沙雷氏菌中ⅵ型分泌系统相关蛋白的基因克隆表达及表达产物的纯化
：T6SS是革兰氏阴性病原细菌的一种最近发现的分泌系统，其主要功能是增强细菌对外界环境的适应性和介导细菌对宿主细胞的致病力。L085_13715蛋白和L085_13790蛋白是粘质沙雷氏菌FS14菌株T6SS中的两种可溶性蛋白组分，本实验以粘质沙雷氏菌FS14的基因组DNA为模板，PCR扩增得到编码L085_13715蛋白和L085_13790蛋白的基因片段，以pET24b为载体构建重组表达质粒。用大肠杆菌作为宿主菌进行异源表达，获得了两种基因的表达产物，其中L085_13715主要以包涵体形式表达，而L085_13790蛋白则是可溶性表达。将L085_13790蛋白的表达产物通过Ni-NTA亲和层析进行纯化，并用葡聚糖凝胶过滤层析进行进一步的纯化，得到了高纯度的L085_13790蛋白。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.1.1 沙雷氏菌Serratia sp.FS14菌株 2
1.1.2 质粒和宿主菌 2
1.1.3 引物 2
1.1.4 培养基 3
1.1.5 酶和试剂 3
1.1.6 主要仪器和设备 3
1.2 实验方法 3
1.2.1 目的基因的PCR扩增及扩增产物回收纯化 3
1.2.1.1 PCR扩增 3
1.2.1.2 扩增产物的回收纯化 4
1.2.2 表达载体的构建 4
1.2.2.1 制备载体和插入片段 4
1.2.2.2 连接和转化 5
1.2.2.3 重组质粒鉴定 5
1.2.3 目的蛋白的诱导表达与表达产物的纯化 6
1.2.3.1 诱导表达 6
1.2.3.2 表达产物的纯化 6
1.2.3.3 凝胶过滤层析分析纯化蛋白的聚合状态 6
2 结果与分析 6
2.1 目的基因的扩增 6
2.2 表达载体的构建
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
7
2.2.1 目的基因和载体制备 7
2.2.2 重组质粒鉴定 7
2.3 目的蛋白的诱导表达与表达产物的纯化 8
2.3.1 诱导表达 8
2.3.2 表达产物的纯化 8
2.3.3 凝胶过滤层析分析蛋白聚合状态 9
3 讨论 10
致谢 11
参考文献 11
附录 试剂配制及实验操作方法 12
沙雷氏菌中Ⅵ型分泌系统相关蛋白的基因克隆表达
及表达产物的纯化
引言
引言
病原细菌一般通过分泌系统介导对宿主的致病作用，革兰氏阴性病原细菌能够分泌蛋白毒素进入外界环境，或者直接作用真核细胞的靶位点使宿主致病[1]。目前已发现革兰氏阴性细菌至少存在6种分泌系统，即Ⅰ型到Ⅵ型（T1SS到T6SS），T6SS是最新发现的一种分泌系统，广泛存在于革兰氏阴性菌变形菌门的细菌中[2]，主要由构成分泌系统的结构蛋白、形成跨膜管道结构的转位蛋白、分泌蛋白以及一些对分泌系统起辅助功能的蛋白组成[3][4]。T6SS的结构装置横跨细菌细胞内膜周质外膜，能够一步将效应蛋白转运出去并直接到达宿主细胞内，其转位蛋白缺少N端信号肽序列，转运过程中不需要识别分泌蛋白的N端信号肽[5][6]。
T6SS的主要结构分子包括IcmF同系物、编码ATP酶相关蛋白ClpV、一个叉头结合蛋白（FHA）、分泌蛋白VgrG（缬氨酸甘氨酸重复蛋白G）和Hcp（溶血素调节蛋白），其中VgrG和Hcp是T6SS中的效应子。ClpV家族的六聚物ATPase通过ATPase的水解作用为蛋白分泌作用供能。VgrG和Hcp组成与噬菌体组件相似的结构单元：尾突结构是噬菌体用来刺穿细菌的膜结构，噬菌体通过尾突将DNA注射到细胞内，VgrG蛋白形成三聚体，与T4噬菌体尾突的gp5/gp27蛋白复合物相似，3*（gp27/gp5）复合物在尾部的顶端组装，β螺旋针状结构由gp5的c末端区域形成，用于在靶细菌的外膜上穿孔[7]，另外还可以作为效应分子发挥作用；Hcp蛋白已被证明能够在胞外形成六聚环的结构[8]，铜绿假单胞菌和迟钝爱德华菌的Hcp同系物晶体的X射线分析结果表明，在一定条件下Hcp是以头对头或头对尾的六聚体组合[9]，因此推测其能在细菌细胞表面组装成一个通道，延伸或包围在VgrG蛋白形成的管道周围，从而使得其他的效应分子可以运输到寄主细胞。
