水稻中植物特有型RAB5蛋白的基因克隆及亚细胞定位研究
水稻中植物特有型RAB5蛋白的基因克隆及亚细胞定位研究[20200614172129]
摘要：黄花月见草是一种铜排斥性植物，具有较强的耐铜性，但其耐性机制尚不清楚。本文对黄花月见草进行外源柠檬酸处理试验，通过比较地上部、根部铜含量以及铜转运系数，发现在本试验基础上外源柠檬酸对黄花月见草铜胁迫没有显著的缓解效果。进一步用高效液相色谱检测铜处理下黄花月见草的根系分泌物，结果显示黄花月见草通过根系分泌的酒石酸作为重金属铜的螯合剂来抑制铜的吸收，从而增强其耐铜性。定量分析显示，在50μmol/L的CuSO4处理下，酒石酸分泌逐渐增多并在12h达到峰值3.272E+03 mg/kg，然后逐步减少，72h之后又明显低于处理前的水平。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:耐铜性；外源柠檬酸；高效液相色谱；根系分泌物
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2试验方法 2
1.2.1育苗 2
1.2.2外源柠檬酸前处理试验2
1.2.3外源柠檬酸后处理试验2
1.2.4外源柠檬酸同时处理试验2
1.2.5黄花月见草根系分泌物的高效液相色谱分析3
1.3 统计方法3
2 结果与分析 3
2.1 外源柠檬酸前处理对黄花月见草铜胁迫的缓解效应3
2.2 外源柠檬酸后处理对黄花月见草铜胁迫的缓解效应4
2.3 外源柠檬酸同时处理对黄花月见草铜胁迫的缓解效应6
2.4 黄花月见草根系分泌物的高效液相色谱分析7
3 讨论8
3.1外源柠檬酸处理对黄花月见草铜胁迫的缓解效应9
3.2黄花月见草根系分泌物的高效液相色谱分析9
致谢10
参考文献10
黄花月见草根系分泌物缓解铜胁迫的作用机制
引言
引言
我国有丰富的矿产资源，但长期的无节制开采造成了越来越多的土壤受到严重的重金属污染，其中Cu是土壤污染的主要因素之一。Cu是植物生长发育必须的微量元素。一般植物的叶片中Cu的正常含量为3–20 mgkg-1，含量大于30 mgkg-1则可能引起中毒[13]。过量的Cu不仅对植物生长有毒害作用，同时会对人体健康造成极大的危害，因此研究植物如何吸收Cu，并研究Cu在整个植物体内积累和运输的机制，对开发植物修复技术和恢复生态环境具有重要意义 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
。
因此，用合适的方法来对重金属污染土壤进行修复成为当前迫切的需要。而黄花月见草就是目前已知的一种排斥性铜耐性植物，其作用机制与超积累植物不同[8]。人们已经对铜污染进行了大量研究[9]，但是对于铜耐性植物黄花月见草的耐性机制却尚不清楚。如何更好的利用其铜耐性和稳定的修复能力，恢复土壤污染区的植被覆盖，减少水土流失并降低重金属的迁移扩散就成为了一个颇具意义的课题。因此本文针对黄花月见草耐铜性机制以及提高其耐性的方法进行了一系列试验。
有机酸是植物分泌的帮助其自身缓解重金属胁迫的重要方式。其中柠檬酸被认为是一种常见而有效的重金属螯合剂，对水稻、大豆等植物的重金属胁迫都有显著的缓解效果。因此，试验开始首先鉴定外源柠檬酸对黄花月见草的作用效果，随后进一步分析根系分泌物，验证黄花月见草的铜排斥机理，为阐明其耐性机制提供依据。
1 材料与方法
1．1 试验材料
黄花月见草种子（Oenothera glazioviana）；铜胁迫用50μmol/L硫酸铜；1000ppm（1g/L）的草酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸标准溶液。
1．2 试验方法
1. 2. 1 育苗
以蛭石为基质，均匀播种经过氧化氢消毒后的黄花月见草种子，灭菌后用去离子水保湿。两周后移苗，用Hoagland营养液水培，根据黄花月见草的生长状况从四分之一到二分之一过渡到全培养液。每三天换一次培养液，恒温25℃下温室培养，三到四周后待黄花月见草长到足够大小即可进行试验处理。
