苏北传统小吃盐豆子中主要微生物的分离与鉴定
苏北传统小吃盐豆子中主要微生物的分离与鉴定[20200614172659]
摘要：
盐豆子是苏北地区人们非常喜爱的一种传统食品。一些发酵食品一般会对人造成一些不健康的影响，比如发酵食品发酵过程中的未知微生物可能对人体有害等。本试验就主要针对盐豆子中的微生物进行研究鉴定其中微生物是否存在对人体有害的潜在因素。本文首先用涂布平板法对6个样品盐豆进行培养。通过观察发现主要细菌为芽孢杆菌，真菌基本没有在平板上生长。所以我们对长出来的芽孢杆菌主要菌种的单菌落再进行分菌，直到分出单一菌种，然后接菌到试管中进行30℃摇床的培养。最后对分出的几个菌株进行16S rDNA鉴定。最终结果显示盐豆子中的主要微生物为枯草芽孢杆菌类群和蜡状芽孢杆菌类群。其中蜡状芽孢杆菌类群可能存在潜在的致病危害。
关键词：盐豆子；芽孢杆菌；人体健康；16S rDNA鉴定
摘要： 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言： 3
1.盐豆子简介 3
2.研究目的和意义 4
3.国内外研究现状 4
1 材料与方法 5
1.1 材料 5
1.1.1 培养基 5
1.1.2 盐豆子样品 5
1.1.3 染色观察需要的材料 5
1.1.4 盐豆子纳豆激酶活性测定溶液配制： 5
1.2 方法 5
1.2.1样品稀释液的制备 6
1.2.2平板涂布 6
1.2.3 培养 6
1.2.4用稀释平板计数 6
1.2.5细菌的分离纯化 6
1.2.6对菌株进行染色观察 6
1.2.7菌体总DNA的提取 6
1.2.8 样品菌株16S rDNA的PCR扩增 6
1.2.9 电泳验证 7
1.2.10 PCR产物的回收 7
1.2.11 16S rDNA的序列测定 7
1.2.12 盐豆子菌种类群的确定 7
1.2.13 TAME法测对样品盐豆子纳豆激酶（NK）活性的测定 8
2 结果与分析 8
2.1 盐豆子的制作 8
2.1.1本试验制作流程： 8
2.1.2 传统的制作流程 9
2.2 盐豆子中微生物的原位显微观察 10
2.3 盐豆子中微生物的分离、培养与计数 10
2.4 被选取菌株的16S rDNA序列分析 11
2.5 样品和菌液的纳豆激酶（NK）活性测定 14
3 讨论 14
3.1盐豆子中微生物的分离、培养 14
3.2菌株的16S rDNA序列 14
致谢 14
参考文献： 15
附录 16
相关DNA序列 16
苏北传统小吃“盐豆子”中主要微生物的分离与鉴定
引言：
1.盐豆子简介
盐豆子是一种历史悠久的传统食品，最早可以追溯到楚汉时期，民间流传着一个有意思的传说。话说当年项羽带兵打仗时有个爱好，比较喜欢吃煮熟的黄豆。所以每次就用草编织的袋子随身携带许多煮熟的黄豆。而带兵打仗免不了吃败仗，就会被刘备军队追出好几天。天冷的时候还好，黄豆在几天之内味道不变依然可以食用，可是一到天热的时候随身携带的黄豆在草袋里就会变了味道，还会长出许多黏黏的丝状物。由于躲避追兵时又没有多余的粮食，项羽就只能试着吃掉 “变了味”的黄豆。没想到“变了味”
的黄豆虽然围起来很臭吃起来却很香。项羽觉得这黄豆没有想象中那样难以下咽反而比之前更有风味了，就将这“变了味”的黄豆分发给麾下士兵。从此，这个“变了味”的黄豆在项羽军中流传开来，成为军中士兵打仗时不可缺少的食物，并且给这个食品取了一个响亮的名字—霸王豆。经过几千年流传发展就成为了如今苏北地区人们日常食用的食品—盐豆子。
