拟南芥cat3基因克隆与基因定位
至今为止，在所有的有氧生物细胞中都有发现过氧化氢酶（CAT）的存在，过氧化氢酶具有高效清除过氧化氢，平衡细胞内过氧化氢量的作用[1]。在植物中，多种过氧化氢由多种基因家族编码，其虽然在植物体内主要参与过氧化氢的分解过程，但是每一种过氧化氢同工酶所参与的代谢途径都不尽相同，所以关于过氧化氢酶的探究具备着重要意义。目前为止，科研人员已经从拟南芥中得到了三种过氧化氢酶的基因克隆，尽管对这三个过氧化氢酶基因的具体功能已经进行了大量实验并获得了不少突破，但是还有很多未知的基因功能需要探究。本实验以生态型拟南芥为研究材料，通过Trizol法提取RNA与反转录技术合成cDNA，从而得到过氧化氢酶3（CAT3）模版，再利用酶切酶连与PCR技术得到CAT3的基因克隆，通过基因工程技术形成CAT3-GFP融合蛋白并转入拟南芥原生质体中，通过激光共聚焦技术获得488nm下此融合蛋白的荧光，从而对CAT3进行基因定位，发现CAT3存在于细胞质内和过氧化物酶体中。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法3
1.1材料3
1.2方法3
1.2.1拟南芥RNA提取3
1.2.2引物设计 4
1.2.3 cDNA合成 4
1.2.4 PCR扩增 4
1.2.5琼脂糖凝胶电泳与核酸定量 4
1.2.6 DNA限制性内切酶消化 5
1.2.7酶切产物链接 5
1.2.8大肠杆菌感受态细胞制备 5
1.2.9热击法转化大肠杆菌感受态细胞与测序 6
1.2.10碱裂解法提取质粒 6
1.2.11目的基因与载体连接 7
1.2.12拟南芥原生质体制备 7
1.2.13质粒转化拟南芥原生质体 8
1.2.3实验溶液8
2结果9
2.1引物设计9
2.2 PCR扩增基因9
2.3拟南芥原生质体的制备11
2.4 GFP瞬时表达载体的激光共聚焦图11
3讨论11< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
br /> 4结论12
致谢13
参考文献14
拟南芥CAT3基因克隆与基因定位
引言
引言
过氧化氢酶（CAT）是一类普遍存在于各类有氧生物细胞中的酶，其主要作用是降解过氧化氢。1811年，作为过氧化氢酶的发现者——泰纳尔，首次发现了过氧化氢酶。1900年，这一类可以降解过氧化氢的酶被奥斯卡洛夫命名为“过氧化氢酶（catalase）”，并且发现这种酶在大部分生物中都存在[2]。1981年，在计算机大发展的时代下，牛过氧化氢酶的三维构造得以解析[3]。
过氧化氢酶是一个同源四聚体，在每一个亚基上都存在着一个活性位点——血红素基团，进行催化反应[4]。
在生命科学研究的早期阶段，科学家主要根据物质发现的来源差异进行分类，所以当时将过氧化氢酶分为真核过氧化氢酶和原核过氧化氢酶，其中在动植物组织中主要提取的是真核过氧化氢酶，而在微生物中主要提取的是原核过氧化氢酶。随着蛋白质测序水平的提高和蛋白质结晶技术的出现，科研人员对过氧化氢酶的结构和功能机理有了更深一步的认识，于是按照结构和序列水平的异同将过氧化氢酶分为 [5]——单功能过氧化氢酶，双功能过氧化氢酶和锰过氧化氢酶。之后，科研人员发现有些过氧化氢酶的活性位点中的金属元素存在差异，于是依据过氧化氢酶活性位点的不同，将过氧化氢酶又分为两类：血红素过氧化氢酶，和锰过氧化氢酶[6]。
单功能过氧化氢酶是三种过氧化氢酶中是种类最多，分布最广，活性最高的[7]。尽管在来源上单功能过氧化氢酶存在差异，但是它们都具备一个高度类似的结构——由4个具有相同多肽链的亚基形成的四聚体，而且在每个亚基上都有作为活性位点的一个血红素基团。单功能过氧化氢酶空间构象高度保守，单个亚基主要有4个结构域。从N端至C端依次是：N端，反平行β桶，卷缠环区，C端 [8] 。