T6SS的生物学功能主要是增强细菌对外界环境的适应性和介导细菌对宿主细胞的致病力[4]。T6SS可以介导霍乱弧菌对阿米巴原虫的抗吞噬性[10]、有利于鳗弧菌适应外界环境[12]、辅助铜绿假单胞菌分泌毒性蛋白抑制其他菌种的生长[11]；作为由致病细菌向宿主细胞分泌效应蛋白的途径，T6SS可以帮助细菌侵入宿主细胞，并最终对宿主致病。缺失了结构基因的迟钝爱德华氏菌[9]致病力明显下降，缺失结构基因uasK的霍乱弧菌突变株不能对巨噬细胞产生细胞毒性[10]。
近期研究报道了调控细菌中T6SS表达和激活的因素，目前已知的调控路径主要有：Fur（Ferricuptake regulator）在铁存在下抑制T6SS 转录[13]；bEBPs结合σ54激活 T6SS 转录[14]；TPP翻译后激活T6SS来响应表面附件[15]；细菌自我和非自我产生的信号通过Gac/Rsm或通过群体感应转录后调节T6SS[16]。了解T6SS的调控机制将有助于对其功能的进一步研究。
目前对于T6SS结构、功能、调控、分泌蛋白的种类和机制等的研究尚不充分，了解T6SS的作用机制和特性对明确一些革兰氏阴性细菌的致病机理、制定防控措施具有重要意义。本实验对沙雷氏菌Serratia sp.FS14菌株的T6SS相关蛋白L085_13715和L085_13790进行了克隆表达，为进行蛋白结晶并研究其结构和功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 沙雷氏菌Serratia sp.FS14菌株
由本实验室保存。
1.1.2 质粒和宿主菌
表达载体：pET24b，由本实验室保存；
克隆宿主菌：大肠杆菌(E.coli)菌株DH5α，由本实验室保存；
表达宿主菌：大肠杆菌(E.coli)菌株C43(DE3)，由本实验室保存。
1.1.3 引物
根据L085_13715(L085_13715)和L085_13790(L085_13790)基因序列设计上、下游引物，引物两端分别添加限制性内切酶位点NdeI和XhoI和保护碱基(下划线为酶切位点)
13715_forw：atgccatATGAGTGCGGAAATGATCG
13715_rev：tagtctcgagGAACGGGTTTTCCAGCGGTTC
13790_forw：ggaccatATGAGCACTGATTCAAGCG
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.1.1 沙雷氏菌Serratia sp.FS14菌株 2
1.1.2 质粒和宿主菌 2
1.1.3 引物 2
1.1.4 培养基 3
1.1.5 酶和试剂 3
1.1.6 主要仪器和设备 3
1.2 实验方法 3
1.2.1 目的基因的PCR扩增及扩增产物回收纯化 3
1.2.1.1 PCR扩增 3
1.2.1.2 扩增产物的回收纯化 4
1.2.2 表达载体的构建 4
1.2.2.1 制备载体和插入片段 4
1.2.2.2 连接和转化 5
1.2.2.3 重组质粒鉴定 5
1.2.3 目的蛋白的诱导表达与表达产物的纯化 6
1.2.3.1 诱导表达 6
1.2.3.2 表达产物的纯化 6
1.2.3.3 凝胶过滤层析分析纯化蛋白的聚合状态 6
2 结果与分析 6
2.1 目的基因的扩增 6
2.2 表达载体的构建
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
7
2.2.1 目的基因和载体制备 7
2.2.2 重组质粒鉴定 7
2.3 目的蛋白的诱导表达与表达产物的纯化 8
2.3.1 诱导表达 8
2.3.2 表达产物的纯化 8
2.3.3 凝胶过滤层析分析蛋白聚合状态 9
3 讨论 10
致谢 11
参考文献 11
附录 试剂配制及实验操作方法 12
沙雷氏菌中Ⅵ型分泌系统相关蛋白的基因克隆表达
及表达产物的纯化
引言
引言