须见洋行英文名（H. Sumi）[1]，1987年在纳豆中发现了一种能够溶解血栓的酶，随将其命名为纳豆激酶[2]，，纳豆具有枯草杆菌的形态特征，属于革兰氏阳性菌[3]。从此须见洋行博士声名大噪，因此被人尊称为“纳豆激酶之父”、“纳豆博士”等称号。须见洋行博士曾经诚恳地表示，纳豆的远祖来自中国，他一直希望可以通过最新的测试方法帮助生产厂家为消费者提供真正高质量的产品；以及通过对授权产品的澄清给消费者带来更加安心的购买环境；然后充分利用中国的大豆资源，让更多的人因此收益，使纳豆真正回归到中国。由此可以，盐豆子不仅历史悠久还可以追溯为纳豆的发源，所以对盐豆子的研究任务更加迫切。
2.研究目的和意义
现代科技的发展非常之迅猛，物质文明得到了极大的丰富，人们生活节奏加快了，压力也跟着增加了，现代人创造了辉煌的物质文明的同时自身健康也受到了空前的挑战，人们生活的环境日益恶化同时威胁着人们，各种疾病的发病率也随之增高了。尤其饮食方面和人类的健康息息相关。随着饮食的多元化，各种食品对人类健康的危害性也逐渐引起了人们的关注。本文就对苏北盐豆子中的主要微生物进行检测研究来了解这种苏北地区日常必需的发酵食品在微生物方面是否对人体健康是否存在可能潜在的危害。
苏北盐豆子作为苏北地区一种传统普遍的食品，口味独特符合苏北地区人们喜食辛辣的饮食习惯所以广泛流传。在营养方面豆类为主要原料故蛋白质丰富，并且拥有延缓衰老和美容的保健功效。同时作为发酵食品，在健康方面是否对人体健康有所危害就是本文研究的关键。本试验主要对其发酵过程中主要微生物进行检测鉴定研究，来确定此种微生物是否会对人体健康造成不良影响。
日本纳豆最早起源于中国盐豆子，现今盐豆子和日本纳豆制作流程也极为相似。日本纳豆现如今因为其中的纳豆激酶具有溶解血栓的功能而声名大噪，世界各地对纳豆的研究更是数不胜数[4]。但是对于中国苏北地区盐豆子的研究确是寥寥无几。本文计划对中国盐豆子进行初步的研究，也可以为以后深入研究盐豆子和纳豆之间关联的学者们提供一定的依据，也算是对中国盐豆子研究开创一个先河。所以从某种程度上来说，本文的研究具有了一定的重要意义。
3.国内外研究现状
本试验主要是对其中的微生物进行rDNA测序来确定其菌种。而在细菌真菌方面国内外研究主要在于革兰氏阳性菌分菌方面，正细菌分类学既是一门基础学科,又是综合性学科。它的任务是在全面了解细菌生物学特性的基础上,研究细菌的种类,探求其起源、演化与其它类群生物及其内部各类群间的亲缘关系,从而提出反映自然发展的分类系统,并将细菌加以分门别类。细菌分类学发展较晚,开始也是以外部形态为分类依据,以后逐渐采用一般生理生化特征,但是,依此所建立的分类系统仍摆脱不了人为因素。
苏北盐豆子和纳豆有很多相似之处。虽然对盐豆子国内外研究甚少，可对纳豆的研究还是相对比较深刻的。尤其是纳豆中的营养成分及活性成分，还有其的医疗保健功能。不过更多的是对那都中的其中一种活性成分—纳豆激酶的研究，因为纳豆机没具有溶解血栓的功能。近年来，在纳豆激酶的分子学方面的研究比较重点。比如：纳豆激酶的克隆、表达等等。同时学者们对纳豆食品和含有纳豆激酶的一些保健食品进行了深入的研究开发，旨在将它作为一种功能食品，为了治疗或者预防心脑血管疾病以及一些常见多发病。目前正在世界各国开拓市场[5,6,7,8]。
自从1995年国内有了第一篇报道了关于纳豆和纳豆激酶以来，在中国也开始逐渐有了一些学者开始研究纳豆和纳豆激酶，并开始掀起研究和开发热潮。所以近年来我国在纳豆激酶基因克隆和表达、纳豆激酶的生理生化、纳豆发酵过程中的工艺改良、君主的筛选、甚至新型产品的开发都有了一定的成就。具体到可以从不同的菌株（纳豆杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌）中克隆了纳豆激酶的成熟肽基因，实现了在一些菌中进行表达如：枯草芽孢杆菌、酵母菌和大肠杆菌，并且通过柱层析分离纯化出高纯度的而且具有溶栓活性的纳豆激酶[9,10,11]。
同时，对纳豆和纳豆激酶的火热研究现状也在时刻提醒着我们，对于纳豆的“老祖宗”—盐豆子的研究现在还基本是一片空白，在盐豆子的研究方面关于食品安全和发酵微生物的改良等都有待我们去探索。
