灵芝组氨酸去乙酰化酶基因的克隆及表达特性研究
灵芝是一种名贵的中药材，有众多药用功效，但其基础研究还比较薄弱，尤其是表观遗传学方面的研究还是空白。表观遗传学是近年来生物学研究的热点之一，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑等表观遗传信息。本文主要研究了灵芝组蛋白修饰中的去乙酰化酶修饰对灵芝的生长发育及其次级代谢产生的影响。通过基因沉默技术，筛选出了2个沉默效率达到80%的Sir2沉默菌株，经过平板培养发现Sir2沉默菌株生长速度显著慢于正常菌株，其次生代谢产物灵芝酸的分泌量较正常菌株高出30%，纤维素酶活性高出一倍。可以看出，组蛋白的去乙酰化酶修饰对灵芝的生长调控起到了重要的作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2实验方法 2
1.2.1 Sir2基因的克隆与测序2
1.2.2 Sir2基因沉默载体的构建4
1.2.3灵芝原生质体转化5
1.2.4灵芝总RNA的提取及cDNA的制备5
1.2.5实时荧光定量PCR5
1.2.6灵芝菌丝生长的测定6
1.2.7灵芝胞内灵芝酸含量测定6
1.2.8灵芝胞内纤维素酶活性测定7
2结果与分析7
2.1 Sir2沉默载体构建7
2.2 Sir2沉默转化子的筛选8
2.3 Sir2基因沉默抑制灵芝菌丝生长8
2.4 Sir2基因沉默对灵芝酸含量的影响8
2.5 Sir2基因沉默对灵芝纤维素酶活性的影响9
3讨论10
致谢11
参考文献11
灵芝组氨酸去乙酰化酶基因的克隆及表达特性研究
引言
引言
灵芝作为一种具有很好保健功效的大型担子菌有很高的研究价值，灵芝的主要活性成分是灵芝多糖[12]，主要次生代谢产物是灵芝酸。灵芝酸是一种具有抗癌、解毒、增强免疫力等多重效能的天然有机化合物[3]，是衡量灵芝价值的主要指标之一。灵芝酸的产生和积累受到自身遗传和环境因素的调控[4]，但目前的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
研究主要集中在对灵芝培养条件的改良和如何分离纯化有效的药用成分，以及外源刺激对次生代谢的影响，对灵芝酸合成的遗传调控研究较少，尤其是表观遗传学方面的研究。近年来表观遗传学作为生命科学的研究热点，其包含的DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等研究领域对基因的表达调控有很大影响，同时众多研究发现表观修饰对真菌的生长代谢起关键的作用。
本文主要研究与酵母去乙酰化酶(HDAC)Sir2家族同源的灵芝去乙酰化酶。HDACs是一类可以调控组蛋白乙酰化修饰的酶类，染色体组蛋白的乙酰化修饰能改变染色体的结构，影响基因的转录表达。乙酰转移酶和去乙酰化酶可以动态调控组蛋白的乙酰化，有研究发现当组蛋白去乙酰化过于活跃则可以使染色质形成封闭结构，从而导致“基因沉默”[5]，因此组蛋白的乙酰化修饰有很大可能会影响灵芝的生长和次生代谢水平。
此外，灵芝作为白腐菌的一种，在生态循环中起到关键的木质降解作用[6]，其纤维素酶的活性可以很大程度上影响它的生长速度。周娇娇的实验发现组蛋白的去乙酰化修饰对里氏木霉的纤维素酶活性有较大影响[7]，同样是真菌的灵芝在去乙酰化酶活性被抑制后其纤维素酶活性的变化也值得研究。本文主要做了Sir2基因克隆、Sir2沉默载体构建、Sir2沉默菌株培养、灵芝酸含量测定等工作，为灵芝生长发育和次级代谢过程中，组蛋白乙酰化修饰所具有的调控作用，提供了实验数据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌株和培养条件
灵芝菌株4℃保存，培养温度为28℃，摇床培养转速为150 rpm。
大肠杆菌DH5α菌株的培养方法为在LB固体或液体培养基中培养，培养温度为37℃。
1．1．2 主要试剂
pMD19T vector、rTaq和高保真酶、T4 DNA ligase、SpeⅠ和KpnⅠ两种内切酶、RNA提取相关试剂，总RNA反转录试剂盒，DNA胶回收试剂盒、卡那霉素（Kan）、氨苄青霉素（Amp）等。DNA测序在杰李生物科技有限公司完成。
1．2 实验方法
1．2．1 Sir2基因的克隆与测序
1．2．1．1 cDNA序列扩增
根据比对得到的Sir2基因的全长序列，利用Prime Premier 5.0软件设计引物，以灵芝cDNA为模板，用rTaq酶扩增cDNA序列，扩增体系为25 μL。
(1)PCR扩增体系为：
10×Buffer
2.5 μL
dNTPs（total 10 mM）
2 μL
引物1（20 mM）
1 μL
引物2（20 mM）
1 μL
cDNA模板
1 μL
ddH2O
17.3 μL
Taq酶（5 U/μL）
0.2 μL
总体积
25 μL
25 μL
(2)PCR扩增程序为：
94°C 5 min
94°C 30s
55°C 30s 30 cycles
72°C 30s
72°C 10 min
结束后用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1．2．1．2 PCR产物回收
