甲烷诱导黄瓜不定根发生过程中甲烷诱导黄瓜不定根发生过程中s亚硝基水平的变化【字数：6433】
不定根的发生是园艺、林木植物移栽、扦插、组织培养和工厂化育苗成功的关键。本实验室之前结果显示，甲烷（Methane，CH4）处理能促进黄瓜不定根的发生，同时发现其内源一氧化氮(nitricoxide，NO)含量也有所升高。另外，蛋白亚硝基化是动物体中NO的作用机制之一。为探究植物中是否存在相关机制，本实验以“露丰”品种黄瓜为材料，研究CH4处理与蛋白亚硝基化的关系。实验采用形态学、药理学、解剖学和生物化学等手段，探究在CH4处理后蛋白亚硝基化水平的变化。研究结果如下CH4处理后不定根的根长和根数明显增加；在不定根原基发生过程中，CH4诱导能明显提高原基数目，检测发现原基发育的3个时期都有明显提高；CH4和NO处理增加总蛋白合成，处理后亚硝基化蛋白含量明显上升，与不定根发生趋势相似，初步推测不定根发生与蛋白亚硝基化水平呈正相关。综上所述，CH4诱导蛋白亚硝基化水平，且不定根发生与蛋白亚硝基化水平呈正相关。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1材料与方法 2
1.1材料培养 2
1.2试剂 2
1.3材料处理 3
1.4实验设计 3
1.5表型检测 3
1.6不定根原基检测 3
1.7蛋白质提取 3
1.8总蛋白含量测定 4
1.9亚硝基化含量测定 4
1.10数据分析 4
2结果与分析 4
2.1甲烷处理能促进不定根发生 4
2.2甲烷和一氧化氮促进不定根原基发育 5
2.3蛋白分析 6
2.4亚硝基化水平分析 7
3讨论 8
致谢 8
参考文献 9
甲烷诱导黄瓜不定根发生过程中S亚硝基水平的变化
引言
引言：不定根能加快水分、无机盐吸收，同时能贮存有机物，是植物生长过程中必需的重要器官，起到扩大植物吸收面积和增强固着，支持植物的功能[1]。正常情况下，不定根通常发生于植物受伤部位，随着植物信号转导机制不断被探明，证实激素和信号分子等也 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
会导致不定根发生，病害、虫害等相关研究也证实了其对不定根发生的作用。生长素作为植物生长最重要的激素，前人研究已经相当深入，拟南芥、绿豆、向日葵等植物可通过外源添加IAA、IBA、NAA、2,4D 等类生长素调节剂促进形成不定根[24]，使用萘基邻氨甲酰苯甲酸（Naphthyl carbamoylbenzoic acid，NPA，IAA极性运输抑制剂）处理植物插条，基部IAA含量减少，不定根发生率下降[5,6]。不定根的发生是园艺、林木植物移栽、扦插、组织培养和工厂化育苗成功的关键，该问题受到研究者的广泛关注。
甲烷（Methane，CH4）作为一种信号分子，被证实能够提高内源NO水平，是NO通路的上游信号[7]， NO是第一个被发现的参与体内信号转导的气体信号分子，NO功能多样，调控方式可能是多靶点、多机制同时作用的网络调控[8]。目前已知，植物体内NO合成途径主要有酶促和非酶促两大类。酶促类途径主要通过一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)和硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)发挥作用[9]，而本实验使用的试剂SNP和PTIO都与NR相关，NR通过将NO2和 NO3转化为NO发挥作用[10]，SNP作为NO供体，其主要成分为亚硝基铁氰化钠(Na2Fe(CN)5NO2H2O)，进入细胞后其中的氧氮通过还原反应生成NO；NO清除剂PTIO与NO反应生成PTIO衍生物，同时产生亚硝酸盐或硝酸盐，从而起到清除NO的作用[9]。
