海藻糖相关酶基因的克隆与重组表达
：海藻糖是由两个葡萄糖分子在吡喃环的a，a-1，1糖苷键缩合而成的非还原性双糖，结构稳定，化学惰性，无毒性，在食品工业、医药保健行业、化妆品行业、农业科学中具有重要的应用意义。本研究采用基因工程技术，以本实验室所筛选到的细菌Aquabacterium. sp A7Y为出发菌株，扩增出海藻糖相关酶的基因序列，并在大肠杆菌中进行异源表达，成功构建海藻糖相关酶合成基因。而后，经过超声波细胞破碎仪破碎，得到海藻糖合成酶（trehalose synthase）的粗酶液，通过薄层层析定性测量海藻糖的酶活。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
第一章 绪论 1
1．1海藻糖的简介 1
1．2海藻糖的生物学特性及作用原理 1
1．3海藻糖的应用 2
1．4海藻糖的酶合成法合成途径 3
1．4．1 以葡萄糖为底物的海藻糖合成途径（磷酸化酶体系） 3
1．4．2 以淀粉为底物的海藻糖合成途径 3
1．4．3 以麦芽糖为底物的海藻糖合成途径 4
第二章 材料与方法 4
2．1 材料 4
2．1．1 菌体与载体 4
2．1．2 酶、载体与相关化学试剂 4
2．1．3 仪器 4
2．1．4 培养基 4
2．2 方法 4
2．2．1 目的基因的扩增 4
2．2．2表达载体的构建 5
2．2．3 海藻糖合酶的表达 9
第三章 结果与分析 9
3．1 基因的扩增与表达载体的构建 9
3．1．1 目的基因的PCR扩增 9
3．1．2表达载体的构建 10
3．2 海藻糖合酶基因的表达 13
3．2．1海藻糖合酶基因SDSPAGE结果 13
3．2．2 薄层层析结果 13
第四章 结论 14
致谢 14
参考文献 15
附录 15 海藻糖相关酶基因的克隆与重组表达
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
第一章 绪论
1.1海藻糖的简介
海藻糖(Trehalose, aDglueopyranosylaDglucopyranoside)是由两个葡萄糖分子在吡喃环的a，a1，1糖苷键缩合而成的非还原性双糖，其结构稳定，化学惰性，没有毒性（张红霞等，2008）。在1832年，Wiggers 第一次发现了海藻糖的存在，海藻糖是从生活在沙漠中的一种甲虫蛹里分离得到的，后来被发现广泛存在于低等植物、藻类、细菌、真菌、酵母、昆虫及无脊椎动物中（王蕾，2005）。
1.2海藻糖的生物学特性及作用原理
海藻糖受到了国内外许多研究人员的关注，主要是因为它对生物体和生物大分子具有的非特异性的保护功能，海藻糖在生物体内发挥作用，使生物体具备了极强的抗逆能力（杨平等，2006）。海藻糖的抗逆特性是与它独特分子结构离不开的，为此，科学家们提出了几种海藻糖的抗逆特性的机制假说。
一是“水替代”假说，是由Crowe等科学家（Crowe ，1984）提出的，科学家们发现海藻糖与干态磷脂组成的混合物的物理性质与水合磷脂的物理性质十分的相似，从而提出了“水替代”的假说（薛鸿毅，2012）。他们认为蛋白质等生物大分子具有生物活性是因为大分子周围的水膜，它能够维持大分子的结构和功能。当水膜因为外界环境恶劣而失去时，海藻糖能够在生物大分子失去结构水的部位以羟基和蛋白质分子结合形成氢键，替代水膜的作用（李于，2003），保护失去水膜的部分，保持生物大分子的生物活性。
另一种理论称为“玻璃态”假说，它是由Colaco（Colaco，1992）等科学家提出的，海藻糖在生物体内形成一种类似于“玻璃”的状态，相邻的生物大分子被紧密的包围在这种特殊的结构中。由于类似“玻璃”结构扩散系数低，因此它能在很长的一段时间内保持生物大分子结构，从而保护生物大分子的活性。
还有一种理论是“优先排阻学说”，它是由Tinesheff 等最先提出的，他们认为海藻糖不直接与生物大分子结构产生作用（张玉华等，2005），而是能够同生物大分子竞争周围的水分子，从而导致生物大分子溶剂化层半径减小，使得其空间结构更加的紧凑，提高了生物大分子的稳定性。如此，生物大分子能在不利的环境中依然保持活性。
