牛虻唾液腺免疫调节肽immunoregulinha作相关信号通路的初步研究
Immunoregulin HA是一种从拟黑腹瘤虻（Hybomitra atriperoides）的唾液腺提取物中分离纯化出的具有免疫抑制功能的生物活性肽，它由30个氨基酸残基组成，其肽段序列为GGVTGVTEFEPVDVSGEDYDSDEMDEDGRA。之前的研究证明了immunoregulin HA对免疫细胞细胞因子分泌的影响，为了进一步解析immunoregulin HA作用的分子机制，我们运用Western Blot和RT-qPCR的方法分别在蛋白质磷酸化水平和mRNA水平检测了免疫抑制肽对LPS（Lipopolysaccharide）介导的炎症反应中NFkB、p38 MAPK、JNK、ERK等主要信号转导途径的影响。对免疫抑制肽immunoregulin HA作用相关信号通路的初步研究结果表明，immunoregulin HA主要作用于JNK/SAPK途径，同时对NFkB途径也有较强的相应。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法5
1.1实验材料与试剂5
1.2实验步骤6
1.2.1免疫抑制肽immunoregulin HA对LPS诱导的炎症反应中细胞因子分泌的影响..6
1.2.2 免疫抑制肽immunoregulin HA对LPS激活的炎症信号通路相关蛋白激活的影响..6
1.2.3免疫抑制肽immunoregulin HA对LPS激活的炎症信号通路相关基因表达的影响....8
2 结果与分析11
2.1 免疫抑制肽immunoregulin HA对LPS诱导的炎症反应中细胞因子分泌的影响11
2.1.1 实验结果11
2.1.2 结果分析12
2.2 免疫抑制肽immunoregulin HA对LPS激活的炎症信号通路相关基因表达的影响...12
2.2.1 实验结果12
2.2.2 结果分析14
2.3 免疫抑制肽immunoregulin HA对LPS激活的炎症信号通路相关蛋白激活的影响...15
2.3.1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
实验结果15
2.3.2 结果分析15
3 讨论16
致谢17
参考文献18
附录A 仪器及生产厂家20
附录B 英文缩写词表21
牛虻唾液腺免疫抑制肽immunoregulin HA作用相关信号通路的初步研究?
引言
引言 免疫细胞和免疫分子之间，以及与其它系统如神经内分泌系统之间相互作用，将免疫应答以最恰当的形式维持在最适当的水平。事实上，由于实际免疫过程是由很多较为复杂的机制进行调控的，所以很难达到恰到好处的免疫稳态。其中最典型的例子就是，在杀菌过程中，溶菌酶体会向胞外释放出活性氧，会导致严重的组织损伤。过度的活性氧释放，会导致机体出现严重的病变，如：动脉粥样硬化，慢性阻塞性肺病等[1]。所以找出控制和调节炎症反应的机制，对免疫的不恰当激活进行适时的关闭显得尤为重要。
免疫调节肽（immunopeptides）是生物活性肽的一种，它能够调节先天免疫反应中杀伤细胞和吞噬细胞的功能；参与补体系统的活化；促进后天免疫反应中T细胞和B细胞的增殖、分化，以及各种细胞因子的分泌。
在自然界中，天然的免疫调节肽按照来源可分为微生物来源、植物来源及动物来源[2]。其中，寄生虫唾液腺来源的免疫调节肽是目前研究热点之一[3]。寄生虫，特别是吸血节肢动物为了抵御其宿主强大的免疫系统，其唾液腺的分泌物中会存在大量的免疫抑制因子，因此吸血节肢动物的唾液腺中存在大量免疫调节肽。对于寄生生物与宿主，宿主依靠自身复杂的免疫系统来防御寄生生物的入侵，而寄生生物则依靠产生一系列的分子来抑制和调节宿主的免疫系统，这些分子保证了寄生生物顺利的入侵宿主，而不被宿主的免疫机制所排斥。同时，考虑到吸血节肢动物的宿主多为高等哺乳动物，这些哺乳动物免疫系统的防御机制与人类免疫系统的防御机制存在很大的相似性，因此，相较于对其他来源的免疫调节肽的研究，进行吸血节肢动物体内免疫调节肽（尤其是免疫抑制肽）的研究，对免疫过程中炎症反应等问题的解决具有更强的针对性和更重大的意义。