亚硝基化(Snitrosylation)是近年来新发现的一种不依赖于环磷酸鸟苷（cyclic guanosinc monophosphate，cGMP)的NO信号传导途径，即NO可逆地共价结合到蛋白质半胱氨酸巯基(CysSH)上形成亚硝基硫醇(RCysSNO)[11]，是NO的作用机制之一。内源性或者外源性NO可以对蛋白质进行化学修饰，进而调节机体生理生化过程，已有的研究表明谷胱甘肽还原酶作为NO贮存体与NO可逆结合，产物能与其他蛋白发生转亚硝基化作用，进而调控SNOs 水平 [12,13]，之后的研究表明硫氧还蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶也可发挥此类作用[1416]。蛋白质亚硝基化与NO含量直接相关，亚硝基化能改变蛋白质的功能，包括增强或抑制蛋白酶的活性、改变蛋白质在细胞内的转运和亚细胞定位等，后续研究利用蛋白质组学和生物信息学方法，分析不同蛋白中的亚硝基化位点，进而确定亚硝基化修饰的可能规律 [1719]。
本课题以黄瓜外植体作为研究对象，探究CH4诱导后亚硝基化蛋白含量的变化。根据表型和不定根原基结果确定最合适的处理浓度和取样时间；同时前人研究证明了CH4和NO存在一定的关系[20,21]，本实验跟踪不定根原基发生的全过程，意图探明原基发生过程中CH4和NO的相互关系。
1材料与方法
1.1材料培养
本实验所采用的材料为黄瓜（Cucumis sativus L.）幼苗，品种为“露丰”，由江苏省江蔬种苗科技有限公司提供。种子使用5 %次氯酸钠消毒15 min后，用清水反复冲洗至少15 min，直至无异味，同时弃去漂浮的种子，均匀排布在铺有滤纸的大培养皿中，置于28 ℃培养箱中避光催芽2天，挑选长势均一的幼苗移至光照培养箱（上海恒科技有限公司）光照培养5天（光照培养周期为16 h /8 h、光强度200 μmol m2s1、温度28 ℃）至叶片完全展开，根系生长良好，用于下一步实验，培养液使用蒸馏水。
1.2试剂
未经特殊说明的试剂均购自Sigma公司(St Louis，MO，USA)。萘基邻氨甲酰苯甲酸（N(1Naphthyl)phthalamic Acid，NPA，生长素运输抑制剂）使用浓度为10 μM；硝普钠（Sodium nitroprusside，SNP，NO供体）使用浓度为50 μM；3氧代2苯基4，4，5，5四甲基咪唑啉1氧（2Phenyl4,4,5,5tetramethylimidazoline3oxide1oxyl，PTIO，NO清除剂）使用浓度为10 μM。实验所选浓度均通过预实验确定，均选择最适浓度。其余试剂均为国产分析纯。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1材料与方法 2
1.1材料培养 2
1.2试剂 2
1.3材料处理 3
1.4实验设计 3
1.5表型检测 3
1.6不定根原基检测 3
1.7蛋白质提取 3
1.8总蛋白含量测定 4
1.9亚硝基化含量测定 4
1.10数据分析 4
2结果与分析 4
2.1甲烷处理能促进不定根发生 4
2.2甲烷和一氧化氮促进不定根原基发育 5
2.3蛋白分析 6
2.4亚硝基化水平分析 7
3讨论 8
致谢 8
参考文献 9
甲烷诱导黄瓜不定根发生过程中S亚硝基水平的变化
引言
引言：不定根能加快水分、无机盐吸收，同时能贮存有机物，是植物生长过程中必需的重要器官，起到扩大植物吸收面积和增强固着，支持植物的功能[1]。正常情况下，不定根通常发生于植物受伤部位，随着植物信号转导机制不断被探明，证实激素和信号分子等也 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
会导致不定根发生，病害、虫害等相关研究也证实了其对不定根发生的作用。生长素作为植物生长最重要的激素，前人研究已经相当深入，拟南芥、绿豆、向日葵等植物可通过外源添加IAA、IBA、NAA、2,4D 等类生长素调节剂促进形成不定根[24]，使用萘基邻氨甲酰苯甲酸（Naphthyl carbamoylbenzoic acid，NPA，IAA极性运输抑制剂）处理植物插条，基部IAA含量减少，不定根发生率下降[5,6]。不定根的发生是园艺、林木植物移栽、扦插、组织培养和工厂化育苗成功的关键，该问题受到研究者的广泛关注。