1.3海藻糖的应用
海藻糖作为一种功能性糖，在生命科学、医药、农业、食品工业、化妆品工业等领域都有着广阔的应用前景（张红霞等，2008）。
（1）在食品工业上的应用
作为甜味剂，海藻糖被广泛的用于各种饮料、零食和甜点中，它的甜度低，口感爽口柔和，不像其他甜味剂会留有后味。目前也有实验表明，海藻糖基本不会引发龋齿，甚至有抗龋齿功能，所以在儿童类食品中海藻糖更为重要。海藻糖还可以作为一种保护剂被应用于各类食品中，在淀粉类食品中可以抑制淀粉的老化，并保证食品中的蛋白质不会被破坏（徐娟等，2012）；在高蛋白产品中可以防止蛋白质的变形，并保证食品的口感（朱绮霞等，2008）。海藻糖也可以作为一种干燥剂应用于食品中，保持干燥，降低食品的吸湿性（张丽杰等，2004），从而保持品质。除此之外，海藻糖还具有出去肉制品腥膻味的作用。
（2）在医药保健等相关行业中的应用
海藻糖相比于其它糖类，在人体中被吸收的速度慢，血糖的反应较平缓，因此患有糖尿病的病人也可以食用（朱绮霞，2008）。由于海藻糖对生物大分子有保护作用，它可以用于血液制品、疫苗、菌苗、抗体、酶等的干燥保存，给生物制品的运输和使用带来很大的方便。海藻糖作为双歧杆菌增殖因子，可以促进双歧杆菌增值，从而可以改善人体肠道生态环境，增强胃肠道吸收功能，增强机体免疫和抵抗病菌能力，它还能够减缓骨胶原的分解速度，具有防止骨质疏松的功能（朱绮霞，2008）。在人们更加注重保健的现今社会中，海藻糖的保健功能特别重要。
（3）在化妆品中的应用
海藻糖具有特殊的保湿性和维持生物大分子活性的特性，因此也被广泛的适用于化妆品行业中（彭亚锋等，2009）。比如在高温、干燥、寒冷等不利于细胞生长的恶劣环境中，海藻糖能够在皮肤表面形成一层特殊的保护膜，从而提高细胞对恶劣环境的抗性，因此海藻糖作为一种添加剂被添加到洗面奶、爽肤水、防晒乳、乳液等化妆品中（徐娟等，2012）。海藻糖与透明质酸搭配，被广泛使用于抗皱去皱类、防晒类化妆品（朱绮霞，2008）。除此之外，它还有抑制体臭、抗辐射、防止油脂分解产生异味等作用。
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摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
第一章 绪论 1
1．1海藻糖的简介 1
1．2海藻糖的生物学特性及作用原理 1
1．3海藻糖的应用 2
1．4海藻糖的酶合成法合成途径 3
1．4．1 以葡萄糖为底物的海藻糖合成途径（磷酸化酶体系） 3
1．4．2 以淀粉为底物的海藻糖合成途径 3
1．4．3 以麦芽糖为底物的海藻糖合成途径 4
第二章 材料与方法 4
2．1 材料 4
2．1．1 菌体与载体 4
2．1．2 酶、载体与相关化学试剂 4
2．1．3 仪器 4
2．1．4 培养基 4
2．2 方法 4
2．2．1 目的基因的扩增 4
2．2．2表达载体的构建 5
2．2．3 海藻糖合酶的表达 9
第三章 结果与分析 9
3．1 基因的扩增与表达载体的构建 9
3．1．1 目的基因的PCR扩增 9
3．1．2表达载体的构建 10
3．2 海藻糖合酶基因的表达 13
3．2．1海藻糖合酶基因SDSPAGE结果 13
3．2．2 薄层层析结果 13
第四章 结论 14
致谢 14
参考文献 15
附录 15 海藻糖相关酶基因的克隆与重组表达
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
第一章 绪论
1.1海藻糖的简介
海藻糖(Trehalose, aDglueopyranosylaDglucopyranoside)是由两个葡萄糖分子在吡喃环的a，a1，1糖苷键缩合而成的非还原性双糖，其结构稳定，化学惰性，没有毒性（张红霞等，2008）。在1832年，Wiggers 第一次发现了海藻糖的存在，海藻糖是从生活在沙漠中的一种甲虫蛹里分离得到的，后来被发现广泛存在于低等植物、藻类、细菌、真菌、酵母、昆虫及无脊椎动物中（王蕾，2005）。