Hoagland营养液配方：
母液浓度 每升
Ca(NO3)2 1mol/L 5mL
KNO3 1mol/L 5mL
MgSO4 1mol/L 2mL
KH2PO4 1mol/L 1mL
Fe-EDTA — 1mL
微量元素 — 1mL
1. 2. 2 外源柠檬酸前处理试验
用5μmol/L的柠檬酸处理实验组并调节pH，对照组加等量去离子水。24小时后用50μmol/L的硫酸铜溶液处理实验组和对照组。分别测量0、6、12、24、48和72小时后黄花月见草地上部分和根部的铜含量。测量方法为火焰原子吸收法。即在相应时间段烘干试验材料，称量并消煮。消煮中加入5ml HNO3 + HClO4 (V:V=87:13) 混合酸消煮完全。样品消煮过程中以消煮的混合酸为空白，以消除消煮和分析过程中带来的误差。先冷消煮再热消煮数小时直到消煮管底部仅剩白色细小结晶。回溶储存后用火焰原子吸收分光光度计测量铜含量[16]。
转运系数（TF translocation factors）= 地上部铜含量/根系铜含量[15]。
1. 2. 3 外源柠檬酸后处理试验
即先用50μmol/L的硫酸铜溶液处理实验组和对照组，6小时后用5μmol/L的柠檬酸处理实验组并调节pH，对照组加等量去离子水。分别测量0、12、24、48和72小时后黄花月见草地上部分和根部的铜含量。
1. 2. 4 外源柠檬酸和铜的同时处理试验
即用50μmol/L的硫酸铜溶液和柠檬酸同时处理黄花 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
月见草并调节pH。柠檬酸设立0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L五个浓度梯度。分别测量0、6、12、24、48和72小时后地上部分和根部的铜含量。
1. 2. 5 黄花月见草根系分泌物的高效液相色谱分析
用50μmol/L的硫酸铜溶液处理黄花月见草，测定0、6、12、24、48和72小时后黄花月见草的根系分泌物及含量。先取铜处理后相应时间段的黄花月见草，用去离子水将根彻底冲洗干净，将植物的根系，黑暗培养4oC过夜，放入盛有100ml超纯水（已灭菌）的组培瓶中，25 oC光照培养4h，用去离子水冲洗根系，获得100ml的根系分泌物溶液，根系烘干后准确称取干重[13]。 旋转蒸发仪浓缩收集的根系分泌物溶液，每株样品定容到10ml。将浓缩的样品进行高效液相色谱分析。首先配制50%、5%的甲醇过渡性清洗色谱柱。配制磷酸氢二钠的1%甲醇溶液作为流动相（pH调为2.4），测量前平衡色谱柱。流动相、样品在测量前分别经过了抽滤和注射式微孔滤膜进行过滤。用1000ppm（1g/L）的草酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸作为单标，并用200ppm的五种酸混合作为混酸标样。测定标样的有机酸出峰时间，对照标准样品，分别定性和定量测定0、6、12、24、48和72小时的黄花月见草根系分泌物。
1．3 统计方法
利用Excel 软件统计，用LSD分析方法对数据进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2．1 外源柠檬酸前处理对黄花月见草铜胁迫的缓解效应
图3-3 不同浓度柠檬酸和铜同时处理下黄花月见草的铜转运系数。
2．4 黄花月见草铜胁迫下根系分泌物的高效液相色谱分析
由图4-1可知，五种有机酸保留时间依次是：草酸（4分50秒），酒石酸（5分20秒），苹果酸（6分20秒），柠檬酸（7分30秒），琥珀酸（9分30秒）。由于流动相选择的原因，草酸与酒石酸没有分开，但结合单标可以判断是两个峰型。8分40秒的倒峰判断是系统误差，因为每一个图在相同的时间出现相似倒峰。而其他保留时间的倒峰则有可能是进样时带入气泡产生的操作误差。而苹果酸、柠檬酸、琥珀酸的标样图中不同程度地出现了杂峰，可能是配制标样过程中混入了杂质。