回顾吸血节肢动物免疫抑制肽的研究，1987年，Ribeiro首次报道了吸血节肢动物的唾液腺内含有大量的免疫调节蛋白[4]，开启了该领域研究的先河。早期研究结果表明，吸血节肢动物的唾液腺分泌物中含有大量止血、抗炎以及免疫调控的因子（如蛋白质、前列腺素、核苷酸和多肽等），它们可以改变宿主的生理反应，形成一个适合于寄生的微环境[5]。Theodos等[6]从沙蝇体内发现了一些免疫抑制肽类，并发现它们是通过影响巨噬细胞将抗原向T细胞传递的过程来发挥其功能。Mans等[7]发现蚊子唾液腺蛋白D7r4由8个α螺旋，3对二硫键形成稳定的分子结构，具有与体内胺及肾上腺素结合的能力。先前对牛虻唾液腺的蛋白质组学的研究表明，牛虻唾液腺中含有大量生物活性物质[8]，因此，相关研究从牛虻的唾液腺提取物中分离纯化得到了一些具有免疫调节作用的肽，并对其功能做了相应的研究。Xu等[9]从姚虻唾液腺中分离纯化得到12个成员的免疫抑制肽类家族，并验证了其具有相应抑制炎症反应的功能。Zhao等[10]从雁虻的唾液腺提取物中分离纯化出具有免疫调节活性的多肽immunoregulin TP1，并也验证了immunoregulin TP1具有调节免疫相关细胞因子分泌的功能。Bai等[11]从刺舌蝇的唾液腺提取物中发现了一种名为Gloss 2的免疫抑制肽，该研究不仅验证了Gloss 2同样具有调节免疫相关细胞因子分泌的功能，还发现Gloss 2可能是通过ERK、p38 MAPK、JNK等蛋白的磷酸化来调节免疫因子的分泌。由于相对较长的血餐时间，蜱类需要分泌大量免疫抑制因子以抵御宿主的免疫系统[12]，目前已经从蜱的唾液腺中鉴定出超过10种具有免疫调节功能的免疫调节肽。其中研究比较透彻的是来源于肩突硬蜱唾液腺的免疫抑制肽Salp15[1316]，Salp15与T细胞表面的cluster of differentiation 4（CD4）受体结合后，阻止了原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src，酪氨酸蛋白激酶Lck和下游底物酪氨酸蛋白激酶Zap70的活化，导致T细胞在早期免疫活动中缺少活化的1磷脂酰肌醇1,4二磷酸二酯酶?1（PLC?），抑制了T细胞受体（TCR）连接后T细胞体内的钙离子的改变，从而使白细胞介素2（IL2）分泌量减少。同时对Slap15的进一步研究发现，Salp15通过与共同受体CD4连接还可以抑制T细胞的活化，Salp15与CD4受体结合后，通过使Lck的一些早期下游信号分子，如T细胞激活家庭成员链接器1（LAT）和原癌基因蛋白VAV1等分子的酪氨酸磷酸化，导致T细胞中肌动蛋白错误的聚合，从而抑制T细胞的活化[17]。Hannier等[18]报导从篦子硬蜱中分离纯化的B细胞抑制蛋白（BIP），其能显著的抑制宿主B细胞白细胞介素10（IL10）和肿瘤坏死因子α（TNFα）的合成和分泌，以及LPS刺激后CD69的表达和增殖，并发现BIP直接作用于B细胞，但不导致B细胞的坏死和凋亡。Yu等[19]从中华硬蜱中分离纯化得到了一个成熟肽大小为116个氨基酸残基的B细胞抑制因子（BIF），并发现BIF可以抑制脂多糖诱导的B细胞分化和增殖，但对其机制未做进一步研究。此外，Wu等[20]从亚洲璃眼蜱的唾液腺中分离并研究了两个家族的免疫抑制肽hyalominA和hyalominB。研究结果表明这两个家族的多肽由同一基因进行编码，它们通过作用于MAPK信号途径（主要是JNK/SAPK信号通路）调节宿主细胞因子的分泌而发挥免疫抑制功能。与此同时，也有报道称吸血节肢动物的唾液腺分泌物在一些疾病感染中起重要作用，且这些吸血节肢动物和它们传播的病原体之间存在共进化的关系[21]。目前，对吸血节肢动物免疫调节肽的研究主要集中于对免疫抑制肽资源的开发。