1.2海藻糖的生物学特性及作用原理
海藻糖受到了国内外许多研究人员的关注，主要是因为它对生物体和生物大分子具有的非特异性的保护功能，海藻糖在生物体内发挥作用，使生物体具备了极强的抗逆能力（杨平等，2006）。海藻糖的抗逆特性是与它独特分子结构离不开的，为此，科学家们提出了几种海藻糖的抗逆特性的机制假说。
一是“水替代”假说，是由Crowe等科学家（Crowe ，1984）提出的，科学家们发现海藻糖与干态磷脂组成的混合物的物理性质与水合磷脂的物理性质十分的相似，从而提出了“水替代”的假说（薛鸿毅，2012）。他们认为蛋白质等生物大分子具有生物活性是因为大分子周围的水膜，它能够维持大分子的结构和功能。当水膜因为外界环境恶劣而失去时，海藻糖能够在生物大分子失去结构水的部位以羟基和蛋白质分子结合形成氢键，替代水膜的作用（李于，2003），保护失去水膜的部分，保持生物大分子的生物活性。
另一种理论称为“玻璃态”假说，它是由Colaco（Colaco，1992）等科学家提出的，海藻糖在生物体内形成一种类似于“玻璃”的状态，相邻的生物大分子被紧密的包围在这种特殊的结构中。由于类似“玻璃”结构扩散系数低，因此它能在很长的一段时间内保持生物大分子结构，从而保护生物大分子的活性。
还有一种理论是“优先排阻学说”，它是由Tinesheff 等最先提出的，他们认为海藻糖不直接与生物大分子结构产生作用（张玉华等，2005），而是能够同生物大分子竞争周围的水分子，从而导致生物大分子溶剂化层半径减小，使得其空间结构更加的紧凑，提高了生物大分子的稳定性。如此，生物大分子能在不利的环境中依然保持活性。
1.3海藻糖的应用
海藻糖作为一种功能性糖，在生命科学、医药、农业、食品工业、化妆品工业等领域都有着广阔的应用前景（张红霞等，2008）。
（1）在食品工业上的应用
作为甜味剂，海藻糖被广泛的用于各种饮料、零食和甜点中，它的甜度低，口感爽口柔和，不像其他甜味剂会留有后味。目前也有实验表明，海藻糖基本不会引发龋齿，甚至有抗龋齿功能，所以在儿童类食品中海藻糖更为重要。海藻糖还可以作为一种保护剂被应用于各类食品中，在淀粉类食品中可以抑制淀粉的老化，并保证食品中的蛋白质不会被破坏（徐娟等，2012）；在高蛋白产品中可以防止蛋白质的变形，并保证食品的口感（朱绮霞等，2008）。海藻糖也可以作为一种干燥剂应用于食品中，保持干燥，降低食品的吸湿性（张丽杰等，2004），从而保持品质。除此之外，海藻糖还具有出去肉制品腥膻味的作用。
（2）在医药保健等相关行业中的应用
海藻糖相比于其它糖类，在人体中被吸收的速度慢，血糖的反应较平缓，因此患有糖尿病的病人也可以食用（朱绮霞，2008）。由于海藻糖对生物大分子有保护作用，它可以用于血液制品、疫苗、菌苗、抗体、酶等的干燥保存，给生物制品的运输和使用带来很大的方便。海藻糖作为双歧杆菌增殖因子，可以促进双歧杆菌增值，从而可以改善人体肠道生态环境，增强胃肠道吸收功能，增强机体免疫和抵抗病菌能力，它还能够减缓骨胶原的分解速度，具有防止骨质疏松的功能（朱绮霞，2008）。在人们更加注重保健的现今社会中，海藻糖的保健功能特别重要。
（3）在化妆品中的应用
海藻糖具有特殊的保湿性和维持生物大分子活性的特性，因此也被广泛的适用于化妆品行业中（彭亚锋等，2009）。比如在高温、干燥、寒冷等不利于细胞生长的恶劣环境中，海藻糖能够在皮肤表面形成一层特殊的保护膜，从而提高细胞对恶劣环境的抗性，因此海藻糖作为一种添加剂被添加到洗面奶、爽肤水、防晒乳、乳液等化妆品中（徐娟等，2012）。海藻糖与透明质酸搭配，被广泛使用于抗皱去皱类、防晒类化妆品（朱绮霞，2008）。除此之外，它还有抑制体臭、抗辐射、防止油脂分解产生异味等作用。
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