四氢嘧啶高产菌种的分离筛选与菌种鉴定
：本课题从盐碱土中分离筛选到到一株高产的四氢嘧啶产生菌W2，该菌株能够耐受3~15%的NaCl盐分，属于中度嗜盐菌。经过16S rDNA序列分析，结合形态学和生理生化特征分析，该菌株初步被鉴定为Halomonas ventosae。W2菌株的最适生长条件为35℃、pH 8.0和NaCl浓度9%，而合成四氢嘧啶的最适发酵条件为35℃、pH 7.0和NaCl浓度12%。在最佳发酵条件下，该菌株合成的四氢嘧啶产量占菌体蛋白的比例达44.39%，因此W2是一株较有应用潜力的四氢嘧啶产生菌株。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1菌株的富集、分离纯化2
1.2.2菌株形态学、生理生化特征的测定2
1.2.3 16S rDNA的测序与菌种鉴定2
1.2.4菌株W2发酵条件的研究2
1.3化学分析3
1.3.1菌体蛋白的测定（Folin酚法） 3
1.3.2菌株的四氢嘧啶的定量分析3
2结果与分析3
2.1菌株的分离纯化结果与四氢嘧啶产量的初步测定 3
2.2菌株W2的生理生化特性及鉴定结果 4
2.3菌株W2发酵条件的研究 4
2.3.1培养温度对菌株W2生长和四氢嘧啶产量的影响4
2.3.2 pH对菌株W2生长和四氢嘧啶产量的影响 5
2.3.3盐浓度对菌株W2生长和四氢嘧啶产量的影响6
3小结与讨论6
致谢7
参考文献7
四氢嘧啶高产菌种的分离筛选与菌种鉴定
生命基地学生 段博文
引言
引言 四氢嘧啶（1,4,5,6四氢2甲基4嘧啶羧酸）是中度嗜盐菌应对高盐环境而合成的渗透压补偿性溶质[1,2]。研究发现，四氢嘧啶不仅可以作为渗透压补偿性溶质，保护细菌细胞在高渗环境中生长，而且可以对处于高温、冷冻、射线等极端环境中细菌细胞的蛋白质、酶、核酸等起到保护作用[3,4]
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
，基于四氢嘧啶的这些保护作用，我们可将其运用在化妆品、生物制剂、酶制剂等工业领域中，这对我们的生产生活有着极其重要的意义[5,6]。然而四氢嘧啶含有一个手性碳原子，运用普通的化学合成方法很难合成，微生物发酵法是现有生产四氢嘧啶主要的方法。常用的四氢嘧啶制备方法有分批发酵罐法、流加发酵罐法、细菌挤奶法等，其中细菌挤奶（Bacterial milking）具有工艺简单，菌体细胞可反复使用等优点，是最有潜力的制备方法，其原理是通过反复的高渗和低渗条件刺激细胞，使细胞内积累的四氢嘧啶在最终向培养基中定向分泌。
目前，工业上微生物发酵法生产四氢嘧啶的工艺仍然存在着成本高、产量低等弊端，因此，怎样提高四氢嘧啶产量、降低生产成本已成为国内外研究学者共同关注的问题。本课题的目的就是从高盐环境中分离筛选出高产四氢嘧啶的耐盐菌株，并进行菌种鉴定，找出其最适的发酵条件（温度，pH和盐浓度等），研究采用细菌挤奶方法进行四氢嘧啶生产的可行性，为四氢嘧啶的发酵生产积累菌种资源。
1材料与方法
1.1材料
盐碱土采自江苏省射阳某地。
培养基（g/L）：乙酸2，MgSO47H2O 0.25，K2HPO4 0.2，（NH4）2SO4 0.5，CaCl2 0.02，NaCl 100（或视需要添加），pH 7.0。
1.2方法
1.2.1菌株的富集、分离与纯化
称取盐碱土样3 g，加入到盛有100 mL培养基的三角瓶中，置于30℃，170 r/min摇床培养，定期观察菌体生长情况。5 d后将富集液进行梯度稀释并涂布于固体培养基平板，30℃培养7 d，从平板上挑取单菌落划线纯化后，将纯化的菌株再次接种至新鲜培养基斜面，置于4℃冰箱保存备用。
1.2.2菌株形态学、生理生化特征的测定
将W2涂布培养于乙酸培养基平板，长出单菌落后观察菌落形态，挑取少量菌体制成涂片，经结晶紫简单染色后油镜下观察菌体形态，细菌的革兰氏染色及生理生化试验均按照东秀珠、蔡妙英编著的《常见细菌系统鉴定手册》中的标准方法进行[7]。
1.2.3 16S rDNA的测序与菌种鉴定
