纤溶寡养单胞菌纤溶酶（ProX14）的分离纯化
纤溶寡养单胞菌纤溶酶（ProX14）的分离纯化[20200614171619]
摘要：血栓是危害严重的一类心血管疾病，溶栓药物是药物研发中的热点。纤维蛋白原是常见的一个靶点，微生物来源的纤溶酶也是目前研究较多的一类，如葡激酶等。这类药物提取方便，但存在分子量较大，容易使人体产生免疫反应等不良反应。因此效果好，分子量小的纤溶酶成为新一代纤溶酶开发的目标。本文从实验室分离的新菌纤溶寡养单胞菌的发酵液中分离得到一种分子量在16kd左右的纤溶酶，并对其活性做了一定研究。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:血栓；溶栓；纤溶酶；纤溶蛋白原；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
研究现状3
1.材料与方法4
1.1实验材料4
1.1.1菌种4
1.1.2试剂4
1.1.3器材4
1.2培养基4
1.3菌种筛选4
1.4菌种鉴定4
1.5纤溶酶粗酶液样品制备4
1.6纤溶酶粗酶液的酶学性质的研究5
1.6.1纤溶酶粗酶液蛋白分子量初步测定5
1.6.2粗酶液纤溶酶激酶活性检测5
1.7纤溶酶粗酶液分离纯化6
1.7.1蛋白质含量测定6
1.7.2硫酸铵分段盐析6
1.7.3超滤脱盐6
1.7.4 SephadexG-75 凝胶过滤6
a凝胶柱的预处理6
b凝胶层析上样以及洗脱6
c凝胶电泳6
2.结果分析6
3.讨论12
附录13
参考文献14
纤溶寡养单胞菌纤溶酶（ProX14）的分离纯化
引言
引言
纤溶酶指的是能够溶解构成血栓的主要成分纤维蛋白的酶。在生物化学中，纤维蛋白溶解简称为纤溶。在人体血液中，存在着凝血系统和纤维蛋白溶解系统，它们各受一系列酶促反应的调节，正常生理状态下，这两个系统保持动态平衡，既保证血液有潜在可凝固性，又保证血液的流体状态。纤溶系统主要由纤溶酶原、纤溶酶原激活剂（t-PA、u-PA）、纤溶酶和纤溶酶原激活物抑制剂（如PAI-1）这4个部分组成。纤溶的生物学作用之一是去除血管、组织 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
液中过剩的纤维蛋白沉积物，以保持血循环、组织液管道等的通畅。
机体一旦产生凝血反应，也几乎同时激活了纤溶系统，使体内多余的血栓移去，并通过负反馈效应使体内纤维蛋白原的水平降低，从而避免纤维蛋白的过多凝聚。纤维蛋白是纤溶酶的作用底物，同时也参与自身降解的调控。纤维蛋白对纤溶酶原激活剂和纤溶酶具有保护作用，可降低或解除蛋白抑制剂对它们的抑制作用。因此，对纤维蛋白具有直接降解活性的纤溶酶可被用作溶栓剂来治疗血栓栓塞性疾病。
图1：
纤溶酶原（Plasminogen）是血浆纤维蛋白水解酶无活性的前体。由组织激活物t-PA、尿激酶或凝血接触阶段多种酶激活，外源性激活物如链激酶也可起激活作用。纤溶酶降解纤维蛋白和纤维蛋白原，保持血管和分腺管通畅，进一步研究发现，纤溶酶功能还包括促胶原酶活性及在营养及细胞移动方面起辅助作用。纤溶酶原缺乏会削弱凝血亢进时机体的反应能力，比如临床上广泛血栓形成。这种情况在外科手术或溶栓治疗后再栓塞危险会增加。换句话说，纤溶酶原浓度增加一旦激活，可引起出血危险性增加。
研究现状：纤维蛋白原(fibrinogen，Fib)即凝血因子I[2]，其作为凝血因子在凝血酶作用下，最终交联为纤维蛋白，参与血液凝固。
纤溶酶原有内源性及外源性两条激活途径[8]。①内源性激活：指血液中存在有能使纤溶酶原 激活的活化因子 ，它可能来自静脉或微静脉 的内皮细胞 ，其活性在上肢静脉较之下肢静脉高，这是下肢静脉血栓 比上肢静脉多的原因之一。此外在血液中还存在一种活化因子 原，当机体 的凝血反应一旦被启动，激活的凝血因子 之一——凝血因子Ⅺ除参与自身的凝血系统 外，也同时激活了此活化因子原，后者再进一步激活纤溶酶原 。血液中的活化因子原极易被纤维蛋白凝块所吸附，从而有利于血栓的溶解。②外源性激活：是通过组织活化因子而实现的，此活化因子在子宫、卵巢、肾脏及肺组织中含量尤其丰富。恶性肿瘤初期的分化细胞，胎儿发育期的分化细胞，也能释放大量活化因子。
