与糖异生相关的基因ppsa和pcka对霍乱弧菌定殖的影响
：通过野生型霍乱弧菌及其突变型在乳鼠肠道内的定殖实验，我们发现其在定殖过程中的定殖抗力受到某些代谢途径的影响。我们在乳鼠定殖实验中的到的初步结论是，当这些代谢途径缺失时，突变型所受的定殖抗力会受到一定的影响。之后在含有不同碳源的M9培养基中测定野生型和突变型的生长曲线，进一步明确这种影响是否存在。这帮助我们对霍乱弧菌定殖过程中的定殖抗力与相关的代谢过程建立了初步的联系，为进一步研究霍乱弧菌的定殖过程奠定了一定的基础。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
1 引言 2
1.1 霍乱与霍乱弧菌 2
1.1.1 霍乱的流行概况 2
1.1.2 霍乱弧菌的致病机理 3
1.2 定殖与定殖抗力 3
1.3 蓝白筛选的原理及其应用 3
1.4 霍乱弧菌中部分与代谢相关的基因 4
2 实验材料 5
2.1 菌种 5
2.2 实验动物 5
2.3 培养基与溶液 5
2.4 试剂 5
2.5 所需实验器材及耗材 5
3 实验方法 5
3.1 乳鼠定殖实验 5
3.1.1 菌种平板活化及菌液浓度调节 5
3.1.2 乳鼠的灌喂接菌 5
3.1.3 乳鼠的解剖与处理 6
3.2 霍乱弧菌生长曲线测定实验 6
3.2.1 菌种平板活化及菌液浓度调整 6
3.2.2 接菌及OD600测定 6
4 实验结果 6
4.1 乳鼠定殖实验的结果 6
4.1.1 时间对定殖数量的影响 6
4.1.2 ppsA基因突变对霍乱弧菌定殖的影响 7
4.1.3 pckA基因突变对霍乱弧菌定殖的影响 7
4.2 霍乱弧菌生长曲线测定实验结果 8
5 分析与讨论 9
5.1 ppsA和pckA基因对霍乱弧菌定殖的影响 9
5.2 生长曲线分
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
析 10
5.2.1 △ppsA生长曲线分析 10
5.2.2 △pckA生长曲线分析 10
致谢 10
参考文献 11
与糖异生相关的基因ppsA和pckA对霍乱弧菌定殖的影响
生物基地 王戴君
引言
1 引言
1.1 霍乱与霍乱弧菌
霍乱弧菌（Vibrio cholerae，VC）是一种革兰氏阴性菌[1]，是引起人类霍乱（Cholerae）的病原体。在自然环境中，人类是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过被污染的水源或食物使经口传播。其临床症状表现为急性分泌性腹泻，大便为米泔样，并且伴有呕吐，严重者甚至会导致死亡[2]。
1.1.1 霍乱的流行概况
自1817年以来已经爆发过7次世界性的霍乱大流行，每次爆发都带来了巨大的损失。最近的一次霍乱爆发是2012年西非国家塞拉利昂和几内亚发生的霍乱大流行，造成上万人被感染，二百多人死亡，本次疫情直到现在仍未被有效控制。每年有约3至5百万例霍乱病例，有1至2万人死亡。霍乱是对人类影响巨大的非常严重的烈性传染病，但目前对霍乱仍未有有效的控制。
霍乱在第一次爆发时就已经传播到中国，此后的六次世界性的霍乱流行均波及我国。尽管随着公共卫生事业的发展，霍乱在我国的爆发呈逐年下降趋势，但仍有零星疫情。2012年湖北省黄石市出现霍乱感染疫情。目前我国仍处于霍乱爆发的高风险期[3]。
1.1.2 霍乱弧菌的致病机理
霍乱弧菌在进入人体宿主胃部后，大部分会被胃酸杀死，少数幸存下来的霍乱弧菌在重新适应肠道微环境，如胆汁、渗透压、氧含量、pH等后，定殖（colonzation)于小肠上并产生主要的毒力因子——霍乱毒素（cholera toxin，CT)，其与毒素供调节菌毛（toxincoregulated pilus，TCP）共同作用，最终引起人类霍乱[2]。霍乱毒素是一种蛋白质毒素，是由1个A亚基和5个B亚基组成。作用时，B亚基的五聚体会与真核细胞的神经节苷脂GM1结合，A亚基被转运至胞内，扮演激活腺苷酸环化酶的角色，使胞内的cAMP的含量增高。上述的机制导致了细胞的Cl通道加速分泌Cl，引起分泌性腹泻。毒力因子是一种毒素共调节菌毛，也是表达受霍乱毒素调节的定殖因子[4]。
