蔗糖对葡萄中基因nced启动子的诱导活性的研究
： 1：果实成熟调控机制的研究一直是果树学科的一个重点问题。前人研究证明脱落酸ABA（abscisic acid）是调控非呼吸跃变型果实葡萄成熟的核心组分，蔗糖也作为一个信号组分参与植物生长发育。本课题拟以藤稔葡萄为试材，通过克隆ABA合成关键酶基因NCED的启动子，利用烟草转基因体系对启动子活性进行分析，从而观察蔗糖对启动子活性的诱导作用，为下一步分离与ABA和蔗糖信号相关的转录因子提供试验基础。该研究将对揭示果实发育信息传递的分子机制，进而对今后葡萄的分子改良奠定重要的基础。
目录
引言
1 引言
葡萄是世界上栽培历史悠久，经济价值很高的果树，在果树中栽培面积居世界第一，葡萄品质的提高一直是葡萄生产和科学研究的重点。在我国南方，葡萄果实发育和成熟期间高温多雨，光照相对不足，昼夜温差较小，时常出现果实着色不良的现象，严重影响了葡萄的品质。葡萄产业对于我国农村经济发展以及丰富水果市场具有很重要的地位。因此开展对葡萄果实发育成熟的分子机理研究，具有很高的必要性。
1.1非呼吸跃变型果实的成熟
果实发育和成熟调控机理研究一直是果树学科的一个重点和热点问题。多年来，有关果实发育和成熟调控机理的研究大部分都集中在果实发育过程中某些生理生化代谢过程。这些研究奠定了果实发育和成熟调控的基本理论基础。根据果实成熟的生理过程，果实可以分为呼吸跃变型果实（如苹果、番茄、香蕉等）和非呼吸跃变型果实（如葡萄、草莓、柑橘等）[1]。以乙烯受体及其信号转导分子机制为基础，呼吸跃变型果实成熟调控的分子机理已经阐述清楚[2]。然而，关于非呼吸跃变型果实成熟的分子机制研究过去十几年一直进展缓慢。
近年来，基因方面的证据表明ABA与非呼吸跃变型果实的成熟有关。在ABA的合成路径中，生化和遗传证据都表明9顺环氧类胡萝卜素双加氧酶NCED（9cisepoxycarotenoid dioxygenase ）是ABA合成的关键酶之一[3]。在樱桃果实成熟过程中，ABA参与了果实的生长发育与成熟，甜樱桃的ABA合成关键酶基因PacNCED1的表达趋势与ABA积累一致，而ABA分解代谢关键酶基因8羟化酶基因PacCYP707（8hydroxylase）的表达与ABA积累趋势相反[4]。同样在葡萄、桃中ABA积累及其合成
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键酶基因NCED的表达量变化也有类似的结果[4,5]。更为重要的是，ABA不仅可以调控果实发育、成熟和衰老的进程，而且还可以调控糖、酸和色素等物质的代谢和累积，是整个果实发育、成熟信号网络的核心组分[6]。
葡萄果实发育可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个时期，第Ⅰ期果实很硬，生长速度较快，果实中有机酸含量高，第Ⅱ期生长速度减缓，果实变软，含量量迅速下降，含糖量快速增加，第Ⅲ期果实又开始迅速膨大，着色，果实香味物质开始积累。根据在番茄果实的研究结果推论，葡萄果实发育早期内源ABA含量的升高可能与果实早期生长旺盛有关，因为ABA可以促进韧皮部同化物的卸出和果实对同化物的吸收[7]。关于第Ⅱ期末始熟期或第Ⅲ期初果实中ABA的积累，已经有大量证据证明与果实成熟启动有关[5,8]。我们前期的研究也表明始熟期果肉中ABA浓度是整个生长发育阶段中较低的。我们认为，始熟期低浓度ABA启动成熟的关键在于ABA结合蛋白与ABA 亲和力的升高进而启动信号组分中其它成熟相关因子的表达。这也解释了在此之前一定时间即使组织中高浓度的ABA也不能及时启动成熟的事实。在不同发育期葡萄果实中的ABA结合位点一方面可能是同一种(组)蛋白质，由于其与ABA结合后的信号转导和传递方式或途径不同[9,10]，导致在不同时期所介导的功能发生变化，比如在第Ⅰ期与果实的早期生长有关，而在始熟期则启动了果实成熟；然而另一方面，这种结合位点也可能是几种（组）不同的蛋白质，从而介导了不同的生理功能。这些都有待于进一步研究。
1.2 ABA和蔗糖可协同调控果实的发育
