拟南芥中atndx参与调控dna去甲基化过程的研究
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式。本实验以拟南芥AtNDX基因的T-DNA插入突变体为材料，研究AtNDX参与调控拟南芥DNA去甲基化过程的机制。利用酶切PCR（Chop-PCR）发现，atndx在多个位点上甲基化水平升高。全基因组甲基化测序表明atndx的甲基化水平明显高于正常水平，且主要表现为CHH甲基化升高。反转录PCR（RT-PCR）结果证明AtNDX的突变没有影响拟南芥中DNA去甲基化酶基因的表达，仅造成AtNDX的自身表达消失。综上所述，AtNDX确实参与了对拟南芥DNA去甲基化过程的调控，AtNDX突变使拟南芥基因组甲基化水平显著升高，并且AtNDX不是通过影响DNA去甲基化酶的表达量而对基因组甲基化水平造成影响的。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法5
1.1材料5
1.2方法5
1.2.1植株培养5
1.2.2引物设计5
1.2.3 CTAB法提取DNA5
1.2.4 TDNA纯合插入突变体的鉴定5
1.2.5 ChopPCR 5
1.2.6 RTPCR6
1.2.7全基因组甲基化测序6
2结果与分析 6
2.1材料的鉴定和筛选 6
2.2 atndx的甲基化情况7
2.2.1 atndx的DNA甲基化分析7
2.2.2全基因组甲基化分析7
2.2.3 atndx中去甲基化相关基因表达分析7
3讨论 9
致谢10
参考文献10
图1 AtNDX突变位点纯合性鉴定7
图2 ChopPCR检测一些位点的DNA甲基化水平8
图3 全基因组甲基化测序8
图4 RTPCR检测DNA去甲基化酶基因和AtNDX的表达量9
拟南芥中AtNDX参与调控DNA去甲基化过程的研究
引言
研究不涉及有关DNA序列改变的基因调控与表达，且能引起遗传表型表现的学科，即为表观 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
遗传学(epigenetics)，DNA甲基化(DNA methylation)是表观遗传修饰重要的调控途径。DNA甲基化的作用方式是通过DNA甲基转移酶于胞嘧啶碱基C的5号碳原子上连接甲基基团，形成5甲基胞嘧啶（5mC）[1]。作为表观遗传的关键途径，DNA甲基化在生物体中具有多种多样的作用，尤其对于动植物正常健康的成长相当关键，动物胚胎死亡的原因之一即为DNA甲基化缺陷，它也会使植物的生长形态出现异常[2]，对于植物而言，DNA甲基化对保持基因组的稳定性和推进植物健康、正常的生长具有关键作用，因此探究DNA甲基化的建立与维持具有重要意义。
DNA甲基化既需要被从头建立，也需要被稳定维持[3]。由于DNA的半保留复制，新合成的链在原有甲基化的位置加上相同的甲基化修饰，以防止伴随细胞分裂次数递增，DNA甲基化水平递减的甲基化方式称为维持甲基化。在维持甲基化中，发现DNA的甲基化水平会逐渐降低，而从头甲基化是指利用DNA甲基化酶使母链上原本没有甲基化现象的某位点所对应的子链上产生甲基化现象[4]。
三种主动DNA甲基化转移酶在哺乳动物体内相继被发现，他们是DNMT1（DNA（cytosine5）methyltransferase 1）、DNMT3A和DNMT3B[5,6,7]。DNMT3属于从头转移酶家族，DNA甲基化由它催化形成，催化方式之一是在它没有催化活性的同源蛋白DNMT3L的协助下完成的[7,8]。维持性甲基转移酶DNMT1发挥着维持CG类型甲基化水平的作用，它以亲代链为模板在子代链上重新建立DNA甲基化修饰[5]。
发生在植物中的保持CG甲基化的方式与其在动物中产生作用的方式相似，即由DNMT1的同源蛋白MET1以及协同蛋白VIM作用完成[9]。是VIM1的SRA结构域使CG甲基化位点能和它结合，使MET1到正在复制的半甲基化序列上[10,11]。植物中DDM1（decrease in DNA methylation 1）与LSH1（lymphoid specific helicase 1）类似，能维持植物基因组水平的甲基化。可见不同的酶在生物体内用各自的方式分别催化着不同类型的甲基化作用。