甲烷（Methane，CH4）作为一种信号分子，被证实能够提高内源NO水平，是NO通路的上游信号[7]， NO是第一个被发现的参与体内信号转导的气体信号分子，NO功能多样，调控方式可能是多靶点、多机制同时作用的网络调控[8]。目前已知，植物体内NO合成途径主要有酶促和非酶促两大类。酶促类途径主要通过一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)和硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)发挥作用[9]，而本实验使用的试剂SNP和PTIO都与NR相关，NR通过将NO2和 NO3转化为NO发挥作用[10]，SNP作为NO供体，其主要成分为亚硝基铁氰化钠(Na2Fe(CN)5NO2H2O)，进入细胞后其中的氧氮通过还原反应生成NO；NO清除剂PTIO与NO反应生成PTIO衍生物，同时产生亚硝酸盐或硝酸盐，从而起到清除NO的作用[9]。
亚硝基化(Snitrosylation)是近年来新发现的一种不依赖于环磷酸鸟苷（cyclic guanosinc monophosphate，cGMP)的NO信号传导途径，即NO可逆地共价结合到蛋白质半胱氨酸巯基(CysSH)上形成亚硝基硫醇(RCysSNO)[11]，是NO的作用机制之一。内源性或者外源性NO可以对蛋白质进行化学修饰，进而调节机体生理生化过程，已有的研究表明谷胱甘肽还原酶作为NO贮存体与NO可逆结合，产物能与其他蛋白发生转亚硝基化作用，进而调控SNOs 水平 [12,13]，之后的研究表明硫氧还蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶也可发挥此类作用[1416]。蛋白质亚硝基化与NO含量直接相关，亚硝基化能改变蛋白质的功能，包括增强或抑制蛋白酶的活性、改变蛋白质在细胞内的转运和亚细胞定位等，后续研究利用蛋白质组学和生物信息学方法，分析不同蛋白中的亚硝基化位点，进而确定亚硝基化修饰的可能规律 [1719]。
本课题以黄瓜外植体作为研究对象，探究CH4诱导后亚硝基化蛋白含量的变化。根据表型和不定根原基结果确定最合适的处理浓度和取样时间；同时前人研究证明了CH4和NO存在一定的关系[20,21]，本实验跟踪不定根原基发生的全过程，意图探明原基发生过程中CH4和NO的相互关系。
1材料与方法
1.1材料培养
本实验所采用的材料为黄瓜（Cucumis sativus L.）幼苗，品种为“露丰”，由江苏省江蔬种苗科技有限公司提供。种子使用5 %次氯酸钠消毒15 min后，用清水反复冲洗至少15 min，直至无异味，同时弃去漂浮的种子，均匀排布在铺有滤纸的大培养皿中，置于28 ℃培养箱中避光催芽2天，挑选长势均一的幼苗移至光照培养箱（上海恒科技有限公司）光照培养5天（光照培养周期为16 h /8 h、光强度200 μmol m2s1、温度28 ℃）至叶片完全展开，根系生长良好，用于下一步实验，培养液使用蒸馏水。
1.2试剂
未经特殊说明的试剂均购自Sigma公司(St Louis，MO，USA)。萘基邻氨甲酰苯甲酸（N(1Naphthyl)phthalamic Acid，NPA，生长素运输抑制剂）使用浓度为10 μM；硝普钠（Sodium nitroprusside，SNP，NO供体）使用浓度为50 μM；3氧代2苯基4，4，5，5四甲基咪唑啉1氧（2Phenyl4,4,5,5tetramethylimidazoline3oxide1oxyl，PTIO，NO清除剂）使用浓度为10 μM。实验所选浓度均通过预实验确定，均选择最适浓度。其余试剂均为国产分析纯。
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