1.2 定殖与定殖抗力
荷兰微生物学家Van der Waaij等人于1971年提出肠道微生物定殖抗力（colonization resistance，CR）的概念[5]，认为肠道内原籍菌（autochthonous flora）具有抑制外籍菌（allochthonous flora）数量的能力，这种由肠道正常菌群提供的对致病菌和潜在致病菌在肠道中定殖和增殖的抵抗性称为定殖抗力[6]。目前通过对大肠杆菌的研究表明，产生定殖抗力的机制主要有直接抑制、营养物争夺和刺激免疫防御三个方面，但目前国内外对于霍乱弧菌在定殖过程中是否会受到这些方面的影响尚无太多研究[5][6]。因此，本实验希望通过从营养物质代谢这一角度来探索霍乱弧菌是否会因竞争营养物而在其定殖过程中产生定殖抗力。
1.3 蓝白筛选的原理及其应用
蓝白筛选的原理是Lac Z基因所编码的β半乳糖苷酶（βgal）可以将Xgal（5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷）分解成半乳糖和深蓝色的物质5溴4靛蓝。将含有Lac Z基因的转座子插入霍乱弧菌基因后，含有LacZ基因的突变型在培养后会显现蓝色，而没有插入转座子的野生型菌由于不含LacZ基因在培养后便显现白色，从而能够可以对二者进行辨别[7]。
1.4 霍乱弧菌中部分与代谢相关的基因
本课题组利用转座子插入失活，获得了如表11所示的11个与霍乱弧菌某些代谢相关的基因。
表11：霍乱弧菌中11个与部分代谢相关的基因
Gene
Function
VCA0954
maltose?ABC?transporter?(for?maltose)
VCA0127
Dribose?pyranase?(for?ribose)
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
1 引言 2
1.1 霍乱与霍乱弧菌 2
1.1.1 霍乱的流行概况 2
1.1.2 霍乱弧菌的致病机理 3
1.2 定殖与定殖抗力 3
1.3 蓝白筛选的原理及其应用 3
1.4 霍乱弧菌中部分与代谢相关的基因 4
2 实验材料 5
2.1 菌种 5
2.2 实验动物 5
2.3 培养基与溶液 5
2.4 试剂 5
2.5 所需实验器材及耗材 5
3 实验方法 5
3.1 乳鼠定殖实验 5
3.1.1 菌种平板活化及菌液浓度调节 5
3.1.2 乳鼠的灌喂接菌 5
3.1.3 乳鼠的解剖与处理 6
3.2 霍乱弧菌生长曲线测定实验 6
3.2.1 菌种平板活化及菌液浓度调整 6
3.2.2 接菌及OD600测定 6
4 实验结果 6
4.1 乳鼠定殖实验的结果 6
4.1.1 时间对定殖数量的影响 6
4.1.2 ppsA基因突变对霍乱弧菌定殖的影响 7
4.1.3 pckA基因突变对霍乱弧菌定殖的影响 7
4.2 霍乱弧菌生长曲线测定实验结果 8
5 分析与讨论 9
5.1 ppsA和pckA基因对霍乱弧菌定殖的影响 9
5.2 生长曲线分
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
析 10
5.2.1 △ppsA生长曲线分析 10
5.2.2 △pckA生长曲线分析 10
致谢 10
参考文献 11
与糖异生相关的基因ppsA和pckA对霍乱弧菌定殖的影响
生物基地 王戴君
引言
1 引言
1.1 霍乱与霍乱弧菌