摘要：
盐豆子是苏北地区人们非常喜爱的一种传统食品。一些发酵食品一般会对人造成一些不健康的影响，比如发酵食品发酵过程中的未知微生物可能对人体有害等。本试验就主要针对盐豆子中的微生物进行研究鉴定其中微生物是否存在对人体有害的潜在因素。本文首先用涂布平板法对6个样品盐豆进行培养。通过观察发现主要细菌为芽孢杆菌，真菌基本没有在平板上生长。所以我们对长出来的芽孢杆菌主要菌种的单菌落再进行分菌，直到分出单一菌种，然后接菌到试管中进行30℃摇床的培养。最后对分出的几个菌株进行16S rDNA鉴定。最终结果显示盐豆子中的主要微生物为枯草芽孢杆菌类群和蜡状芽孢杆菌类群。其中蜡状芽孢杆菌类群可能存在潜在的致病危害。
关键词：盐豆子；芽孢杆菌；人体健康；16S rDNA鉴定
摘要： 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言： 3
1.盐豆子简介 3
2.研究目的和意义 4
3.国内外研究现状 4
1 材料与方法 5
1.1 材料 5
1.1.1 培养基 5
1.1.2 盐豆子样品 5
1.1.3 染色观察需要的材料 5
1.1.4 盐豆子纳豆激酶活性测定溶液配制： 5
1.2 方法 5
1.2.1样品稀释液的制备 6
1.2.2平板涂布 6
1.2.3 培养 6
1.2.4用稀释平板计数 6
1.2.5细菌的分离纯化 6
1.2.6对菌株进行染色观察 6
1.2.7菌体总DNA的提取 6
1.2.8 样品菌株16S rDNA的PCR扩增 6
1.2.9 电泳验证 7
1.2.10 PCR产物的回收 7
1.2.11 16S rDNA的序列测定 7
1.2.12 盐豆子菌种类群的确定 7
1.2.13 TAME法测对样品盐豆子纳豆激酶（NK）活性的测定 8
2 结果与分析 8
2.1 盐豆子的制作 8
2.1.1本试验制作流程： 8
2.1.2 传统的制作流程 9
2.2 盐豆子中微生物的原位显微观察 10
2.3 盐豆子中微生物的分离、培养与计数 10
2.4 被选取菌株的16S rDNA序列分析 11
2.5 样品和菌液的纳豆激酶（NK）活性测定 14
3 讨论 14
3.1盐豆子中微生物的分离、培养 14
3.2菌株的16S rDNA序列 14
致谢 14
参考文献： 15
附录 16
相关DNA序列 16
苏北传统小吃“盐豆子”中主要微生物的分离与鉴定
引言：
1.盐豆子简介
盐豆子是一种历史悠久的传统食品，最早可以追溯到楚汉时期，民间流传着一个有意思的传说。话说当年项羽带兵打仗时有个爱好，比较喜欢吃煮熟的黄豆。所以每次就用草编织的袋子随身携带许多煮熟的黄豆。而带兵打仗免不了吃败仗，就会被刘备军队追出好几天。天冷的时候还好，黄豆在几天之内味道不变依然可以食用，可是一到天热的时候随身携带的黄豆在草袋里就会变了味道，还会长出许多黏黏的丝状物。由于躲避追兵时又没有多余的粮食，项羽就只能试着吃掉 “变了味”的黄豆。没想到“变了味”
的黄豆虽然围起来很臭吃起来却很香。项羽觉得这黄豆没有想象中那样难以下咽反而比之前更有风味了，就将这“变了味”的黄豆分发给麾下士兵。从此，这个“变了味”的黄豆在项羽军中流传开来，成为军中士兵打仗时不可缺少的食物，并且给这个食品取了一个响亮的名字—霸王豆。经过几千年流传发展就成为了如今苏北地区人们日常食用的食品—盐豆子。
须见洋行英文名（H. Sumi）[1]，1987年在纳豆中发现了一种能够溶解血栓的酶，随将其命名为纳豆激酶[2]，，纳豆具有枯草杆菌的形态特征，属于革兰氏阳性菌[3]。从此须见洋行博士声名大噪，因此被人尊称为“纳豆激酶之父”、“纳豆博士”等称号。须见洋行博士曾经诚恳地表示，纳豆的远祖来自中国，他一直希望可以通过最新的测试方法帮助生产厂家为消费者提供真正高质量的产品；以及通过对授权产品的澄清给消费者带来更加安心的购买环境；然后充分利用中国的大豆资源，让更多的人因此收益，使纳豆真正回归到中国。由此可以，盐豆子不仅历史悠久还可以追溯为纳豆的发源，所以对盐豆子的研究任务更加迫切。