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摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法5
1.1实验材料与试剂5
1.2实验步骤6
1.2.1免疫抑制肽immunoregulin HA对LPS诱导的炎症反应中细胞因子分泌的影响..6
1.2.2 免疫抑制肽immunoregulin HA对LPS激活的炎症信号通路相关蛋白激活的影响..6
1.2.3免疫抑制肽immunoregulin HA对LPS激活的炎症信号通路相关基因表达的影响....8
2 结果与分析11
2.1 免疫抑制肽immunoregulin HA对LPS诱导的炎症反应中细胞因子分泌的影响11
2.1.1 实验结果11
2.1.2 结果分析12
2.2 免疫抑制肽immunoregulin HA对LPS激活的炎症信号通路相关基因表达的影响...12
2.2.1 实验结果12
2.2.2 结果分析14
2.3 免疫抑制肽immunoregulin HA对LPS激活的炎症信号通路相关蛋白激活的影响...15
2.3.1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
实验结果15
2.3.2 结果分析15
3 讨论16
致谢17
参考文献18
附录A 仪器及生产厂家20
附录B 英文缩写词表21
牛虻唾液腺免疫抑制肽immunoregulin HA作用相关信号通路的初步研究?
引言
引言 免疫细胞和免疫分子之间，以及与其它系统如神经内分泌系统之间相互作用，将免疫应答以最恰当的形式维持在最适当的水平。事实上，由于实际免疫过程是由很多较为复杂的机制进行调控的，所以很难达到恰到好处的免疫稳态。其中最典型的例子就是，在杀菌过程中，溶菌酶体会向胞外释放出活性氧，会导致严重的组织损伤。过度的活性氧释放，会导致机体出现严重的病变，如：动脉粥样硬化，慢性阻塞性肺病等[1]。所以找出控制和调节炎症反应的机制，对免疫的不恰当激活进行适时的关闭显得尤为重要。
免疫调节肽（immunopeptides）是生物活性肽的一种，它能够调节先天免疫反应中杀伤细胞和吞噬细胞的功能；参与补体系统的活化；促进后天免疫反应中T细胞和B细胞的增殖、分化，以及各种细胞因子的分泌。
在自然界中，天然的免疫调节肽按照来源可分为微生物来源、植物来源及动物来源[2]。其中，寄生虫唾液腺来源的免疫调节肽是目前研究热点之一[3]。寄生虫，特别是吸血节肢动物为了抵御其宿主强大的免疫系统，其唾液腺的分泌物中会存在大量的免疫抑制因子，因此吸血节肢动物的唾液腺中存在大量免疫调节肽。对于寄生生物与宿主，宿主依靠自身复杂的免疫系统来防御寄生生物的入侵，而寄生生物则依靠产生一系列的分子来抑制和调节宿主的免疫系统，这些分子保证了寄生生物顺利的入侵宿主，而不被宿主的免疫机制所排斥。同时，考虑到吸血节肢动物的宿主多为高等哺乳动物，这些哺乳动物免疫系统的防御机制与人类免疫系统的防御机制存在很大的相似性，因此，相较于对其他来源的免疫调节肽的研究，进行吸血节肢动物体内免疫调节肽（尤其是免疫抑制肽）的研究，对免疫过程中炎症反应等问题的解决具有更强的针对性和更重大的意义。