双功能过氧化氢酶又称为过氧化氢酶过氧化物酶，顾名思义，此酶具有分解过氧化氢或分解过氧化物的功能，但是其分解功能比单功能过氧化氢酶的弱。双功能过氧化氢酶至今只在微生物和海藻中发现，在动植物组织中没有发现过此类酶。
锰过氧化氢酶是一种以锰离子代替了铁卟啉环构造的过氧化氢酶，此类酶发现的比较少，主要是在一些嗜热微生物中发现，所以可能是一些嗜极微生物在进化过程中，利用锰离子代替铁卟啉结构来对极端外环境进行防御、保护自己。张闻等对锰过氧化氢酶进行了研究[9]，该研究中提到了使用电子光谱于电子自旋共振（ESR）谱技术最先证明了在锰过氧化氢酶中有2个紧邻的锰离子，而且存在混合价态Mn2（II，III）和Mn2（III，IV）[10]。
目前，在拟南芥中已经发现过氧化氢酶的一个基因家族——CAT1，CAT2，CAT3[11]。这三种基因可以形成六种以上的酶。多个研究发现，CAT1不受光周期的调节，而CAT2，CAT3则与之相反，受光周期调节[12]。在当前的植物激素的研究下，水杨酸作为植物体内广泛存在的一种信号分子，是一个已经被广泛采纳的观点，而且水杨酸的主要作用之一是参与植物关于病毒侵染的防御反馈。由大量的研究数据表明，水杨酸通过与过氧化氢酶上相应的靶点结合的方式，从而抑制过氧化氢酶讲解过氧化氢的的能力，使得细胞内的过氧化氢大量产生，由于过多的过氧化氢打破了原来由过氧化氢酶所维持的平衡，导致细胞内产生大量活性氧自由基。作为第二信使的过氧化氢与活性氧自由基，激活了植物对于外来胁迫的应答机制，从而增强了植物的抗逆性。
基因克隆技术是基因工程的上游，其主要目标是获得目的基因及其克隆[13]，普遍认为基因克隆能偶抽象的概括为：分、切、连、转、选，这五个步骤。其中“分”是指，通过获取目的生物基因组中的目的DNA或者是通过获得目的生物中的RNA再利用反转录技术合成其相应的cDNA，之后根据目的基因的特征选取相应的载体；“切”是指使用DNA限制性内切酶消化DNA分子形成粘性末端；“连”是指将经过DNA限制性内切酶切割所获的基因片段与所选择的载体在DNA连接酶的作用下完成体外重组；“转”是指将所形成的载体DNA分子转入受体细胞中，进行复制；“选”是指通过抗性等方式，筛选成功转化载体DNA分子的受体细胞。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法3
1.1材料3
1.2方法3
1.2.1拟南芥RNA提取3
1.2.2引物设计 4
1.2.3 cDNA合成 4
1.2.4 PCR扩增 4
1.2.5琼脂糖凝胶电泳与核酸定量 4
1.2.6 DNA限制性内切酶消化 5
1.2.7酶切产物链接 5
1.2.8大肠杆菌感受态细胞制备 5
1.2.9热击法转化大肠杆菌感受态细胞与测序 6
1.2.10碱裂解法提取质粒 6
1.2.11目的基因与载体连接 7
1.2.12拟南芥原生质体制备 7
1.2.13质粒转化拟南芥原生质体 8
1.2.3实验溶液8
2结果9
2.1引物设计9
2.2 PCR扩增基因9
2.3拟南芥原生质体的制备11
2.4 GFP瞬时表达载体的激光共聚焦图11
3讨论11< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
br /> 4结论12
致谢13
参考文献14
拟南芥CAT3基因克隆与基因定位
引言
引言
过氧化氢酶（CAT）是一类普遍存在于各类有氧生物细胞中的酶，其主要作用是降解过氧化氢。1811年，作为过氧化氢酶的发现者——泰纳尔，首次发现了过氧化氢酶。1900年，这一类可以降解过氧化氢的酶被奥斯卡洛夫命名为“过氧化氢酶（catalase）”，并且发现这种酶在大部分生物中都存在[2]。1981年，在计算机大发展的时代下，牛过氧化氢酶的三维构造得以解析[3]。
