与酵母中神经酰胺合酶的基因都包涵TLC（TRAM-LAG1-CLN8）结构域。拟南芥AtTLC1基因与哺乳动物的CLN8属于同源基因，含有TLC结构域。根据序列分析及文献的查阅，我们认为AtTLC1可能参与了鞘脂的代谢途径或影响了神经酰胺的合成，通过调节拟南芥鞘脂的平衡，从而影响拟南芥的生长发育。CRISPR/Cas9系统是一种全新的并且简便有效的基因打靶手段，具有广泛的应用前景。本文主要阐述利用CRISPR/Cas9系统构建用于定点编辑AtTLC1基因的载体。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 实验原理3
1.1 CRISPR/Cas9的结构3
1.2 CRISPR/Cas9的作用机制 3
1.3 剪切后的修复机制 5
2 材料与方法5
2.1 实验材料5
2.1.1 质粒和菌种5
2.1.2 植物材料5
2.1.3 试剂5
2.1.4 主要仪器和设备5
2.2 实验方法5
2.2.1 试剂、材料的配制及准备5
2.2.2 设计识别序列6
2.2.3 AtU6sgRNA载体的构建7
2.2.4 AtU6sgRNACas9载体的构建8
2.2.5 含有CRISPR/Cas9系统的农杆菌的转化及侵染拟南芥9
3 结果与讨论10
3.1 结果10
3.1.1 设计识别片段10
3.1.2 AtU626SK质粒和35SCas9SK质粒的提取11
3.1.3 AtU6sgRNA载体的构建11
3.1.4 AtU6sgRNACas9的构建11
3.1.5 CRISPR/Cas9的农杆菌载体的制作12
3.2 讨论13
4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
结语13
致谢13
参考文献14
附录1 AtU626SK质粒序列15
附录2 35SCas9SK质粒序列15
利用CRISPR/Cas系统获得拟南芥AtTLC1基因的突变体
引言
引言
基因靶向编辑技术是一种十分重要的分析基因功能的手段，不仅在生物学研究中扮演重要角色，将来也可能对治疗人类遗传性疾病中发挥重要作用。因而此类技术成为分子生物学的研究热点。
ZFN和TALEN打靶技术是目前研究较为成熟的2种定点突变技术，但是这2种技术构建可识别特异位点的核酸酶较为繁琐，每一个位点需要都构建2个相应的核酸酶，效率极低需要通过复杂的打靶载体构建、选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到限制。
2013年，基因编辑技术方面有了突破性的进展，CRISPR/Cas9系统被开发出来。它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简单、成本低、作用高效。CRISPR/Cas9介导的打靶系统作为一种新型打靶技术，只需合成一个sgRNA（single guide RNA ，sgRNA）就能实现对基因的特异性修饰，并且Cas蛋白不具有特异性，即使同时针对多个不同位点的打靶，也只需构建一个载体即可。同时编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便。较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的负效应。在构建和使用时非常简单、方便，并且成本较低，利用其可以同时对多个基因进行打靶的优势，可以逐条甚至批量检测人类或动植物基因组中的基因表达和互作情况，以明确基因的功能和调控网络。[9]
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR/Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR/Cas9系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效地在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR/Cas9技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速构建敲除动物模型的新方法。[10]
2013年5月2号，《Cell》杂志在线报道利用该方法已经获得了打靶的小鼠除了在基因组DNA中引入双链断裂（DNA doublestrand breaks，DSB）外，还可以起到类似RNAi的效果，称之为CRISPRi，但是不同于RNAi，CRISPRi 是通过阻遏转录的延伸和RNA 聚合酶的结合来实现。
CRISPR/Cas9系统在植物基因组的定点编辑中也有很多成功的报道。Jinek等[19]运用化脓链球菌CRISPR/Cas9系统和嵌合的sgRNA，在双子叶植物烟草和拟南芥叶片中及单子叶植物水稻和高粱的原生质体中进行了基因组定点编辑。Li等[20]利用植物偏爱密码子对Cas9基因进行了密码子优化，并将这一系统用于烟草和拟南芥转化，发现sgRNA的表达量是CRISPR/Cas9系统对植物基因组进行编辑的限制因子。他们分别对烟草和拟南芥的PDS 基因进行编辑，发现诱导烟草的突变率（38%左右）比拟南芥（5.6%）高，且在烟草的突变中存在大片段的DNA 缺失或插入，很少发生单核苷酸突变，而在拟南芥中的情况则相反，说明CRISPR/Cas9系统对不同植物或基因组中不同位点的编辑效率不同，这可能与sgRNA 对目标DNA 的结合力及染色体的结构、染色体的甲基化等表观遗传特性有关。Jiang等[21]运用CRISPR/Cas9系统分别对双子叶植物拟南芥和烟草及单子叶植物高粱和水稻的基因组成功进行了定点编辑。Shan等[22]、Liang等[23]运用这一系统对水稻、小麦和玉米的基因组进行了编辑，并且获得后代突变体。CRISPR/Cas9系统用于植物基因组的编辑，必将成为作物育种的强有力工具。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 实验原理3