DNA甲基化是研究得相当详实、并且十分重要的一种表观遗传修饰形式，这一修饰现象存在于各种多样的生物体中，极其广泛，它不仅仅对于基因的表达调控十分重要，甚至在转座子沉默还有异染色质的维持中都起到关键作用。植物内有约2030%的胞嘧啶处于甲基化状态[13]，类型分为CG、CHG和CHH（H=A,T,C）三种。DNA甲基化可以使开花植物中的转座子和一些其它重复序列沉默[14]。在拟南芥中，DNA从头甲基化是借助DRM2完成的，维持的方式并不是唯一的，有三种不同的种途径，DNA甲基转移酶MET1、CMT3和DRM2可以维持三种类型的甲基化，即CG、CHG和CHH甲基化[15]。推测由于利用了碱基切除修复使DNA主动去甲基化的情况受DNA糖基化酶活性的影响[16]。与CG类型甲基化不同的是，一般情况下，CHG和CHH甲基化是siRNA介导的[17]。
DNA甲基化能够在复制的过程中持续下去，尽管它是相对稳定的的一种修饰，但不可否认它仍然存在变化。因此除了DNA甲基化外，还存在着与之过程可逆的DNA去甲基化，分为被动去甲基化和主动去甲基化[18]。在复制相对应的酶或甲基供体无法有效在产生的DNA单链上发挥作用致使细胞核整体DNA甲基化水平降低，这一现象称为被动去甲基化。而借助DNA去甲基化酶的帮助，通过与去甲基化作用相关的因子将胞嘧啶去掉一个甲基的过程，称为主动去甲基化。
植物中的TEs一般由表观遗传学的沉默机制调控，例如DNA甲基化还有组蛋白修饰。DNA甲基化与多种多样的过程有关，包括维持基因组的稳定性、参与细胞对环境刺激的反应和器官的发育。DNA甲基化和去甲基化作为彼此可逆的过程使DNA甲基化在水平以及模式上都处于动态变化中，并使基因组得以维持一定水平的可塑性，让植物可以更好地适应生存环境的变化。DNA甲基化可以通过被动或主动的途径、或两者的组合而发生。与被动的DNA去甲基化比较，特定的酶促反应对于活性DNA去甲基化是不可或缺的。拟南芥中的主动去甲基化是通过一系列双功能的DNA糖基化酶/酶执行的，包括ROS1、DME、二甲醚2（DML2）和DML3。ROS1的功能缺失突变可引起DNA的超甲基化，并增强转基因和内源基因以及TEs的转录后基因沉默（TGS）。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法5
1.1材料5
1.2方法5
1.2.1植株培养5
1.2.2引物设计5
1.2.3 CTAB法提取DNA5
1.2.4 TDNA纯合插入突变体的鉴定5
1.2.5 ChopPCR 5
1.2.6 RTPCR6
1.2.7全基因组甲基化测序6
2结果与分析 6
2.1材料的鉴定和筛选 6
2.2 atndx的甲基化情况7
2.2.1 atndx的DNA甲基化分析7
2.2.2全基因组甲基化分析7
2.2.3 atndx中去甲基化相关基因表达分析7
3讨论 9
致谢10
参考文献10
图1 AtNDX突变位点纯合性鉴定7
图2 ChopPCR检测一些位点的DNA甲基化水平8
图3 全基因组甲基化测序8
图4 RTPCR检测DNA去甲基化酶基因和AtNDX的表达量9
拟南芥中AtNDX参与调控DNA去甲基化过程的研究
引言
研究不涉及有关DNA序列改变的基因调控与表达，且能引起遗传表型表现的学科，即为表观 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
遗传学(epigenetics)，DNA甲基化(DNA methylation)是表观遗传修饰重要的调控途径。DNA甲基化的作用方式是通过DNA甲基转移酶于胞嘧啶碱基C的5号碳原子上连接甲基基团，形成5甲基胞嘧啶（5mC）[1]。作为表观遗传的关键途径，DNA甲基化在生物体中具有多种多样的作用，尤其对于动植物正常健康的成长相当关键，动物胚胎死亡的原因之一即为DNA甲基化缺陷，它也会使植物的生长形态出现异常[2]，对于植物而言，DNA甲基化对保持基因组的稳定性和推进植物健康、正常的生长具有关键作用，因此探究DNA甲基化的建立与维持具有重要意义。
