沙雷氏菌fs14中n乙酰基转移酶基因l08522690的克隆与表达沙雷氏菌fs14中n乙酰基转移酶基因l08522690的克隆与表达【字数：8170】
N-乙酰基转移酶（N-acetyltransferase，NAT）是一个二相代谢酶，能催化乙酰基团从乙酰CoA 转移到其作用底物芳香胺及杂环胺类等物质上。NAT参与调节细菌毒力和耐药性，在人体中与药物代谢和癌症易感性等密切相关。本试验选取粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）FS14中的一个N-乙酰基转移酶基因，通过PCR扩增其基因片段后，经过限制性酶切后将其克隆到pMTK载体，构建了表达质粒，将构建正确的表达质粒转化至S. marcescens FS14中。用IPTG对目的蛋白进行诱导表达，发现目的蛋白没有被表达。之后将该基因克隆到表达载体pCold重新构建表达质粒，将新构建的表达质粒转化入沙雷氏菌FS14中。用IPTG对目的蛋白进行诱导表达，发现蛋白能够表达，但未能通过亲和柱纯化得到目的蛋白。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 实验材料 3
1.1.1 菌株及质粒 3
1.1.2 培养基及溶液配方 3
1.1.3 核酸及蛋白检测胶 3
1.1.4 酶及其他相应化学试剂 3
1.1.5 主要仪器 3
1.2 实验方法 3
1.2.1 N乙酰基转移酶基因L085_22690原核表达质粒的构建 3
1.2.2 转化表达质粒到S. marcescens FS14中 5
1.2.3 蛋白表达检测 5
1.2.4 蛋白的纯化 6
2 结果与分析 6
2.1 PCR扩增及扩增产物的检测 6
2.2 基于pMTK载体的表达质粒的构建 7
2.3 蛋白表达检测及蛋白的纯化 8
2.4 基于pCold载体的表达质粒的诱导表达 9
2.4.1 基于pCold载体的表达质粒的构建 9
2.4.2 基于pCold载体的表达质粒的蛋白表达检测及蛋白的纯化 10
3 讨论 11
3.1 蛋白表达的影响因素 11
3.1.1 诱 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
导条件 11
3.1.2 表达载体 12
3.1.3 载体宿主菌组合 12
3.2 蛋白纯化 12
致谢 12
参考文献 12
附录 13
沙雷氏菌FS14中N乙酰基转移酶基因L085_22690的克隆与表达
引言
引言
沙雷氏菌（Serratia sp.）又称灵杆菌，属于革兰氏阴性细菌。是一种能产生非水溶性色素的兼性厌氧菌。一般存在于土壤、水、植物，动物以及人类的肠道和呼吸道中[1]。粘质沙雷氏菌能分泌灵菌红素。灵菌红素具有多种生物学活性，例如抗癌，抗霉菌，免疫抑制等[2]。
本课题研究的N乙酰基转移酶（L085 _22690）属于N乙酰基转移酶家族蛋白。N乙酰基转移酶（Nacetyltransferase，NAT）是一个二相代谢酶，能够催化乙酰基团从乙酰CoA转移到其作用底物芳香胺及杂环胺类或蛋白类底物等[3]。
细菌中N乙酰转移酶能以调控双组分系统的方式来影响细菌的毒力。双组分系统（TwoComponent System，TCS）是细菌最重要的信息传递系统，它能感受细菌内外部的刺激并将其转变成化学信号并传递至胞内，使细菌能及时调整自身状态以适应恶劣的生存环境[4]。PhoPPhoQ是一个普遍存在于细菌中的双组分系统，这一双组分系统的活性受N乙酰基转移酶乙酰化的调控，进而影响着某些细菌的毒力作用。以沙门氏菌为例，PhoPPhoQ可以调节沙门氏菌对Mg2+及其他周质环境的适应性，进而调控毒力基因的转录和表达，在沙门氏菌毒力调控中发挥重要作用[5]。PhoP和PhoQ是许多基因表达所必需的蛋白，具有PhoP/PhoQ突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株易于抵抗先天免疫杀伤。沙门氏菌PhoP/PhoQ通过感知宿主环境以促进细菌包膜的重塑，这种重塑包括修饰脂多糖（Lipopolysacchride，LPS）的酶。修饰的LPS通过增加对阳离子型抗微生物肽的抗性和改变宿主的LPS识别来促进细菌存活[6]。
