热胁迫下灵芝ros信号转导研究
：研究表明ROS既是有氧呼吸过程中产生的有毒性的副产物，也是一种信号分子。本实验以灵芝为实验材料对其进行不同时长的热击处理,研究其热表型及灵芝三萜产量变化，实验结果显示热击处理能够抑制灵芝生长,但也具有促进灵芝三萜的积累的显著作用，并且这种影响与热击后灵芝细胞内ROS的累积间存在相关性。这一研究也为进一步研究ROS在灵芝细胞内如何发挥信号转导功能打下了基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1 材料与方法4
1.1 材料 4
1.1.1菌种 4
1.1.2 培养基4
1.1.3试剂4
1.1.4溶液体系4
1.2 实验方法5
1.2.1 菌种平板培养5
1.2.2 热击处理5
1.2.3摇床培养5
1.2.4 生长情况及生物量测定5
1.2.5 灵芝三萜含量测定5
1.2.6 胞内ROS荧光检测6
1.2.7 ROS染色6
1.2.8 酶活力检测6
2 结果与分析6
2.1热击对G20生长情况的影响 6
2.2 热击后G20三萜产量变化 7
2.3 热击后G20菌丝内，ROS荧光分析及染色观察 8
2.4 G20菌丝内抗氧化酶活性测定 9
2.5 热击情况下，外源添加VC、NAC对G20三萜含量的影响 10
3结论11
3.1实验总结11
3.2展望11
致谢11
参考文献12
热胁迫下灵芝ROS信号转导研究
生物科学 赵晶
引言
引言
灵芝属担子菌纲、多孔菌科、灵芝属（Ganoderma），世界各地均有分布，以热带和亚热带地区为多，是我国的一种传统的名贵药材，其子实体、孢子粉、菌丝体均可入药。灵芝对人类健康的作用也日益受到国际上的重视，进一步开发灵芝的药用价值是当今药用菌研究的一个热点和前沿。灵芝
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
中存在多种次生代谢产物多样性形成机制，并且具有遗传转化体系成熟等特点，也使其成为研究药源生物代谢产物多样性的模式生物[1]。据药理实验证实，灵芝具有多种药理活性，其药理活性主要来源之一为次生代谢产物，例如灵芝三萜，灵芝多糖等[2]。灵芝三萜等次生代谢产物是在次生代谢过程中产生的小分子化合物。影响次生代谢产物的因素有很多，但大部分研究认为当营养充足，生长条件适宜时，生长速度快，但次生代谢产物数量少；而当处于环境胁迫下时，生长速度放慢，次生代谢产物产量有所提高。[3]
高温会影响灵芝的生长和产量，这种由高温造成的胁迫是环境胁迫的一种，其过程就是活细胞不断地感受、接收高温信号，并做出适当的生理响应来维持其生命活动进行的过程。[4]在这一被称为热胁迫的过程中存在着氧化胁迫现象，也就是环境胁迫导致的各种活性氧的大量产生。活性氧(reactive oxygen species, ROS)是生物体内一类活性含氧化合物的总称，主要包括超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢等。[5,6]
图1 ROS的产生和降解
有研究表明，在热胁迫中产生的ROS大多来自线粒体的氧化呼吸链[7,8]，并且能够参与到环境适应性响应等多种细胞代谢过程中。尽管ROS因性质活泼，容易与DNA、蛋白质、膜结构等发生氧化反应，使其受到氧化损伤，但ROS也是一种重要的信号分子，参与真菌生长发育、孢子萌发、致病性、胁迫应答、次级代谢调控等生理活动，根据文献，ROS在多种信号转导过程中都发挥了重要作用[9,10]，而一些以重要药用植物为研究对象的研究表明，活性氧也是影响次生代谢产物的产生和积累的因素之一，如过氧化氢可促进丹参悬浮细胞培养中丹参酚酸和丹参酮的生成，也可介导诱导子促进人参皂苷的合成[11]。