目前治疗血栓性疾病的最为有效并且可靠的手段是采用纤维蛋白溶解酶或其激活剂进行治疗的溶栓疗法[1]。溶栓疗法是通过使用溶栓剂，使血凝块中的纤维蛋白降解成可溶物质而使循环畅通，血管再通，减轻脏器损害的范围和程度，大大提高了病人的存活率。而且，溶栓药物对于治疗中风、深静脉 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
栓塞等严重疾病也具有较好效果。纤溶酶作为溶栓类药物的主要成分，具有非常大的研究价值。目前在人体、动物、植物、微生物和海洋生物中都发现了天然溶栓活性物质。其中微生物是溶栓活性物质的重要来源，不仅具有生产方面的优势，例如微生物发酵法生产药用酶不受季节、气候和地域的限制，具有生产周期短，产量高，成本低等优点，同时还可通过精心控制培养条件或选择理想的突变菌株可以大大提高(10-100 倍)酶的产量；还有很多其他的优点，如分子量小、安全无毒、酶活性高、半衰期长、无免疫原性、无引起出血倾向和可以通过消化道直接吸收等，因此被认为是最具开发潜力的溶栓剂之一。早期研究发现的链激酶、葡激酶等溶纤酶原激活剂都已经在临床上广泛应用，因而枯草杆菌激酶、纳豆激酶以及豆豉溶纤酶等可直接降解纤维蛋白的新型微生物溶纤酶已引起人们的高度关注[3]。
近年来,介入治疗在缺血性心脑血管病中，发挥了重要作用，并取得了较好的效果，但介入术后发生的急性血管闭塞、血管再狭窄等并发症严重影响了介入治疗的发展。现有研究证实，血管弹性回缩、血管内膜过度增生、急性期支架内附擘血栓形成是血管闭塞或再狭窄的主要病理机制。有研究观察到术后患者血中PAI一1活性明显升高，而组织型纤溶酶原激活物(t—PA)活性明显降低，导致术后凝血功能增强，纤溶功能减退，而使Fib水平升高，同时在支架置人后。损伤血管壁闪素刺激F，均可激活、增强血小板聚集及抵抗．提高损伤血管内膜修复增殖反应性，促进附壁血栓形成或再狭窄m]。由此可见，介入术后纤溶活性降低是急性血管闭塞或再狭窄的高危因素，故介入术后动态监测纤溶指标，具有长远、积极意义。同时有研究表明，利用外源性t—PA基因治疗，来改善纤溶活性、降低Fib水平，以预防心脑血管支架置人术后血栓形成或再狭窄将成为现实。[2]
1． 材料与方法
1．1 实验材料
1.2 配制所需培养基：
LB培养基：1L溶液中成分，胰蛋白胨（Tryptone）10g;酵母提取物（Yeast extract）5g;氯化钠（NaCl）10g。
摘要：血栓是危害严重的一类心血管疾病，溶栓药物是药物研发中的热点。纤维蛋白原是常见的一个靶点，微生物来源的纤溶酶也是目前研究较多的一类，如葡激酶等。这类药物提取方便，但存在分子量较大，容易使人体产生免疫反应等不良反应。因此效果好，分子量小的纤溶酶成为新一代纤溶酶开发的目标。本文从实验室分离的新菌纤溶寡养单胞菌的发酵液中分离得到一种分子量在16kd左右的纤溶酶，并对其活性做了一定研究。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:血栓；溶栓；纤溶酶；纤溶蛋白原；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
研究现状3
1.材料与方法4
1.1实验材料4
1.1.1菌种4
1.1.2试剂4
1.1.3器材4
1.2培养基4
1.3菌种筛选4
1.4菌种鉴定4
1.5纤溶酶粗酶液样品制备4
1.6纤溶酶粗酶液的酶学性质的研究5
1.6.1纤溶酶粗酶液蛋白分子量初步测定5
1.6.2粗酶液纤溶酶激酶活性检测5
1.7纤溶酶粗酶液分离纯化6
1.7.1蛋白质含量测定6
1.7.2硫酸铵分段盐析6
1.7.3超滤脱盐6
1.7.4 SephadexG-75 凝胶过滤6
a凝胶柱的预处理6
b凝胶层析上样以及洗脱6
c凝胶电泳6
2.结果分析6
3.讨论12
附录13
参考文献14
纤溶寡养单胞菌纤溶酶（ProX14）的分离纯化
引言
引言