DNA甲基化既需要被从头建立，也需要被稳定维持[3]。由于DNA的半保留复制，新合成的链在原有甲基化的位置加上相同的甲基化修饰，以防止伴随细胞分裂次数递增，DNA甲基化水平递减的甲基化方式称为维持甲基化。在维持甲基化中，发现DNA的甲基化水平会逐渐降低，而从头甲基化是指利用DNA甲基化酶使母链上原本没有甲基化现象的某位点所对应的子链上产生甲基化现象[4]。
三种主动DNA甲基化转移酶在哺乳动物体内相继被发现，他们是DNMT1（DNA（cytosine5）methyltransferase 1）、DNMT3A和DNMT3B[5,6,7]。DNMT3属于从头转移酶家族，DNA甲基化由它催化形成，催化方式之一是在它没有催化活性的同源蛋白DNMT3L的协助下完成的[7,8]。维持性甲基转移酶DNMT1发挥着维持CG类型甲基化水平的作用，它以亲代链为模板在子代链上重新建立DNA甲基化修饰[5]。
发生在植物中的保持CG甲基化的方式与其在动物中产生作用的方式相似，即由DNMT1的同源蛋白MET1以及协同蛋白VIM作用完成[9]。是VIM1的SRA结构域使CG甲基化位点能和它结合，使MET1到正在复制的半甲基化序列上[10,11]。植物中DDM1（decrease in DNA methylation 1）与LSH1（lymphoid specific helicase 1）类似，能维持植物基因组水平的甲基化。可见不同的酶在生物体内用各自的方式分别催化着不同类型的甲基化作用。
DNA甲基化是研究得相当详实、并且十分重要的一种表观遗传修饰形式，这一修饰现象存在于各种多样的生物体中，极其广泛，它不仅仅对于基因的表达调控十分重要，甚至在转座子沉默还有异染色质的维持中都起到关键作用。植物内有约2030%的胞嘧啶处于甲基化状态[13]，类型分为CG、CHG和CHH（H=A,T,C）三种。DNA甲基化可以使开花植物中的转座子和一些其它重复序列沉默[14]。在拟南芥中，DNA从头甲基化是借助DRM2完成的，维持的方式并不是唯一的，有三种不同的种途径，DNA甲基转移酶MET1、CMT3和DRM2可以维持三种类型的甲基化，即CG、CHG和CHH甲基化[15]。推测由于利用了碱基切除修复使DNA主动去甲基化的情况受DNA糖基化酶活性的影响[16]。与CG类型甲基化不同的是，一般情况下，CHG和CHH甲基化是siRNA介导的[17]。
DNA甲基化能够在复制的过程中持续下去，尽管它是相对稳定的的一种修饰，但不可否认它仍然存在变化。因此除了DNA甲基化外，还存在着与之过程可逆的DNA去甲基化，分为被动去甲基化和主动去甲基化[18]。在复制相对应的酶或甲基供体无法有效在产生的DNA单链上发挥作用致使细胞核整体DNA甲基化水平降低，这一现象称为被动去甲基化。而借助DNA去甲基化酶的帮助，通过与去甲基化作用相关的因子将胞嘧啶去掉一个甲基的过程，称为主动去甲基化。
植物中的TEs一般由表观遗传学的沉默机制调控，例如DNA甲基化还有组蛋白修饰。DNA甲基化与多种多样的过程有关，包括维持基因组的稳定性、参与细胞对环境刺激的反应和器官的发育。DNA甲基化和去甲基化作为彼此可逆的过程使DNA甲基化在水平以及模式上都处于动态变化中，并使基因组得以维持一定水平的可塑性，让植物可以更好地适应生存环境的变化。DNA甲基化可以通过被动或主动的途径、或两者的组合而发生。与被动的DNA去甲基化比较，特定的酶促反应对于活性DNA去甲基化是不可或缺的。拟南芥中的主动去甲基化是通过一系列双功能的DNA糖基化酶/酶执行的，包括ROS1、DME、二甲醚2（DML2）和DML3。ROS1的功能缺失突变可引起DNA的超甲基化，并增强转基因和内源基因以及TEs的转录后基因沉默（TGS）。
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