用无菌牙签从乙酸培养基平板上挑取少量幼嫩菌体直接进行16S rDNA扩增，PCR扩增正向引物为5’—CAGGCCTAACACATGCAAGTC—3’，反向引物为5’—GGGCGGWGTGTACAAGGC—3’，扩增体系为双蒸水（灭菌）34 μL，10×PCR buffer 5 μL，Mg2+（25 mmol/L）3 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)5 μL,引物（25 pmol/μL）各1 μL，Taq 1μL。扩增程序：94℃变性2 min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃1 min，30个循环；最后72℃延伸20 min。扩增产物送往金斯瑞生物公司测序。所得序列在Gene Bank中检索该菌的种属，选取相似性高的菌株，用MEGA 6.0软件制作进化树。
1.2.4菌株W2发酵条件的研究
1.2.4.1菌株W2最适温度的研究
将10 mL已活化的菌种接入含有90 mL的乙酸培养基的三角瓶中，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃摇床培养，转速均为170 r/min，培养30 h后从各摇瓶中分别均匀吸取2份1 mL的培养液于2 mL离心管中，8000 r/min离心4 min，倾去上清液，其中1管用1 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液溶解，再用Folin酚法测定菌体蛋白量，另一管加入1 mL 80%乙醇悬浮过夜，再离心取上清液用于测定四氢嘧啶含量。
1.2.4.2菌株W2最适pH的研究
将90 mL初始pH分别为5、6、7、8、9、10和11的乙酸培养基装入相应的250 mL三角瓶中，接种10 mL事先活化的种子液，置于35℃、170 r/min摇床中培养。培养30 h后各取1 mL培养液，8000 r/min离心4 min沉淀菌体， 加入1 mL 0.5 mol/L NaOH溶液待菌体溶解后，再用Folin酚法测定菌体蛋白量。各三角瓶另取1 mL培养液，相同条件下离心沉淀菌体，加入1 mL 80%乙醇悬浮过夜，再离心取上清液用于测定四氢嘧啶产量。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1菌株的富集、分离纯化2
1.2.2菌株形态学、生理生化特征的测定2
1.2.3 16S rDNA的测序与菌种鉴定2
1.2.4菌株W2发酵条件的研究2
1.3化学分析3
1.3.1菌体蛋白的测定（Folin酚法） 3
1.3.2菌株的四氢嘧啶的定量分析3
2结果与分析3
2.1菌株的分离纯化结果与四氢嘧啶产量的初步测定 3
2.2菌株W2的生理生化特性及鉴定结果 4
2.3菌株W2发酵条件的研究 4
2.3.1培养温度对菌株W2生长和四氢嘧啶产量的影响4
2.3.2 pH对菌株W2生长和四氢嘧啶产量的影响 5
2.3.3盐浓度对菌株W2生长和四氢嘧啶产量的影响6
3小结与讨论6
致谢7
参考文献7
四氢嘧啶高产菌种的分离筛选与菌种鉴定
生命基地学生 段博文
引言
引言 四氢嘧啶（1,4,5,6四氢2甲基4嘧啶羧酸）是中度嗜盐菌应对高盐环境而合成的渗透压补偿性溶质[1,2]。研究发现，四氢嘧啶不仅可以作为渗透压补偿性溶质，保护细菌细胞在高渗环境中生长，而且可以对处于高温、冷冻、射线等极端环境中细菌细胞的蛋白质、酶、核酸等起到保护作用[3,4]
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
，基于四氢嘧啶的这些保护作用，我们可将其运用在化妆品、生物制剂、酶制剂等工业领域中，这对我们的生产生活有着极其重要的意义[5,6]。然而四氢嘧啶含有一个手性碳原子，运用普通的化学合成方法很难合成，微生物发酵法是现有生产四氢嘧啶主要的方法。常用的四氢嘧啶制备方法有分批发酵罐法、流加发酵罐法、细菌挤奶法等，其中细菌挤奶（Bacterial milking）具有工艺简单，菌体细胞可反复使用等优点，是最有潜力的制备方法，其原理是通过反复的高渗和低渗条件刺激细胞，使细胞内积累的四氢嘧啶在最终向培养基中定向分泌。