N乙酰基转移酶的活性也与细菌的耐药性有关。对细菌体内N乙酰基转移酶的研究，可以帮助人们了解细菌对抗生素产生耐药性的机理，最终帮助解决细菌的耐药性。氨基糖苷类抗生素是最早被鉴定为抗菌药物的天然产物之一，是一种亲水分子，由一个中心的氨基环和一个或多个氨基糖连接而成，是治疗革兰氏阴性需氧细菌引起的严重感染的最重要的化合物之一，可与30S核糖体亚基的受体位点（A位点）结合，破坏密码子反密码子解码机制，抑制蛋白质合成[7,8]。目前，氨基糖苷类抗生素的耐药性越来越受到临床关注，氨基糖苷类药物的绝大多数耐药性是由共价修饰药物酶的表达引起的[9]。细菌可以产生包括N乙酰基转移酶在内的多种修饰酶。这些修饰酶能共价修饰氨基糖苷类抗生素的特定的氨基或者羟基基团，干扰抗生素与核糖体的结合，使细菌对抗生素产生耐药性[10]。此外，沙门氏菌通过赖氨酸乙酰化的修饰调节，产生对于环丙沙星类药物的耐药性，其耐药性产生与赖氨酸乙酰化的修饰频率间的正比关系得到充分证明[11]。
在人体中，芳香胺及杂环胺类物质通过人体的代谢转化后会产生包括致癌作用在内的多种毒性，NAT催化完成的乙酰化作用是该类物质代谢转化的重要步骤之一[12]。NAT还在多种药物的代谢途径中起到重要作用。目前的主流观点是大部分药物代谢与NAT1和NAT2这对同工酶的多态性有关[13]。在药物方面：异烟肼、磺胺二甲嘧啶、氨苯砜、2氨基芴和4氨基联苯等主要被NAT2乙酰化，而对氨基水杨酸、对氨基苯甲酸和磺胺、叶酸等则被NAT1乙酰化[14]。
目前，在细菌中除了对抗生素抗性有关的乙酰基转移酶研究较清楚外，其他乙酰基转移酶的研究很少，大部分乙酰基转移酶的功能都不清楚。而对于沙雷氏菌的乙酰基转移酶功能的研究更为缺乏，本文我们选取粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）FS14中L085_22690这个编码N乙酰基转移酶的基因进行克隆表达并对其表达的蛋白进行纯化，为进一步研究乙酰基转移酶在沙雷氏菌中的功能打下了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 实验材料 3
1.1.1 菌株及质粒 3
1.1.2 培养基及溶液配方 3
1.1.3 核酸及蛋白检测胶 3
1.1.4 酶及其他相应化学试剂 3
1.1.5 主要仪器 3
1.2 实验方法 3
1.2.1 N乙酰基转移酶基因L085_22690原核表达质粒的构建 3
1.2.2 转化表达质粒到S. marcescens FS14中 5
1.2.3 蛋白表达检测 5
1.2.4 蛋白的纯化 6
2 结果与分析 6
2.1 PCR扩增及扩增产物的检测 6
2.2 基于pMTK载体的表达质粒的构建 7
2.3 蛋白表达检测及蛋白的纯化 8
2.4 基于pCold载体的表达质粒的诱导表达 9
2.4.1 基于pCold载体的表达质粒的构建 9
2.4.2 基于pCold载体的表达质粒的蛋白表达检测及蛋白的纯化 10
3 讨论 11
3.1 蛋白表达的影响因素 11
3.1.1 诱 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
导条件 11
3.1.2 表达载体 12
3.1.3 载体宿主菌组合 12
3.2 蛋白纯化 12
致谢 12
参考文献 12
附录 13
沙雷氏菌FS14中N乙酰基转移酶基因L085_22690的克隆与表达
引言
引言