回顾吸血节肢动物免疫抑制肽的研究，1987年，Ribeiro首次报道了吸血节肢动物的唾液腺内含有大量的免疫调节蛋白[4]，开启了该领域研究的先河。早期研究结果表明，吸血节肢动物的唾液腺分泌物中含有大量止血、抗炎以及免疫调控的因子（如蛋白质、前列腺素、核苷酸和多肽等），它们可以改变宿主的生理反应，形成一个适合于寄生的微环境[5]。Theodos等[6]从沙蝇体内发现了一些免疫抑制肽类，并发现它们是通过影响巨噬细胞将抗原向T细胞传递的过程来发挥其功能。Mans等[7]发现蚊子唾液腺蛋白D7r4由8个α螺旋，3对二硫键形成稳定的分子结构，具有与体内胺及肾上腺素结合的能力。先前对牛虻唾液腺的蛋白质组学的研究表明，牛虻唾液腺中含有大量生物活性物质[8]，因此，相关研究从牛虻的唾液腺提取物中分离纯化得到了一些具有免疫调节作用的肽，并对其功能做了相应的研究。Xu等[9]从姚虻唾液腺中分离纯化得到12个成员的免疫抑制肽类家族，并验证了其具有相应抑制炎症反应的功能。Zhao等[10]从雁虻的唾液腺提取物中分离纯化出具有免疫调节活性的多肽immunoregulin TP1，并也验证了immunoregulin TP1具有调节免疫相关细胞因子分泌的功能。Bai等[11]从刺舌蝇的唾液腺提取物中发现了一种名为Gloss 2的免疫抑制肽，该研究不仅验证了Gloss 2同样具有调节免疫相关细胞因子分泌的功能，还发现Gloss 2可能是通过ERK、p38 MAPK、JNK等蛋白的磷酸化来调节免疫因子的分泌。由于相对较长的血餐时间，蜱类需要分泌大量免疫抑制因子以抵御宿主的免疫系统[12]，目前已经从蜱的唾液腺中鉴定出超过10种具有免疫调节功能的免疫调节肽。其中研究比较透彻的是来源于肩突硬蜱唾液腺的免疫抑制肽Salp15[1316]，Salp15与T细胞表面的cluster of differentiation 4（CD4）受体结合后，阻止了原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src，酪氨酸蛋白激酶Lck和下游底物酪氨酸蛋白激酶Zap70的活化，导致T细胞在早期免疫活动中缺少活化的1磷脂酰肌醇1,4二磷酸二酯酶?1（PLC?），抑制了T细胞受体（TCR）连接后T细胞体内的钙离子的改变，从而使白细胞介素2（IL2）分泌量减少。同时对Slap15的进一步研究发现，Salp15通过与共同受体CD4连接还可以抑制T细胞的活化，Salp15与CD4受体结合后，通过使Lck的一些早期下游信号分子，如T细胞激活家庭成员链接器1（LAT）和原癌基因蛋白VAV1等分子的酪氨酸磷酸化，导致T细胞中肌动蛋白错误的聚合，从而抑制T细胞的活化[17]。Hannier等[18]报导从篦子硬蜱中分离纯化的B细胞抑制蛋白（BIP），其能显著的抑制宿主B细胞白细胞介素10（IL10）和肿瘤坏死因子α（TNFα）的合成和分泌，以及LPS刺激后CD69的表达和增殖，并发现BIP直接作用于B细胞，但不导致B细胞的坏死和凋亡。Yu等[19]从中华硬蜱中分离纯化得到了一个成熟肽大小为116个氨基酸残基的B细胞抑制因子（BIF），并发现BIF可以抑制脂多糖诱导的B细胞分化和增殖，但对其机制未做进一步研究。此外，Wu等[20]从亚洲璃眼蜱的唾液腺中分离并研究了两个家族的免疫抑制肽hyalominA和hyalominB。研究结果表明这两个家族的多肽由同一基因进行编码，它们通过作用于MAPK信号途径（主要是JNK/SAPK信号通路）调节宿主细胞因子的分泌而发挥免疫抑制功能。与此同时，也有报道称吸血节肢动物的唾液腺分泌物在一些疾病感染中起重要作用，且这些吸血节肢动物和它们传播的病原体之间存在共进化的关系[21]。目前，对吸血节肢动物免疫调节肽的研究主要集中于对免疫抑制肽资源的开发。
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