摘要：黄花月见草是一种铜排斥性植物，具有较强的耐铜性，但其耐性机制尚不清楚。本文对黄花月见草进行外源柠檬酸处理试验，通过比较地上部、根部铜含量以及铜转运系数，发现在本试验基础上外源柠檬酸对黄花月见草铜胁迫没有显著的缓解效果。进一步用高效液相色谱检测铜处理下黄花月见草的根系分泌物，结果显示黄花月见草通过根系分泌的酒石酸作为重金属铜的螯合剂来抑制铜的吸收，从而增强其耐铜性。定量分析显示，在50μmol/L的CuSO4处理下，酒石酸分泌逐渐增多并在12h达到峰值3.272E+03 mg/kg，然后逐步减少，72h之后又明显低于处理前的水平。
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关键字:耐铜性；外源柠檬酸；高效液相色谱；根系分泌物
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2试验方法 2
1.2.1育苗 2
1.2.2外源柠檬酸前处理试验2
1.2.3外源柠檬酸后处理试验2
1.2.4外源柠檬酸同时处理试验2
1.2.5黄花月见草根系分泌物的高效液相色谱分析3
1.3 统计方法3
2 结果与分析 3
2.1 外源柠檬酸前处理对黄花月见草铜胁迫的缓解效应3
2.2 外源柠檬酸后处理对黄花月见草铜胁迫的缓解效应4
2.3 外源柠檬酸同时处理对黄花月见草铜胁迫的缓解效应6
2.4 黄花月见草根系分泌物的高效液相色谱分析7
3 讨论8
3.1外源柠檬酸处理对黄花月见草铜胁迫的缓解效应9
3.2黄花月见草根系分泌物的高效液相色谱分析9
致谢10
参考文献10
黄花月见草根系分泌物缓解铜胁迫的作用机制
引言
引言
我国有丰富的矿产资源，但长期的无节制开采造成了越来越多的土壤受到严重的重金属污染，其中Cu是土壤污染的主要因素之一。Cu是植物生长发育必须的微量元素。一般植物的叶片中Cu的正常含量为3–20 mgkg-1，含量大于30 mgkg-1则可能引起中毒[13]。过量的Cu不仅对植物生长有毒害作用，同时会对人体健康造成极大的危害，因此研究植物如何吸收Cu，并研究Cu在整个植物体内积累和运输的机制，对开发植物修复技术和恢复生态环境具有重要意义 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
。
因此，用合适的方法来对重金属污染土壤进行修复成为当前迫切的需要。而黄花月见草就是目前已知的一种排斥性铜耐性植物，其作用机制与超积累植物不同[8]。人们已经对铜污染进行了大量研究[9]，但是对于铜耐性植物黄花月见草的耐性机制却尚不清楚。如何更好的利用其铜耐性和稳定的修复能力，恢复土壤污染区的植被覆盖，减少水土流失并降低重金属的迁移扩散就成为了一个颇具意义的课题。因此本文针对黄花月见草耐铜性机制以及提高其耐性的方法进行了一系列试验。
有机酸是植物分泌的帮助其自身缓解重金属胁迫的重要方式。其中柠檬酸被认为是一种常见而有效的重金属螯合剂，对水稻、大豆等植物的重金属胁迫都有显著的缓解效果。因此，试验开始首先鉴定外源柠檬酸对黄花月见草的作用效果，随后进一步分析根系分泌物，验证黄花月见草的铜排斥机理，为阐明其耐性机制提供依据。
1 材料与方法
1．1 试验材料
黄花月见草种子（Oenothera glazioviana）；铜胁迫用50μmol/L硫酸铜；1000ppm（1g/L）的草酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸标准溶液。
1．2 试验方法
1. 2. 1 育苗
以蛭石为基质，均匀播种经过氧化氢消毒后的黄花月见草种子，灭菌后用去离子水保湿。两周后移苗，用Hoagland营养液水培，根据黄花月见草的生长状况从四分之一到二分之一过渡到全培养液。每三天换一次培养液，恒温25℃下温室培养，三到四周后待黄花月见草长到足够大小即可进行试验处理。
Hoagland营养液配方：
母液浓度 每升
Ca(NO3)2 1mol/L 5mL