过氧化氢酶是一个同源四聚体，在每一个亚基上都存在着一个活性位点——血红素基团，进行催化反应[4]。
在生命科学研究的早期阶段，科学家主要根据物质发现的来源差异进行分类，所以当时将过氧化氢酶分为真核过氧化氢酶和原核过氧化氢酶，其中在动植物组织中主要提取的是真核过氧化氢酶，而在微生物中主要提取的是原核过氧化氢酶。随着蛋白质测序水平的提高和蛋白质结晶技术的出现，科研人员对过氧化氢酶的结构和功能机理有了更深一步的认识，于是按照结构和序列水平的异同将过氧化氢酶分为 [5]——单功能过氧化氢酶，双功能过氧化氢酶和锰过氧化氢酶。之后，科研人员发现有些过氧化氢酶的活性位点中的金属元素存在差异，于是依据过氧化氢酶活性位点的不同，将过氧化氢酶又分为两类：血红素过氧化氢酶，和锰过氧化氢酶[6]。
单功能过氧化氢酶是三种过氧化氢酶中是种类最多，分布最广，活性最高的[7]。尽管在来源上单功能过氧化氢酶存在差异，但是它们都具备一个高度类似的结构——由4个具有相同多肽链的亚基形成的四聚体，而且在每个亚基上都有作为活性位点的一个血红素基团。单功能过氧化氢酶空间构象高度保守，单个亚基主要有4个结构域。从N端至C端依次是：N端，反平行β桶，卷缠环区，C端 [8] 。
双功能过氧化氢酶又称为过氧化氢酶过氧化物酶，顾名思义，此酶具有分解过氧化氢或分解过氧化物的功能，但是其分解功能比单功能过氧化氢酶的弱。双功能过氧化氢酶至今只在微生物和海藻中发现，在动植物组织中没有发现过此类酶。
锰过氧化氢酶是一种以锰离子代替了铁卟啉环构造的过氧化氢酶，此类酶发现的比较少，主要是在一些嗜热微生物中发现，所以可能是一些嗜极微生物在进化过程中，利用锰离子代替铁卟啉结构来对极端外环境进行防御、保护自己。张闻等对锰过氧化氢酶进行了研究[9]，该研究中提到了使用电子光谱于电子自旋共振（ESR）谱技术最先证明了在锰过氧化氢酶中有2个紧邻的锰离子，而且存在混合价态Mn2（II，III）和Mn2（III，IV）[10]。
目前，在拟南芥中已经发现过氧化氢酶的一个基因家族——CAT1，CAT2，CAT3[11]。这三种基因可以形成六种以上的酶。多个研究发现，CAT1不受光周期的调节，而CAT2，CAT3则与之相反，受光周期调节[12]。在当前的植物激素的研究下，水杨酸作为植物体内广泛存在的一种信号分子，是一个已经被广泛采纳的观点，而且水杨酸的主要作用之一是参与植物关于病毒侵染的防御反馈。由大量的研究数据表明，水杨酸通过与过氧化氢酶上相应的靶点结合的方式，从而抑制过氧化氢酶讲解过氧化氢的的能力，使得细胞内的过氧化氢大量产生，由于过多的过氧化氢打破了原来由过氧化氢酶所维持的平衡，导致细胞内产生大量活性氧自由基。作为第二信使的过氧化氢与活性氧自由基，激活了植物对于外来胁迫的应答机制，从而增强了植物的抗逆性。
基因克隆技术是基因工程的上游，其主要目标是获得目的基因及其克隆[13]，普遍认为基因克隆能偶抽象的概括为：分、切、连、转、选，这五个步骤。其中“分”是指，通过获取目的生物基因组中的目的DNA或者是通过获得目的生物中的RNA再利用反转录技术合成其相应的cDNA，之后根据目的基因的特征选取相应的载体；“切”是指使用DNA限制性内切酶消化DNA分子形成粘性末端；“连”是指将经过DNA限制性内切酶切割所获的基因片段与所选择的载体在DNA连接酶的作用下完成体外重组；“转”是指将所形成的载体DNA分子转入受体细胞中，进行复制；“选”是指通过抗性等方式，筛选成功转化载体DNA分子的受体细胞。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/smkx/83.html