果实发育和成熟是一个非常复杂的过程，其中涉及到一系列生理、生化过程的调控。其中色泽、香味、硬度和糖代谢变化既是果实成熟的标志性事件也是果实品质构成的核心因素。糖是果实风味物质、色素、氨基酸、维生素、芳香物质和其它的营养成分合成的原材料，是判断果实品质的重要指标。有研究表明，糖还是一个信号分子，可以通过复杂的糖信号转导机制调节植物中许多与生长发育相关的基因的表达[11]。糖可以作为一个信号组分参与植物的生长发育，糖与乙烯、ABA、细胞分裂素和光之间的关系已有研究[12]，而且糖信号转导与一些激素信号路径间的关系已经在拟南芥中得到证实，比如糖的不敏感突变体对ABA或者乙烯会有应答[12]。蔗糖和ABA可以共同调节一些基因的表达，如蔗糖能调控番茄叶片和果实中ADP葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）亚基基因ApL3的表达水平，而ABA对ApL3的表达并无促进作用，但是当蔗糖与ABA同时存在时，能显著的诱导ApL3基因的表达[13]。这表明蔗糖与ABA信号转导系统可能联系在一起协同调控植物生长发育中功能基因的表达。我们前期的工作表明葡萄果实中三种可溶性糖蔗糖、葡萄糖和果糖含量都是随着果实发育增加，而蔗糖含量相对较低，但蔗糖对ABA含量的影响最明显，其具体的机理还有待研究。
1.3启动子的克隆及功能研究
植物能根据外界环境变化调控特定基因的表达，以适应复杂多变的生长环境。真核生物的基因表达调控包括转录前调控、转录调控、转录后调控、翻译调控和翻译后调控。其中，转录水平的调控受顺式作用元件和转录因子协调作用，是表达调控的关键环节。植物基因启动子中包含多种重要的顺式作用元件，在转录水平上参与调控下游相应基因表达，从而使植物能够抵御外界环境胁迫[14]。因此，对植物启动子的研究有助于了解基因转录调控表达模式及其调控机制，并应用于基因工程中提高或改进外源目的基因的表达[1517]。
基因组文库筛选启动子是使用较早的一种克隆启动子的方法。首先构建适当丰度的基因组文库，然后用与待克隆启动子相关的已知序列片段或特异基因片段做探针与构建好的基因组文库杂交，筛选出含有目的启动子的克隆，测序及活性分析即可确定启动子序列[18,19]。
然后首先利用生物信息学分析与预测启动子元件类型。利用生物信息学对获得的启动子序列进行初步预测和分析，有助于了解启动子序列可能包含的调控元件，为进一步确定其功能奠定基础。其次利用实验方法对其预测功能进行分析，用生物信息学初步预测和分析启动子序列后，进一步通过具体实验确定启动子上的顺式元件及其功能，通常是将启动子片段与报告基因融合构建表达载体转化离体培养细胞或植物体， 检测报告基因在转基因个体中的表达情况，具体分析启动子功能，明确顺式元件作用[16]。植物在受到逆境胁迫时，经过一系列的信号传递，最终激发转录因子与下游基因启动子核心序列结合，调控下游基因表达。细胞感知外界胁迫信号、胁迫信号传递给转录因子、转录因子再与启动子上的顺式作用元件特异结合是一个复杂的信号传递过程。对启动子结构、功能和作用机制的深入研究对于了解基因调控模式和信号传递途径，为深入了解植物的抗逆机制、提高作物的抗逆性有重要的意义。
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引言
1 引言
葡萄是世界上栽培历史悠久，经济价值很高的果树，在果树中栽培面积居世界第一，葡萄品质的提高一直是葡萄生产和科学研究的重点。在我国南方，葡萄果实发育和成熟期间高温多雨，光照相对不足，昼夜温差较小，时常出现果实着色不良的现象，严重影响了葡萄的品质。葡萄产业对于我国农村经济发展以及丰富水果市场具有很重要的地位。因此开展对葡萄果实发育成熟的分子机理研究，具有很高的必要性。
1.1非呼吸跃变型果实的成熟
果实发育和成熟调控机理研究一直是果树学科的一个重点和热点问题。多年来，有关果实发育和成熟调控机理的研究大部分都集中在果实发育过程中某些生理生化代谢过程。这些研究奠定了果实发育和成熟调控的基本理论基础。根据果实成熟的生理过程，果实可以分为呼吸跃变型果实（如苹果、番茄、香蕉等）和非呼吸跃变型果实（如葡萄、草莓、柑橘等）[1]。以乙烯受体及其信号转导分子机制为基础，呼吸跃变型果实成熟调控的分子机理已经阐述清楚[2]。然而，关于非呼吸跃变型果实成熟的分子机制研究过去十几年一直进展缓慢。
近年来，基因方面的证据表明ABA与非呼吸跃变型果实的成熟有关。在ABA的合成路径中，生化和遗传证据都表明9顺环氧类胡萝卜素双加氧酶NCED（9cisepoxycarotenoid dioxygenase ）是ABA合成的关键酶之一[3]。在樱桃果实成熟过程中，ABA参与了果实的生长发育与成熟，甜樱桃的ABA合成关键酶基因PacNCED1的表达趋势与ABA积累一致，而ABA分解代谢关键酶基因8羟化酶基因PacCYP707（8hydroxylase）的表达与ABA积累趋势相反[4]。同样在葡萄、桃中ABA积累及其合成
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键酶基因NCED的表达量变化也有类似的结果[4,5]。更为重要的是，ABA不仅可以调控果实发育、成熟和衰老的进程，而且还可以调控糖、酸和色素等物质的代谢和累积，是整个果实发育、成熟信号网络的核心组分[6]。