本课题对灵芝进行热胁迫处理，以研究热胁迫对其生理性状及对次生代谢产物灵芝三萜产量的影响，并结合在热胁迫下灵芝ROS的含量变化及各生理生化性状改变，研究ROS在灵芝生长及抗氧化胁迫中的功能及在灵芝细胞内信号转导中可能发挥的作用。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1菌种
灵芝菌株G20，保存于大学生命科学学院应用真菌实验室。
1．1．2培养基
液体培养基：1%麦芽糖，2%的葡萄糖，0.2%酵母提取物，0.2%蛋白胨，0.05% MgS047H20，0.05% KH2P04。115 ℃下灭菌 30 min后使用。
固体培养基：在液体培养基内加入2%琼脂，115 ℃下灭菌 30 min后使用。
1．1．3试剂
乙酸、盐酸、高氯酸、95%乙醇、无水乙醇、香兰素、醋酸钠、DCHFDA 探针、齐墩果酸。
1．1．4溶液体系
香草醛：将 5 g 香兰素加入 100 mL 冰醋酸溶解。
SOD酶活测定体系：总体积3 mL，其中含0.05 mol/LPB1.5 mL，130 mmol/L Met 0.3 ml ，750 μmol/L NBT0.3 mL， 100 μmol/L EDTANa0.3 mL，20 μmol/L核黄素0.3mL， 粗酶液0.05 mL，dH2O 0.25 mL，对照组以缓冲液代替酶液。
1．2实验方法
1．2．1 菌种平板培养
将经平板培养活化的菌种种接种至平板培养基上。在28 ℃下恒温培养
1．2．2 热击处理
根据实验需求将接种好的平板置于42 ℃培养箱内培养一定时间，之后置于28 ℃恒温培养。
1．2．3 摇床培养
200mlCYM液体培养基装入500 ml锥形瓶，灭菌。在菌落上打大小均一的孔，并接种于液体培养基。将锥形瓶放入 150 r/min，28 ℃摇床，培养 7 天。
1．2．4 生长情况及生物量测定
1．2．4．1 生长情况测定
将热击后的平板放入 28 ℃温箱培养，每隔12h测量一次菌落直径。
1．2．4．2 生物量测定
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1 材料与方法4
1.1 材料 4
1.1.1菌种 4
1.1.2 培养基4
1.1.3试剂4
1.1.4溶液体系4
1.2 实验方法5
1.2.1 菌种平板培养5
1.2.2 热击处理5
1.2.3摇床培养5
1.2.4 生长情况及生物量测定5
1.2.5 灵芝三萜含量测定5
1.2.6 胞内ROS荧光检测6
1.2.7 ROS染色6
1.2.8 酶活力检测6
2 结果与分析6
2.1热击对G20生长情况的影响 6
2.2 热击后G20三萜产量变化 7
2.3 热击后G20菌丝内，ROS荧光分析及染色观察 8
2.4 G20菌丝内抗氧化酶活性测定 9
2.5 热击情况下，外源添加VC、NAC对G20三萜含量的影响 10
3结论11
3.1实验总结11
3.2展望11
致谢11
参考文献12
热胁迫下灵芝ROS信号转导研究
生物科学 赵晶
引言
引言
灵芝属担子菌纲、多孔菌科、灵芝属（Ganoderma），世界各地均有分布，以热带和亚热带地区为多，是我国的一种传统的名贵药材，其子实体、孢子粉、菌丝体均可入药。灵芝对人类健康的作用也日益受到国际上的重视，进一步开发灵芝的药用价值是当今药用菌研究的一个热点和前沿。灵芝
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