霍乱弧菌（Vibrio cholerae，VC）是一种革兰氏阴性菌[1]，是引起人类霍乱（Cholerae）的病原体。在自然环境中，人类是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过被污染的水源或食物使经口传播。其临床症状表现为急性分泌性腹泻，大便为米泔样，并且伴有呕吐，严重者甚至会导致死亡[2]。
1.1.1 霍乱的流行概况
自1817年以来已经爆发过7次世界性的霍乱大流行，每次爆发都带来了巨大的损失。最近的一次霍乱爆发是2012年西非国家塞拉利昂和几内亚发生的霍乱大流行，造成上万人被感染，二百多人死亡，本次疫情直到现在仍未被有效控制。每年有约3至5百万例霍乱病例，有1至2万人死亡。霍乱是对人类影响巨大的非常严重的烈性传染病，但目前对霍乱仍未有有效的控制。
霍乱在第一次爆发时就已经传播到中国，此后的六次世界性的霍乱流行均波及我国。尽管随着公共卫生事业的发展，霍乱在我国的爆发呈逐年下降趋势，但仍有零星疫情。2012年湖北省黄石市出现霍乱感染疫情。目前我国仍处于霍乱爆发的高风险期[3]。
1.1.2 霍乱弧菌的致病机理
霍乱弧菌在进入人体宿主胃部后，大部分会被胃酸杀死，少数幸存下来的霍乱弧菌在重新适应肠道微环境，如胆汁、渗透压、氧含量、pH等后，定殖（colonzation)于小肠上并产生主要的毒力因子——霍乱毒素（cholera toxin，CT)，其与毒素供调节菌毛（toxincoregulated pilus，TCP）共同作用，最终引起人类霍乱[2]。霍乱毒素是一种蛋白质毒素，是由1个A亚基和5个B亚基组成。作用时，B亚基的五聚体会与真核细胞的神经节苷脂GM1结合，A亚基被转运至胞内，扮演激活腺苷酸环化酶的角色，使胞内的cAMP的含量增高。上述的机制导致了细胞的Cl通道加速分泌Cl，引起分泌性腹泻。毒力因子是一种毒素共调节菌毛，也是表达受霍乱毒素调节的定殖因子[4]。
1.2 定殖与定殖抗力
荷兰微生物学家Van der Waaij等人于1971年提出肠道微生物定殖抗力（colonization resistance，CR）的概念[5]，认为肠道内原籍菌（autochthonous flora）具有抑制外籍菌（allochthonous flora）数量的能力，这种由肠道正常菌群提供的对致病菌和潜在致病菌在肠道中定殖和增殖的抵抗性称为定殖抗力[6]。目前通过对大肠杆菌的研究表明，产生定殖抗力的机制主要有直接抑制、营养物争夺和刺激免疫防御三个方面，但目前国内外对于霍乱弧菌在定殖过程中是否会受到这些方面的影响尚无太多研究[5][6]。因此，本实验希望通过从营养物质代谢这一角度来探索霍乱弧菌是否会因竞争营养物而在其定殖过程中产生定殖抗力。
1.3 蓝白筛选的原理及其应用
蓝白筛选的原理是Lac Z基因所编码的β半乳糖苷酶（βgal）可以将Xgal（5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷）分解成半乳糖和深蓝色的物质5溴4靛蓝。将含有Lac Z基因的转座子插入霍乱弧菌基因后，含有LacZ基因的突变型在培养后会显现蓝色，而没有插入转座子的野生型菌由于不含LacZ基因在培养后便显现白色，从而能够可以对二者进行辨别[7]。
1.4 霍乱弧菌中部分与代谢相关的基因
本课题组利用转座子插入失活，获得了如表11所示的11个与霍乱弧菌某些代谢相关的基因。
表11：霍乱弧菌中11个与部分代谢相关的基因
Gene
Function
VCA0954
maltose?ABC?transporter?(for?maltose)
VCA0127
Dribose?pyranase?(for?ribose)
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