酿酒酵母中snare蛋白sec20在细胞自噬过程中的定位研究
细胞自噬是真核细胞中胞内组份降解的一种生理过程。该过程通过对胞内物质的包裹、运输、降解为自身提供营养与能量，从而达到应对外界恶劣环境的目的。Sec20是参与COPI囊泡与内质网融合的SNARE蛋白。本实验室前期实验结果发现，该蛋白同时参与细胞自噬过程，但具体的机制并不清楚。本研究针对Sec20的细胞自噬过程中的定位进行研究，发现Sec20作用于自噬体运输、自噬体与液泡融合的过程，且Sec20随着自噬体进入液泡。进一步研究发现，Sec20第234位亮氨酸突变为丝氨酸后，该蛋白的细胞自噬过程中的定位发生改变。这些结果，为研究SNARE蛋白Sec20在细胞自噬过程中的具体功能提供了实验基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1 菌株与质粒2
1.1.2 主要培养基和组分2
1.2 实验方法 2
1.2.1 重组质粒2
1.2.2 重组质粒转入感受态细胞3
1.2.3 阳性质粒转入酵母菌4
1.2.4 荧光观测样品准备4
1.2.5 荧光观察及图片处理4
2 结果与分析4
2.1 重组质粒成功构建4
2.2不同酵母菌株中Sec20、Sec201和自噬蛋白的定位情况5
2.2.1 WT菌株中Sec20、Sec201和自噬蛋白的定位情况5
2.2.2 atg1△中Sec20、Sec201和自噬蛋白的定位情况7
2.2.3 vps21△中Sec20、Sec201和自噬蛋白的定位情况7
2.2.4 ypt7△中Sec20、Sec201和自噬蛋白的定位情况8
3 讨论 9
致谢9
参考文献10
酿酒酵母中SNARE蛋白Sec20在细胞自噬过程中的定位研究
引言
细胞自噬是真核生物中用于降解和回收利用细胞内长效大分子和受损细胞器的动态过程。细胞自噬是一个多步骤，受多种蛋白调控的复杂过程，分为自噬前体形 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
成、自噬前体延长并包裹自噬底物形成自噬泡、自噬泡与溶酶体融合、底物降解等阶段[1]。细胞自噬不仅是生物体内的一种物质降解途径，同时在生物体生长发育、免疫防御、细胞程序性死亡、肿瘤抑制、神经性病变抑制等方面有非常重要的作用[2]。
SNARE（可溶性N乙基马来酰胺敏感因子结合蛋白受体）蛋白是细胞内物质运输过程中介导囊泡与细胞膜特异性融合的主要蛋白分子[3]，正是这种特异性保证了细胞内正常生理活动的有序进行。近年来研究表明，参与囊泡运输的SNARE蛋白在细胞自噬过程中也发挥着重要的作用[4]，不同的SNARE蛋白调控细胞自噬的分子机制也不尽相同。
之前的研究表明，酵母细胞中的SNARE蛋白Sso1/2和Sec9可以促进Atg9小泡与PAS的膜融合过程以及Atg8蛋白的招募[5]；哺乳动物中也发现SNARE蛋白参与细胞自噬的证据，Stx17蛋白不仅能调控早期自噬体的形成[6]，而且能与VAMP8、Snap29 相互作用，促进自噬体与溶酶体的融合，完成细胞自噬的过程[7]。
本课题研究的SNARE蛋白Sec20在囊泡运输的过程中与Tip1组成复合体，在ERGolgi运输过程中作为功能元件[8]，此外，Sec20还能与Dsl1复合体相互作用调节GolgiER的逆向运输[9]。而实验室前期工作发现，SNARE蛋白Sec20也参与细胞自噬，但其参与自噬过程中的具体机制并不清楚。因此，本课题以酿酒酵母为实验材料，以SNARE蛋白Sec20为研究对象，采用荧光显微镜观察等方法，探究SNARE蛋白Sec20在细胞自噬过程中的定位变化。结果发现Sec20参与细胞自噬，主要作用于自噬体形成以及自噬体和液泡的融合过程。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌株与质粒 质粒pRS416GFPsec20、pGADT7Sec201、空载体pRS415AOHmChMCSAOH/ter，感受态大肠杆菌，酵母菌WT（GFPAtg8）、WT（Atg93×GFP）、atg1△、ypt7△、vps21△（详见表1），由大学生命科学学院酵母生物学实验室提供。
表1 本实验所用酿酒酵母菌株
Table 1 Saccharomyces cerevisiae strains used in this study
菌株
Strains
基因型
Genotye
菌株来源
Source
YHY2422
SEY6210, GFPAtg8#5
(Liang et al.2017)
YHY4816
SEY6210, Atg93×GFP：：kanMx6
(Liang et al.2017)
YHY4595
YHY2422 , atg1△：：Kan #3
(Liang et al.2017)
YHY4747
YHY2422, ypt7△：：Kan #1
(Liang et al.2017)
YHY1629
YHY2422 ,vps21△：：Kan #4
(Liang et al.2017)
1．1．2 主要培养基和组分 LB+Amp液体培养基（1 L）：10 g Tryptone、5 g yeast extract、5 g NaCl，超纯水定容至1 L，加入1 mL 1 N NaOH，120℃灭菌20 min后加入1 mL 100 mg/mL Amp；YPD固体培养基（1 L）：10 g yeast extract、20 g Bacto Peptone、20 g Bacto Agar，超纯水定容至950 mL，灭菌后倒平板；YPD液体培养基（1 L）：10 g yeast extract、20 g Bacto Peptone，超纯水定容至950 mL，灭菌后加入50 mL 400 g/L葡萄糖溶液；SDLeu固体培养基（1 L）：20 g Agar、7.1 g YNB super powder，超纯水定容至910 mL，灭菌后加入50 mL 400 g/L葡萄糖溶液和40 mL 25×SDLeu dropout；SDN (1 L): 7.1 g YNB super powder（不含硫酸铵和氨基酸），超纯水定容至910 mL，灭菌后加入50 mL 400 g/L葡萄糖溶液和40 mL 25×SDN dropout。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1 菌株与质粒2