PCR产物通过电泳分离，在凝胶成像仪中观察目的片段大小是否符合，再在紫外灯下用刀片切下目的条带，注意过程中手不要接触凝胶，且紫外照射时间尽量短。最后通过DNA胶回收试剂盒进行回收，回收完后的DNA保存在20℃冰箱。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2实验方法 2
1.2.1 Sir2基因的克隆与测序2
1.2.2 Sir2基因沉默载体的构建4
1.2.3灵芝原生质体转化5
1.2.4灵芝总RNA的提取及cDNA的制备5
1.2.5实时荧光定量PCR5
1.2.6灵芝菌丝生长的测定6
1.2.7灵芝胞内灵芝酸含量测定6
1.2.8灵芝胞内纤维素酶活性测定7
2结果与分析7
2.1 Sir2沉默载体构建7
2.2 Sir2沉默转化子的筛选8
2.3 Sir2基因沉默抑制灵芝菌丝生长8
2.4 Sir2基因沉默对灵芝酸含量的影响8
2.5 Sir2基因沉默对灵芝纤维素酶活性的影响9
3讨论10
致谢11
参考文献11
灵芝组氨酸去乙酰化酶基因的克隆及表达特性研究
引言
引言
灵芝作为一种具有很好保健功效的大型担子菌有很高的研究价值，灵芝的主要活性成分是灵芝多糖[12]，主要次生代谢产物是灵芝酸。灵芝酸是一种具有抗癌、解毒、增强免疫力等多重效能的天然有机化合物[3]，是衡量灵芝价值的主要指标之一。灵芝酸的产生和积累受到自身遗传和环境因素的调控[4]，但目前的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
研究主要集中在对灵芝培养条件的改良和如何分离纯化有效的药用成分，以及外源刺激对次生代谢的影响，对灵芝酸合成的遗传调控研究较少，尤其是表观遗传学方面的研究。近年来表观遗传学作为生命科学的研究热点，其包含的DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等研究领域对基因的表达调控有很大影响，同时众多研究发现表观修饰对真菌的生长代谢起关键的作用。
本文主要研究与酵母去乙酰化酶(HDAC)Sir2家族同源的灵芝去乙酰化酶。HDACs是一类可以调控组蛋白乙酰化修饰的酶类，染色体组蛋白的乙酰化修饰能改变染色体的结构，影响基因的转录表达。乙酰转移酶和去乙酰化酶可以动态调控组蛋白的乙酰化，有研究发现当组蛋白去乙酰化过于活跃则可以使染色质形成封闭结构，从而导致“基因沉默”[5]，因此组蛋白的乙酰化修饰有很大可能会影响灵芝的生长和次生代谢水平。
此外，灵芝作为白腐菌的一种，在生态循环中起到关键的木质降解作用[6]，其纤维素酶的活性可以很大程度上影响它的生长速度。周娇娇的实验发现组蛋白的去乙酰化修饰对里氏木霉的纤维素酶活性有较大影响[7]，同样是真菌的灵芝在去乙酰化酶活性被抑制后其纤维素酶活性的变化也值得研究。本文主要做了Sir2基因克隆、Sir2沉默载体构建、Sir2沉默菌株培养、灵芝酸含量测定等工作，为灵芝生长发育和次级代谢过程中，组蛋白乙酰化修饰所具有的调控作用，提供了实验数据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌株和培养条件
灵芝菌株4℃保存，培养温度为28℃，摇床培养转速为150 rpm。
大肠杆菌DH5α菌株的培养方法为在LB固体或液体培养基中培养，培养温度为37℃。
1．1．2 主要试剂
pMD19T vector、rTaq和高保真酶、T4 DNA ligase、SpeⅠ和KpnⅠ两种内切酶、RNA提取相关试剂，总RNA反转录试剂盒，DNA胶回收试剂盒、卡那霉素（Kan）、氨苄青霉素（Amp）等。DNA测序在杰李生物科技有限公司完成。
1．2 实验方法
1．2．1 Sir2基因的克隆与测序
1．2．1．1 cDNA序列扩增
根据比对得到的Sir2基因的全长序列，利用Prime Premier 5.0软件设计引物，以灵芝cDNA为模板，用rTaq酶扩增cDNA序列，扩增体系为25 μL。
(1)PCR扩增体系为：
10×Buffer
2.5 μL
dNTPs（total 10 mM）
2 μL
引物1（20 mM）
1 μL
引物2（20 mM）
1 μL
cDNA模板
1 μL
ddH2O
17.3 μL
Taq酶（5 U/μL）
0.2 μL
总体积
25 μL
25 μL
(2)PCR扩增程序为：
94°C 5 min
94°C 30s
55°C 30s 30 cycles
72°C 30s
72°C 10 min
结束后用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1．2．1．2 PCR产物回收
PCR产物通过电泳分离，在凝胶成像仪中观察目的片段大小是否符合，再在紫外灯下用刀片切下目的条带，注意过程中手不要接触凝胶，且紫外照射时间尽量短。最后通过DNA胶回收试剂盒进行回收，回收完后的DNA保存在20℃冰箱。
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