病原细菌一般通过分泌系统介导对宿主的致病作用，革兰氏阴性病原细菌能够分泌蛋白毒素进入外界环境，或者直接作用真核细胞的靶位点使宿主致病[1]。目前已发现革兰氏阴性细菌至少存在6种分泌系统，即Ⅰ型到Ⅵ型（T1SS到T6SS），T6SS是最新发现的一种分泌系统，广泛存在于革兰氏阴性菌变形菌门的细菌中[2]，主要由构成分泌系统的结构蛋白、形成跨膜管道结构的转位蛋白、分泌蛋白以及一些对分泌系统起辅助功能的蛋白组成[3][4]。T6SS的结构装置横跨细菌细胞内膜周质外膜，能够一步将效应蛋白转运出去并直接到达宿主细胞内，其转位蛋白缺少N端信号肽序列，转运过程中不需要识别分泌蛋白的N端信号肽[5][6]。
T6SS的主要结构分子包括IcmF同系物、编码ATP酶相关蛋白ClpV、一个叉头结合蛋白（FHA）、分泌蛋白VgrG（缬氨酸甘氨酸重复蛋白G）和Hcp（溶血素调节蛋白），其中VgrG和Hcp是T6SS中的效应子。ClpV家族的六聚物ATPase通过ATPase的水解作用为蛋白分泌作用供能。VgrG和Hcp组成与噬菌体组件相似的结构单元：尾突结构是噬菌体用来刺穿细菌的膜结构，噬菌体通过尾突将DNA注射到细胞内，VgrG蛋白形成三聚体，与T4噬菌体尾突的gp5/gp27蛋白复合物相似，3*（gp27/gp5）复合物在尾部的顶端组装，β螺旋针状结构由gp5的c末端区域形成，用于在靶细菌的外膜上穿孔[7]，另外还可以作为效应分子发挥作用；Hcp蛋白已被证明能够在胞外形成六聚环的结构[8]，铜绿假单胞菌和迟钝爱德华菌的Hcp同系物晶体的X射线分析结果表明，在一定条件下Hcp是以头对头或头对尾的六聚体组合[9]，因此推测其能在细菌细胞表面组装成一个通道，延伸或包围在VgrG蛋白形成的管道周围，从而使得其他的效应分子可以运输到寄主细胞。
T6SS的生物学功能主要是增强细菌对外界环境的适应性和介导细菌对宿主细胞的致病力[4]。T6SS可以介导霍乱弧菌对阿米巴原虫的抗吞噬性[10]、有利于鳗弧菌适应外界环境[12]、辅助铜绿假单胞菌分泌毒性蛋白抑制其他菌种的生长[11]；作为由致病细菌向宿主细胞分泌效应蛋白的途径，T6SS可以帮助细菌侵入宿主细胞，并最终对宿主致病。缺失了结构基因的迟钝爱德华氏菌[9]致病力明显下降，缺失结构基因uasK的霍乱弧菌突变株不能对巨噬细胞产生细胞毒性[10]。
近期研究报道了调控细菌中T6SS表达和激活的因素，目前已知的调控路径主要有：Fur（Ferricuptake regulator）在铁存在下抑制T6SS 转录[13]；bEBPs结合σ54激活 T6SS 转录[14]；TPP翻译后激活T6SS来响应表面附件[15]；细菌自我和非自我产生的信号通过Gac/Rsm或通过群体感应转录后调节T6SS[16]。了解T6SS的调控机制将有助于对其功能的进一步研究。
目前对于T6SS结构、功能、调控、分泌蛋白的种类和机制等的研究尚不充分，了解T6SS的作用机制和特性对明确一些革兰氏阴性细菌的致病机理、制定防控措施具有重要意义。本实验对沙雷氏菌Serratia sp.FS14菌株的T6SS相关蛋白L085_13715和L085_13790进行了克隆表达，为进行蛋白结晶并研究其结构和功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 沙雷氏菌Serratia sp.FS14菌株
由本实验室保存。
1.1.2 质粒和宿主菌
表达载体：pET24b，由本实验室保存；
克隆宿主菌：大肠杆菌(E.coli)菌株DH5α，由本实验室保存；
表达宿主菌：大肠杆菌(E.coli)菌株C43(DE3)，由本实验室保存。
1.1.3 引物
根据L085_13715(L085_13715)和L085_13790(L085_13790)基因序列设计上、下游引物，引物两端分别添加限制性内切酶位点NdeI和XhoI和保护碱基(下划线为酶切位点)
13715_forw：atgccatATGAGTGCGGAAATGATCG
13715_rev：tagtctcgagGAACGGGTTTTCCAGCGGTTC
13790_forw：ggaccatATGAGCACTGATTCAAGCG
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/smkx/352.html