1.1.2 主要培养基和组分2
1.2 实验方法 2
1.2.1 重组质粒2
1.2.2 重组质粒转入感受态细胞3
1.2.3 阳性质粒转入酵母菌4
1.2.4 荧光观测样品准备4
1.2.5 荧光观察及图片处理4
2 结果与分析4
2.1 重组质粒成功构建4
2.2不同酵母菌株中Sec20、Sec201和自噬蛋白的定位情况5
2.2.1 WT菌株中Sec20、Sec201和自噬蛋白的定位情况5
2.2.2 atg1△中Sec20、Sec201和自噬蛋白的定位情况7
2.2.3 vps21△中Sec20、Sec201和自噬蛋白的定位情况7
2.2.4 ypt7△中Sec20、Sec201和自噬蛋白的定位情况8
3 讨论 9
致谢9
参考文献10
酿酒酵母中SNARE蛋白Sec20在细胞自噬过程中的定位研究
引言
细胞自噬是真核生物中用于降解和回收利用细胞内长效大分子和受损细胞器的动态过程。细胞自噬是一个多步骤，受多种蛋白调控的复杂过程，分为自噬前体形 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
成、自噬前体延长并包裹自噬底物形成自噬泡、自噬泡与溶酶体融合、底物降解等阶段[1]。细胞自噬不仅是生物体内的一种物质降解途径，同时在生物体生长发育、免疫防御、细胞程序性死亡、肿瘤抑制、神经性病变抑制等方面有非常重要的作用[2]。
SNARE（可溶性N乙基马来酰胺敏感因子结合蛋白受体）蛋白是细胞内物质运输过程中介导囊泡与细胞膜特异性融合的主要蛋白分子[3]，正是这种特异性保证了细胞内正常生理活动的有序进行。近年来研究表明，参与囊泡运输的SNARE蛋白在细胞自噬过程中也发挥着重要的作用[4]，不同的SNARE蛋白调控细胞自噬的分子机制也不尽相同。
之前的研究表明，酵母细胞中的SNARE蛋白Sso1/2和Sec9可以促进Atg9小泡与PAS的膜融合过程以及Atg8蛋白的招募[5]；哺乳动物中也发现SNARE蛋白参与细胞自噬的证据，Stx17蛋白不仅能调控早期自噬体的形成[6]，而且能与VAMP8、Snap29 相互作用，促进自噬体与溶酶体的融合，完成细胞自噬的过程[7]。
本课题研究的SNARE蛋白Sec20在囊泡运输的过程中与Tip1组成复合体，在ERGolgi运输过程中作为功能元件[8]，此外，Sec20还能与Dsl1复合体相互作用调节GolgiER的逆向运输[9]。而实验室前期工作发现，SNARE蛋白Sec20也参与细胞自噬，但其参与自噬过程中的具体机制并不清楚。因此，本课题以酿酒酵母为实验材料，以SNARE蛋白Sec20为研究对象，采用荧光显微镜观察等方法，探究SNARE蛋白Sec20在细胞自噬过程中的定位变化。结果发现Sec20参与细胞自噬，主要作用于自噬体形成以及自噬体和液泡的融合过程。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌株与质粒 质粒pRS416GFPsec20、pGADT7Sec201、空载体pRS415AOHmChMCSAOH/ter，感受态大肠杆菌，酵母菌WT（GFPAtg8）、WT（Atg93×GFP）、atg1△、ypt7△、vps21△（详见表1），由大学生命科学学院酵母生物学实验室提供。
表1 本实验所用酿酒酵母菌株
Table 1 Saccharomyces cerevisiae strains used in this study
菌株
Strains
基因型
Genotye
菌株来源
Source
YHY2422
SEY6210, GFPAtg8#5
(Liang et al.2017)
YHY4816
SEY6210, Atg93×GFP：：kanMx6
(Liang et al.2017)
YHY4595
YHY2422 , atg1△：：Kan #3
(Liang et al.2017)
YHY4747
YHY2422, ypt7△：：Kan #1
(Liang et al.2017)
YHY1629
YHY2422 ,vps21△：：Kan #4
(Liang et al.2017)
1．1．2 主要培养基和组分 LB+Amp液体培养基（1 L）：10 g Tryptone、5 g yeast extract、5 g NaCl，超纯水定容至1 L，加入1 mL 1 N NaOH，120℃灭菌20 min后加入1 mL 100 mg/mL Amp；YPD固体培养基（1 L）：10 g yeast extract、20 g Bacto Peptone、20 g Bacto Agar，超纯水定容至950 mL，灭菌后倒平板；YPD液体培养基（1 L）：10 g yeast extract、20 g Bacto Peptone，超纯水定容至950 mL，灭菌后加入50 mL 400 g/L葡萄糖溶液；SDLeu固体培养基（1 L）：20 g Agar、7.1 g YNB super powder，超纯水定容至910 mL，灭菌后加入50 mL 400 g/L葡萄糖溶液和40 mL 25×SDLeu dropout；SDN (1 L): 7.1 g YNB super powder（不含硫酸铵和氨基酸），超纯水定容至910 mL，灭菌后加入50 mL 400 g/L葡萄糖溶液和40 mL 25×SDN dropout。
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