纤溶酶指的是能够溶解构成血栓的主要成分纤维蛋白的酶。在生物化学中，纤维蛋白溶解简称为纤溶。在人体血液中，存在着凝血系统和纤维蛋白溶解系统，它们各受一系列酶促反应的调节，正常生理状态下，这两个系统保持动态平衡，既保证血液有潜在可凝固性，又保证血液的流体状态。纤溶系统主要由纤溶酶原、纤溶酶原激活剂（t-PA、u-PA）、纤溶酶和纤溶酶原激活物抑制剂（如PAI-1）这4个部分组成。纤溶的生物学作用之一是去除血管、组织 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
液中过剩的纤维蛋白沉积物，以保持血循环、组织液管道等的通畅。
机体一旦产生凝血反应，也几乎同时激活了纤溶系统，使体内多余的血栓移去，并通过负反馈效应使体内纤维蛋白原的水平降低，从而避免纤维蛋白的过多凝聚。纤维蛋白是纤溶酶的作用底物，同时也参与自身降解的调控。纤维蛋白对纤溶酶原激活剂和纤溶酶具有保护作用，可降低或解除蛋白抑制剂对它们的抑制作用。因此，对纤维蛋白具有直接降解活性的纤溶酶可被用作溶栓剂来治疗血栓栓塞性疾病。
图1：
纤溶酶原（Plasminogen）是血浆纤维蛋白水解酶无活性的前体。由组织激活物t-PA、尿激酶或凝血接触阶段多种酶激活，外源性激活物如链激酶也可起激活作用。纤溶酶降解纤维蛋白和纤维蛋白原，保持血管和分腺管通畅，进一步研究发现，纤溶酶功能还包括促胶原酶活性及在营养及细胞移动方面起辅助作用。纤溶酶原缺乏会削弱凝血亢进时机体的反应能力，比如临床上广泛血栓形成。这种情况在外科手术或溶栓治疗后再栓塞危险会增加。换句话说，纤溶酶原浓度增加一旦激活，可引起出血危险性增加。
研究现状：纤维蛋白原(fibrinogen，Fib)即凝血因子I[2]，其作为凝血因子在凝血酶作用下，最终交联为纤维蛋白，参与血液凝固。
纤溶酶原
目前治疗血栓性疾病的最为有效并且可靠的手段是采用纤维蛋白溶解酶或其激活剂进行治疗的溶栓疗法[1]。溶栓疗法是通过使用溶栓剂，使血凝块中的纤维蛋白降解成可溶物质而使循环畅通，血管再通，减轻脏器损害的范围和程度，大大提高了病人的存活率。而且，溶栓药物对于治疗中风、深静脉 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
栓塞等严重疾病也具有较好效果。纤溶酶作为溶栓类药物的主要成分，具有非常大的研究价值。目前在人体、动物、植物、微生物和海洋生物中都发现了天然溶栓活性物质。其中微生物是溶栓活性物质的重要来源，不仅具有生产方面的优势，例如微生物发酵法生产药用酶不受季节、气候和地域的限制，具有生产周期短，产量高，成本低等优点，同时还可通过精心控制培养条件或选择理想的突变菌株可以大大提高(10-100 倍)酶的产量；还有很多其他的优点，如分子量小、安全无毒、酶活性高、半衰期长、无免疫原性、无引起出血倾向和可以通过消化道直接吸收等，因此被认为是最具开发潜力的溶栓剂之一。早期研究发现的链激酶、葡激酶等溶纤酶原激活剂都已经在临床上广泛应用，因而枯草杆菌激酶、纳豆激酶以及豆豉溶纤酶等可直接降解纤维蛋白的新型微生物溶纤酶已引起人们的高度关注[3]。
近年来,介入治疗在缺血性心脑血管病中，发挥了重要作用，并取得了较好的效果，但介入术后发生的急性血管闭塞、血管再狭窄等并发症严重影响了介入治疗的发展。现有研究证实，血管弹性回缩、血管内膜过度增生、急性期支架内附擘血栓形成是血管闭塞或再狭窄的主要病理机制。有研究观察到术后患者血中PAI一1活性明显升高，而组织型纤溶酶原激活物(t—PA)活性明显降低，导致术后凝血功能增强，纤溶功能减退，而使Fib水平升高，同时在支架置人后。损伤血管壁闪素刺激F，均可激活、增强血小板聚集及抵抗．提高损伤血管内膜修复增殖反应性，促进附壁血栓形成或再狭窄m]。由此可见，介入术后纤溶活性降低是急性血管闭塞或再狭窄的高危因素，故介入术后动态监测纤溶指标，具有长远、积极意义。同时有研究表明，利用外源性t—PA基因治疗，来改善纤溶活性、降低Fib水平，以预防心脑血管支架置人术后血栓形成或再狭窄将成为现实。[2]
1． 材料与方法
1．1 实验材料
1.2 配制所需培养基：
LB培养基：1L溶液中成分，胰蛋白胨（Tryptone）10g;酵母提取物（Yeast extract）5g;氯化钠（NaCl）10g。
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