2.研究目的和意义
现代科技的发展非常之迅猛，物质文明得到了极大的丰富，人们生活节奏加快了，压力也跟着增加了，现代人创造了辉煌的物质文明的同时自身健康也受到了空前的挑战，人们生活的环境日益恶化同时威胁着人们，各种疾病的发病率也随之增高了。尤其饮食方面和人类的健康息息相关。随着饮食的多元化，各种食品对人类健康的危害性也逐渐引起了人们的关注。本文就对苏北盐豆子中的主要微生物进行检测研究来了解这种苏北地区日常必需的发酵食品在微生物方面是否对人体健康是否存在可能潜在的危害。
苏北盐豆子作为苏北地区一种传统普遍的食品，口味独特符合苏北地区人们喜食辛辣的饮食习惯所以广泛流传。在营养方面豆类为主要原料故蛋白质丰富，并且拥有延缓衰老和美容的保健功效。同时作为发酵食品，在健康方面是否对人体健康有所危害就是本文研究的关键。本试验主要对其发酵过程中主要微生物进行检测鉴定研究，来确定此种微生物是否会对人体健康造成不良影响。
日本纳豆最早起源于中国盐豆子，现今盐豆子和日本纳豆制作流程也极为相似。日本纳豆现如今因为其中的纳豆激酶具有溶解血栓的功能而声名大噪，世界各地对纳豆的研究更是数不胜数[4]。但是对于中国苏北地区盐豆子的研究确是寥寥无几。本文计划对中国盐豆子进行初步的研究，也可以为以后深入研究盐豆子和纳豆之间关联的学者们提供一定的依据，也算是对中国盐豆子研究开创一个先河。所以从某种程度上来说，本文的研究具有了一定的重要意义。
3.国内外研究现状
本试验主要是对其中的微生物进行rDNA测序来确定其菌种。而在细菌真菌方面国内外研究主要在于革兰氏阳性菌分菌方面，正细菌分类学既是一门基础学科,又是综合性学科。它的任务是在全面了解细菌生物学特性的基础上,研究细菌的种类,探求其起源、演化与其它类群生物及其内部各类群间的亲缘关系,从而提出反映自然发展的分类系统,并将细菌加以分门别类。细菌分类学发展较晚,开始也是以外部形态为分类依据,以后逐渐采用一般生理生化特征,但是,依此所建立的分类系统仍摆脱不了人为因素。
苏北盐豆子和纳豆有很多相似之处。虽然对盐豆子国内外研究甚少，可对纳豆的研究还是相对比较深刻的。尤其是纳豆中的营养成分及活性成分，还有其的医疗保健功能。不过更多的是对那都中的其中一种活性成分—纳豆激酶的研究，因为纳豆机没具有溶解血栓的功能。近年来，在纳豆激酶的分子学方面的研究比较重点。比如：纳豆激酶的克隆、表达等等。同时学者们对纳豆食品和含有纳豆激酶的一些保健食品进行了深入的研究开发，旨在将它作为一种功能食品，为了治疗或者预防心脑血管疾病以及一些常见多发病。目前正在世界各国开拓市场[5,6,7,8]。
自从1995年国内有了第一篇报道了关于纳豆和纳豆激酶以来，在中国也开始逐渐有了一些学者开始研究纳豆和纳豆激酶，并开始掀起研究和开发热潮。所以近年来我国在纳豆激酶基因克隆和表达、纳豆激酶的生理生化、纳豆发酵过程中的工艺改良、君主的筛选、甚至新型产品的开发都有了一定的成就。具体到可以从不同的菌株（纳豆杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌）中克隆了纳豆激酶的成熟肽基因，实现了在一些菌中进行表达如：枯草芽孢杆菌、酵母菌和大肠杆菌，并且通过柱层析分离纯化出高纯度的而且具有溶栓活性的纳豆激酶[9,10,11]。
同时，对纳豆和纳豆激酶的火热研究现状也在时刻提醒着我们，对于纳豆的“老祖宗”—盐豆子的研究现在还基本是一片空白，在盐豆子的研究方面关于食品安全和发酵微生物的改良等都有待我们去探索。
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