葡萄果实发育可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个时期，第Ⅰ期果实很硬，生长速度较快，果实中有机酸含量高，第Ⅱ期生长速度减缓，果实变软，含量量迅速下降，含糖量快速增加，第Ⅲ期果实又开始迅速膨大，着色，果实香味物质开始积累。根据在番茄果实的研究结果推论，葡萄果实发育早期内源ABA含量的升高可能与果实早期生长旺盛有关，因为ABA可以促进韧皮部同化物的卸出和果实对同化物的吸收[7]。关于第Ⅱ期末始熟期或第Ⅲ期初果实中ABA的积累，已经有大量证据证明与果实成熟启动有关[5,8]。我们前期的研究也表明始熟期果肉中ABA浓度是整个生长发育阶段中较低的。我们认为，始熟期低浓度ABA启动成熟的关键在于ABA结合蛋白与ABA 亲和力的升高进而启动信号组分中其它成熟相关因子的表达。这也解释了在此之前一定时间即使组织中高浓度的ABA也不能及时启动成熟的事实。在不同发育期葡萄果实中的ABA结合位点一方面可能是同一种(组)蛋白质，由于其与ABA结合后的信号转导和传递方式或途径不同[9,10]，导致在不同时期所介导的功能发生变化，比如在第Ⅰ期与果实的早期生长有关，而在始熟期则启动了果实成熟；然而另一方面，这种结合位点也可能是几种（组）不同的蛋白质，从而介导了不同的生理功能。这些都有待于进一步研究。
1.2 ABA和蔗糖可协同调控果实的发育
果实发育和成熟是一个非常复杂的过程，其中涉及到一系列生理、生化过程的调控。其中色泽、香味、硬度和糖代谢变化既是果实成熟的标志性事件也是果实品质构成的核心因素。糖是果实风味物质、色素、氨基酸、维生素、芳香物质和其它的营养成分合成的原材料，是判断果实品质的重要指标。有研究表明，糖还是一个信号分子，可以通过复杂的糖信号转导机制调节植物中许多与生长发育相关的基因的表达[11]。糖可以作为一个信号组分参与植物的生长发育，糖与乙烯、ABA、细胞分裂素和光之间的关系已有研究[12]，而且糖信号转导与一些激素信号路径间的关系已经在拟南芥中得到证实，比如糖的不敏感突变体对ABA或者乙烯会有应答[12]。蔗糖和ABA可以共同调节一些基因的表达，如蔗糖能调控番茄叶片和果实中ADP葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）亚基基因ApL3的表达水平，而ABA对ApL3的表达并无促进作用，但是当蔗糖与ABA同时存在时，能显著的诱导ApL3基因的表达[13]。这表明蔗糖与ABA信号转导系统可能联系在一起协同调控植物生长发育中功能基因的表达。我们前期的工作表明葡萄果实中三种可溶性糖蔗糖、葡萄糖和果糖含量都是随着果实发育增加，而蔗糖含量相对较低，但蔗糖对ABA含量的影响最明显，其具体的机理还有待研究。
1.3启动子的克隆及功能研究
植物能根据外界环境变化调控特定基因的表达，以适应复杂多变的生长环境。真核生物的基因表达调控包括转录前调控、转录调控、转录后调控、翻译调控和翻译后调控。其中，转录水平的调控受顺式作用元件和转录因子协调作用，是表达调控的关键环节。植物基因启动子中包含多种重要的顺式作用元件，在转录水平上参与调控下游相应基因表达，从而使植物能够抵御外界环境胁迫[14]。因此，对植物启动子的研究有助于了解基因转录调控表达模式及其调控机制，并应用于基因工程中提高或改进外源目的基因的表达[1517]。
基因组文库筛选启动子是使用较早的一种克隆启动子的方法。首先构建适当丰度的基因组文库，然后用与待克隆启动子相关的已知序列片段或特异基因片段做探针与构建好的基因组文库杂交，筛选出含有目的启动子的克隆，测序及活性分析即可确定启动子序列[18,19]。
然后首先利用生物信息学分析与预测启动子元件类型。利用生物信息学对获得的启动子序列进行初步预测和分析，有助于了解启动子序列可能包含的调控元件，为进一步确定其功能奠定基础。其次利用实验方法对其预测功能进行分析，用生物信息学初步预测和分析启动子序列后，进一步通过具体实验确定启动子上的顺式元件及其功能，通常是将启动子片段与报告基因融合构建表达载体转化离体培养细胞或植物体， 检测报告基因在转基因个体中的表达情况，具体分析启动子功能，明确顺式元件作用[16]。植物在受到逆境胁迫时，经过一系列的信号传递，最终激发转录因子与下游基因启动子核心序列结合，调控下游基因表达。细胞感知外界胁迫信号、胁迫信号传递给转录因子、转录因子再与启动子上的顺式作用元件特异结合是一个复杂的信号传递过程。对启动子结构、功能和作用机制的深入研究对于了解基因调控模式和信号传递途径，为深入了解植物的抗逆机制、提高作物的抗逆性有重要的意义。
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