KNO3 1mol/L 5mL
MgSO4 1mol/L 2mL
KH2PO4 1mol/L 1mL
Fe-EDTA — 1mL
微量元素 — 1mL
1. 2. 2 外源柠檬酸前处理试验
用5μmol/L的柠檬酸处理实验组并调节pH，对照组加等量去离子水。24小时后用50μmol/L的硫酸铜溶液处理实验组和对照组。分别测量0、6、12、24、48和72小时后黄花月见草地上部分和根部的铜含量。测量方法为火焰原子吸收法。即在相应时间段烘干试验材料，称量并消煮。消煮中加入5ml HNO3 + HClO4 (V:V=87:13) 混合酸消煮完全。样品消煮过程中以消煮的混合酸为空白，以消除消煮和分析过程中带来的误差。先冷消煮再热消煮数小时直到消煮管底部仅剩白色细小结晶。回溶储存后用火焰原子吸收分光光度计测量铜含量[16]。
转运系数（TF translocation factors）= 地上部铜含量/根系铜含量[15]。
1. 2. 3 外源柠檬酸后处理试验
即先用50μmol/L的硫酸铜溶液处理实验组和对照组，6小时后用5μmol/L的柠檬酸处理实验组并调节pH，对照组加等量去离子水。分别测量0、12、24、48和72小时后黄花月见草地上部分和根部的铜含量。
1. 2. 4 外源柠檬酸和铜的同时处理试验
即用50μmol/L的硫酸铜溶液和柠檬酸同时处理黄花 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
月见草并调节pH。柠檬酸设立0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L五个浓度梯度。分别测量0、6、12、24、48和72小时后地上部分和根部的铜含量。
1. 2. 5 黄花月见草根系分泌物的高效液相色谱分析
用50μmol/L的硫酸铜溶液处理黄花月见草，测定0、6、12、24、48和72小时后黄花月见草的根系分泌物及含量。先取铜处理后相应时间段的黄花月见草，用去离子水将根彻底冲洗干净，将植物的根系，黑暗培养4oC过夜，放入盛有100ml超纯水（已灭菌）的组培瓶中，25 oC光照培养4h，用去离子水冲洗根系，获得100ml的根系分泌物溶液，根系烘干后准确称取干重[13]。 旋转蒸发仪浓缩收集的根系分泌物溶液，每株样品定容到10ml。将浓缩的样品进行高效液相色谱分析。首先配制50%、5%的甲醇过渡性清洗色谱柱。配制磷酸氢二钠的1%甲醇溶液作为流动相（pH调为2.4），测量前平衡色谱柱。流动相、样品在测量前分别经过了抽滤和注射式微孔滤膜进行过滤。用1000ppm（1g/L）的草酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸作为单标，并用200ppm的五种酸混合作为混酸标样。测定标样的有机酸出峰时间，对照标准样品，分别定性和定量测定0、6、12、24、48和72小时的黄花月见草根系分泌物。
1．3 统计方法
利用Excel 软件统计，用LSD分析方法对数据进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2．1 外源柠檬酸前处理对黄花月见草铜胁迫的缓解效应
图3-3 不同浓度柠檬酸和铜同时处理下黄花月见草的铜转运系数。
2．4 黄花月见草铜胁迫下根系分泌物的高效液相色谱分析
由图4-1可知，五种有机酸保留时间依次是：草酸（4分50秒），酒石酸（5分20秒），苹果酸（6分20秒），柠檬酸（7分30秒），琥珀酸（9分30秒）。由于流动相选择的原因，草酸与酒石酸没有分开，但结合单标可以判断是两个峰型。8分40秒的倒峰判断是系统误差，因为每一个图在相同的时间出现相似倒峰。而其他保留时间的倒峰则有可能是进样时带入气泡产生的操作误差。而苹果酸、柠檬酸、琥珀酸的标样图中不同程度地出现了杂峰，可能是配制标样过程中混入了杂质。
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