中存在多种次生代谢产物多样性形成机制，并且具有遗传转化体系成熟等特点，也使其成为研究药源生物代谢产物多样性的模式生物[1]。据药理实验证实，灵芝具有多种药理活性，其药理活性主要来源之一为次生代谢产物，例如灵芝三萜，灵芝多糖等[2]。灵芝三萜等次生代谢产物是在次生代谢过程中产生的小分子化合物。影响次生代谢产物的因素有很多，但大部分研究认为当营养充足，生长条件适宜时，生长速度快，但次生代谢产物数量少；而当处于环境胁迫下时，生长速度放慢，次生代谢产物产量有所提高。[3]
高温会影响灵芝的生长和产量，这种由高温造成的胁迫是环境胁迫的一种，其过程就是活细胞不断地感受、接收高温信号，并做出适当的生理响应来维持其生命活动进行的过程。[4]在这一被称为热胁迫的过程中存在着氧化胁迫现象，也就是环境胁迫导致的各种活性氧的大量产生。活性氧(reactive oxygen species, ROS)是生物体内一类活性含氧化合物的总称，主要包括超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢等。[5,6]
图1 ROS的产生和降解
有研究表明，在热胁迫中产生的ROS大多来自线粒体的氧化呼吸链[7,8]，并且能够参与到环境适应性响应等多种细胞代谢过程中。尽管ROS因性质活泼，容易与DNA、蛋白质、膜结构等发生氧化反应，使其受到氧化损伤，但ROS也是一种重要的信号分子，参与真菌生长发育、孢子萌发、致病性、胁迫应答、次级代谢调控等生理活动，根据文献，ROS在多种信号转导过程中都发挥了重要作用[9,10]，而一些以重要药用植物为研究对象的研究表明，活性氧也是影响次生代谢产物的产生和积累的因素之一，如过氧化氢可促进丹参悬浮细胞培养中丹参酚酸和丹参酮的生成，也可介导诱导子促进人参皂苷的合成[11]。
本课题对灵芝进行热胁迫处理，以研究热胁迫对其生理性状及对次生代谢产物灵芝三萜产量的影响，并结合在热胁迫下灵芝ROS的含量变化及各生理生化性状改变，研究ROS在灵芝生长及抗氧化胁迫中的功能及在灵芝细胞内信号转导中可能发挥的作用。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1菌种
灵芝菌株G20，保存于大学生命科学学院应用真菌实验室。
1．1．2培养基
液体培养基：1%麦芽糖，2%的葡萄糖，0.2%酵母提取物，0.2%蛋白胨，0.05% MgS047H20，0.05% KH2P04。115 ℃下灭菌 30 min后使用。
固体培养基：在液体培养基内加入2%琼脂，115 ℃下灭菌 30 min后使用。
1．1．3试剂
乙酸、盐酸、高氯酸、95%乙醇、无水乙醇、香兰素、醋酸钠、DCHFDA 探针、齐墩果酸。
1．1．4溶液体系
香草醛：将 5 g 香兰素加入 100 mL 冰醋酸溶解。
SOD酶活测定体系：总体积3 mL，其中含0.05 mol/LPB1.5 mL，130 mmol/L Met 0.3 ml ，750 μmol/L NBT0.3 mL， 100 μmol/L EDTANa0.3 mL，20 μmol/L核黄素0.3mL， 粗酶液0.05 mL，dH2O 0.25 mL，对照组以缓冲液代替酶液。
1．2实验方法
1．2．1 菌种平板培养
将经平板培养活化的菌种种接种至平板培养基上。在28 ℃下恒温培养
1．2．2 热击处理
根据实验需求将接种好的平板置于42 ℃培养箱内培养一定时间，之后置于28 ℃恒温培养。
1．2．3 摇床培养
200mlCYM液体培养基装入500 ml锥形瓶，灭菌。在菌落上打大小均一的孔，并接种于液体培养基。将锥形瓶放入 150 r/min，28 ℃摇床，培养 7 天。
1．2．4 生长情况及生物量测定
1．2．4．1 生长情况测定
将热击后的平板放入 28 ℃温箱培养，每隔12h测量一次菌落直径。
1．2．4．2 生物量测定
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