目前，工业上微生物发酵法生产四氢嘧啶的工艺仍然存在着成本高、产量低等弊端，因此，怎样提高四氢嘧啶产量、降低生产成本已成为国内外研究学者共同关注的问题。本课题的目的就是从高盐环境中分离筛选出高产四氢嘧啶的耐盐菌株，并进行菌种鉴定，找出其最适的发酵条件（温度，pH和盐浓度等），研究采用细菌挤奶方法进行四氢嘧啶生产的可行性，为四氢嘧啶的发酵生产积累菌种资源。
1材料与方法
1.1材料
盐碱土采自江苏省射阳某地。
培养基（g/L）：乙酸2，MgSO47H2O 0.25，K2HPO4 0.2，（NH4）2SO4 0.5，CaCl2 0.02，NaCl 100（或视需要添加），pH 7.0。
1.2方法
1.2.1菌株的富集、分离与纯化
称取盐碱土样3 g，加入到盛有100 mL培养基的三角瓶中，置于30℃，170 r/min摇床培养，定期观察菌体生长情况。5 d后将富集液进行梯度稀释并涂布于固体培养基平板，30℃培养7 d，从平板上挑取单菌落划线纯化后，将纯化的菌株再次接种至新鲜培养基斜面，置于4℃冰箱保存备用。
1.2.2菌株形态学、生理生化特征的测定
将W2涂布培养于乙酸培养基平板，长出单菌落后观察菌落形态，挑取少量菌体制成涂片，经结晶紫简单染色后油镜下观察菌体形态，细菌的革兰氏染色及生理生化试验均按照东秀珠、蔡妙英编著的《常见细菌系统鉴定手册》中的标准方法进行[7]。
1.2.3 16S rDNA的测序与菌种鉴定
用无菌牙签从乙酸培养基平板上挑取少量幼嫩菌体直接进行16S rDNA扩增，PCR扩增正向引物为5’—CAGGCCTAACACATGCAAGTC—3’，反向引物为5’—GGGCGGWGTGTACAAGGC—3’，扩增体系为双蒸水（灭菌）34 μL，10×PCR buffer 5 μL，Mg2+（25 mmol/L）3 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)5 μL,引物（25 pmol/μL）各1 μL，Taq 1μL。扩增程序：94℃变性2 min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃1 min，30个循环；最后72℃延伸20 min。扩增产物送往金斯瑞生物公司测序。所得序列在Gene Bank中检索该菌的种属，选取相似性高的菌株，用MEGA 6.0软件制作进化树。
1.2.4菌株W2发酵条件的研究
1.2.4.1菌株W2最适温度的研究
将10 mL已活化的菌种接入含有90 mL的乙酸培养基的三角瓶中，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃摇床培养，转速均为170 r/min，培养30 h后从各摇瓶中分别均匀吸取2份1 mL的培养液于2 mL离心管中，8000 r/min离心4 min，倾去上清液，其中1管用1 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液溶解，再用Folin酚法测定菌体蛋白量，另一管加入1 mL 80%乙醇悬浮过夜，再离心取上清液用于测定四氢嘧啶含量。
1.2.4.2菌株W2最适pH的研究
将90 mL初始pH分别为5、6、7、8、9、10和11的乙酸培养基装入相应的250 mL三角瓶中，接种10 mL事先活化的种子液，置于35℃、170 r/min摇床中培养。培养30 h后各取1 mL培养液，8000 r/min离心4 min沉淀菌体， 加入1 mL 0.5 mol/L NaOH溶液待菌体溶解后，再用Folin酚法测定菌体蛋白量。各三角瓶另取1 mL培养液，相同条件下离心沉淀菌体，加入1 mL 80%乙醇悬浮过夜，再离心取上清液用于测定四氢嘧啶产量。
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