沙雷氏菌（Serratia sp.）又称灵杆菌，属于革兰氏阴性细菌。是一种能产生非水溶性色素的兼性厌氧菌。一般存在于土壤、水、植物，动物以及人类的肠道和呼吸道中[1]。粘质沙雷氏菌能分泌灵菌红素。灵菌红素具有多种生物学活性，例如抗癌，抗霉菌，免疫抑制等[2]。
本课题研究的N乙酰基转移酶（L085 _22690）属于N乙酰基转移酶家族蛋白。N乙酰基转移酶（Nacetyltransferase，NAT）是一个二相代谢酶，能够催化乙酰基团从乙酰CoA转移到其作用底物芳香胺及杂环胺类或蛋白类底物等[3]。
细菌中N乙酰转移酶能以调控双组分系统的方式来影响细菌的毒力。双组分系统（TwoComponent System，TCS）是细菌最重要的信息传递系统，它能感受细菌内外部的刺激并将其转变成化学信号并传递至胞内，使细菌能及时调整自身状态以适应恶劣的生存环境[4]。PhoPPhoQ是一个普遍存在于细菌中的双组分系统，这一双组分系统的活性受N乙酰基转移酶乙酰化的调控，进而影响着某些细菌的毒力作用。以沙门氏菌为例，PhoPPhoQ可以调节沙门氏菌对Mg2+及其他周质环境的适应性，进而调控毒力基因的转录和表达，在沙门氏菌毒力调控中发挥重要作用[5]。PhoP和PhoQ是许多基因表达所必需的蛋白，具有PhoP/PhoQ突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株易于抵抗先天免疫杀伤。沙门氏菌PhoP/PhoQ通过感知宿主环境以促进细菌包膜的重塑，这种重塑包括修饰脂多糖（Lipopolysacchride，LPS）的酶。修饰的LPS通过增加对阳离子型抗微生物肽的抗性和改变宿主的LPS识别来促进细菌存活[6]。
N乙酰基转移酶的活性也与细菌的耐药性有关。对细菌体内N乙酰基转移酶的研究，可以帮助人们了解细菌对抗生素产生耐药性的机理，最终帮助解决细菌的耐药性。氨基糖苷类抗生素是最早被鉴定为抗菌药物的天然产物之一，是一种亲水分子，由一个中心的氨基环和一个或多个氨基糖连接而成，是治疗革兰氏阴性需氧细菌引起的严重感染的最重要的化合物之一，可与30S核糖体亚基的受体位点（A位点）结合，破坏密码子反密码子解码机制，抑制蛋白质合成[7,8]。目前，氨基糖苷类抗生素的耐药性越来越受到临床关注，氨基糖苷类药物的绝大多数耐药性是由共价修饰药物酶的表达引起的[9]。细菌可以产生包括N乙酰基转移酶在内的多种修饰酶。这些修饰酶能共价修饰氨基糖苷类抗生素的特定的氨基或者羟基基团，干扰抗生素与核糖体的结合，使细菌对抗生素产生耐药性[10]。此外，沙门氏菌通过赖氨酸乙酰化的修饰调节，产生对于环丙沙星类药物的耐药性，其耐药性产生与赖氨酸乙酰化的修饰频率间的正比关系得到充分证明[11]。
在人体中，芳香胺及杂环胺类物质通过人体的代谢转化后会产生包括致癌作用在内的多种毒性，NAT催化完成的乙酰化作用是该类物质代谢转化的重要步骤之一[12]。NAT还在多种药物的代谢途径中起到重要作用。目前的主流观点是大部分药物代谢与NAT1和NAT2这对同工酶的多态性有关[13]。在药物方面：异烟肼、磺胺二甲嘧啶、氨苯砜、2氨基芴和4氨基联苯等主要被NAT2乙酰化，而对氨基水杨酸、对氨基苯甲酸和磺胺、叶酸等则被NAT1乙酰化[14]。
目前，在细菌中除了对抗生素抗性有关的乙酰基转移酶研究较清楚外，其他乙酰基转移酶的研究很少，大部分乙酰基转移酶的功能都不清楚。而对于沙雷氏菌的乙酰基转移酶功能的研究更为缺乏，本文我们选取粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）FS14中L085_22690这个编码N乙酰基转移酶的基因进行克隆表达并对其表达的蛋白进行纯化，为进一步研究乙酰基转移酶在沙雷氏菌中的功能打下了基础。
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