1.1 CRISPR/Cas9的结构3
1.2 CRISPR/Cas9的作用机制 3
1.3 剪切后的修复机制 5
2 材料与方法5
2.1 实验材料5
2.1.1 质粒和菌种5
2.1.2 植物材料5
2.1.3 试剂5
2.1.4 主要仪器和设备5
2.2 实验方法5
2.2.1 试剂、材料的配制及准备5
2.2.2 设计识别序列6
2.2.3 AtU6sgRNA载体的构建7
2.2.4 AtU6sgRNACas9载体的构建8
2.2.5 含有CRISPR/Cas9系统的农杆菌的转化及侵染拟南芥9
3 结果与讨论10
3.1 结果10
3.1.1 设计识别片段10
3.1.2 AtU626SK质粒和35SCas9SK质粒的提取11
3.1.3 AtU6sgRNA载体的构建11
3.1.4 AtU6sgRNACas9的构建11
3.1.5 CRISPR/Cas9的农杆菌载体的制作12
3.2 讨论13
4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
结语13
致谢13
参考文献14
附录1 AtU626SK质粒序列15
附录2 35SCas9SK质粒序列15
利用CRISPR/Cas系统获得拟南芥AtTLC1基因的突变体
引言
引言
基因靶向编辑技术是一种十分重要的分析基因功能的手段，不仅在生物学研究中扮演重要角色，将来也可能对治疗人类遗传性疾病中发挥重要作用。因而此类技术成为分子生物学的研究热点。
ZFN和TALEN打靶技术是目前研究较为成熟的2种定点突变技术，但是这2种技术构建可识别特异位点的核酸酶较为繁琐，每一个位点需要都构建2个相应的核酸酶，效率极低需要通过复杂的打靶载体构建、选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到限制。
2013年，基因编辑技术方面有了突破性的进展，CRISPR/Cas9系统被开发出来。它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简单、成本低、作用高效。CRISPR/Cas9介导的打靶系统作为一种新型打靶技术，只需合成一个sgRNA（single guide RNA ，sgRNA）就能实现对基因的特异性修饰，并且Cas蛋白不具有特异性，即使同时针对多个不同位点的打靶，也只需构建一个载体即可。同时编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便。较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的负效应。在构建和使用时非常简单、方便，并且成本较低，利用其可以同时对多个基因进行打靶的优势，可以逐条甚至批量检测人类或动植物基因组中的基因表达和互作情况，以明确基因的功能和调控网络。[9]
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR/Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR/Cas9系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效地在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR/Cas9技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速构建敲除动物模型的新方法。[10]
2013年5月2号，《Cell》杂志在线报道利用该方法已经获得了打靶的小鼠除了在基因组DNA中引入双链断裂（DNA doublestrand breaks，DSB）外，还可以起到类似RNAi的效果，称之为CRISPRi，但是不同于RNAi，CRISPRi 是通过阻遏转录的延伸和RNA 聚合酶的结合来实现。
CRISPR/Cas9系统在植物基因组的定点编辑中也有很多成功的报道。Jinek等[19]运用化脓链球菌CRISPR/Cas9系统和嵌合的sgRNA，在双子叶植物烟草和拟南芥叶片中及单子叶植物水稻和高粱的原生质体中进行了基因组定点编辑。Li等[20]利用植物偏爱密码子对Cas9基因进行了密码子优化，并将这一系统用于烟草和拟南芥转化，发现sgRNA的表达量是CRISPR/Cas9系统对植物基因组进行编辑的限制因子。他们分别对烟草和拟南芥的PDS 基因进行编辑，发现诱导烟草的突变率（38%左右）比拟南芥（5.6%）高，且在烟草的突变中存在大片段的DNA 缺失或插入，很少发生单核苷酸突变，而在拟南芥中的情况则相反，说明CRISPR/Cas9系统对不同植物或基因组中不同位点的编辑效率不同，这可能与sgRNA 对目标DNA 的结合力及染色体的结构、染色体的甲基化等表观遗传特性有关。Jiang等[21]运用CRISPR/Cas9系统分别对双子叶植物拟南芥和烟草及单子叶植物高粱和水稻的基因组成功进行了定点编辑。Shan等[22]、Liang等[23]运用这一系统对水稻、小麦和玉米的基因组进行了编辑，并且获得后代突变体。CRISPR/Cas9系统用于植物基因组的编辑，必将成为作物育种的强有力工具。
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