sir基因在不同崇明拟异小杆线虫处理组中的差异表达
为了解Sir基因在线虫新种崇明拟异小杆线虫中的表达情况以及其与线虫共生菌之间的共生关系，进一步阐释Sir-2.1的作用机理，开发昆虫病原线虫及其共生细菌资源，本次建立了4种线虫细菌共生体系。提取4种不同细菌共生体系线虫组的RNA，反转录后选取9322（Sir）基因做实时定量QRT-PCR验证。9322（Sir）基因在4组崇明拟异小杆线虫中表达量不同，与共生菌s1共生的线虫组表达量明显下调，而与具有致病性的沙雷氏菌共生的线虫组表达量也较无毒性大肠杆菌共生组线虫低。这种表达量的明显差异可能与共生细菌分泌的活性物质的毒性与功能有关，也可能与细菌与线虫的共生方式有关，有待于进一步探索。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料、试剂和仪器 2
1.1.1 主要实验材料2
1.1.2 主要实验试剂2
1.1.3 主要实验仪器2
1.1.4 主要溶液配制2
1.2 无菌线虫制备 2
1.3 单菌线虫制备3
1.3.1细菌培养2
1.3.2 线虫培养2
1.4 RNA提取 3
1.5 RNA纯度及含量检测4
1.5.1 紫外分光光度检测4
1.5.2 非变性琼脂糖凝胶电泳检测4
1.6 RNA反转录cDNA4
1.7 荧光定量PCR4
1.7.1设计引物4
1.7.2 引物扩增验证4
1.7.3 荧光定量PCR4
1.8 数据分析 5
2 结果分析5
2.1 线虫培养结果5
2.1.1 无菌线虫培养结果5
2.1.2 单菌线虫培养结果5
2.2 RNA电泳与纯度鉴定6
2.2.1 紫外分光光度计检测RNA提取结果6
2.2.2 非变性琼脂糖凝胶电泳结果6
2.3 4种单菌组合反转录cDNA的18S定量引物扩增验证6
2.4 Sir基因定 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
量引物扩增验证 7
2.5 荧光定量PCR结果8
3 讨论 9
3.1 Sir基因在致病菌与非致病菌线虫组的不同表达9
3.2 Sir基因在共生致病菌与非共生致病菌线虫组的不同表达9
致谢10
参考文献10
图1 大肠杆菌OP50菌种涂布3
图2 显微镜下无菌崇明拟异小杆线虫5
图3 显微镜下单菌崇明拟异小杆线虫5
图4 线虫总RNA凝胶电泳图6
图5 4种处理的18S定量引物扩增验证7
图6 9322（Sir）定量引物验证7
图7 9322（Sir）基因与18s管家基因扩增曲线8
图8 9322（Sir）基因和18s管家基因溶解曲线8
图9 9322（Sir）基因在四个处理中的相对表达差异9
表1 18s与9322引物序列4
表2 96孔板定量涂板4
表3 RNA提取结果6
Sir基因在不同崇明拟异小杆线虫处理组中的差异表达
引言
Sir2（silence information regulator）是一种烟酰腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖型的组蛋白/非组蛋白去乙酰基化酶，广泛存在于从古细菌到哺乳动物中的多种动物中，具有高度保守的催化结构域[1]。不仅是重要的能量状态传感器，还在细胞抗胁迫方面发挥不可替代的作用，调控细胞以及生命体在饮食限制过环境胁迫条件下的生命进程[23]。
在侵染期昆虫病原线虫肠道中发现的线虫共生菌，是昆虫病原线虫的主要致病因子，兼性厌氧，不能从土壤中分离获得，分类属肠杆菌科（Enterobacteriaceae)[4]。昆虫病原线虫和其共生细菌能够产生毒素，许多研究相继发现杀虫蛋白（毒素）[5]，越来越多的研究者将目光关注到了昆虫病原线虫的共生菌资源，具进一步开发利用的价值。
研究发现Sir2在寿命调控中起重要作用，在线虫中过表达Sir的同源物sir2.1能够延长线虫50%的寿命[6]，已有研究试图敲除线虫sir2.1基因[7]，缺失型线虫的表型仍待进一步观察研究。人们发现热量限制(caloric?restriction)能使寿命延长，而在此过程中由sir基因表达产生的Sirtuin蛋白家族发挥了重要作用[810]。近年来的研究通过构建sir2.1缺失型秀丽线虫，发现秀丽线虫的衰老进程以及细胞凋亡程序都与sir2.1基因有十分密切的关系[11]，而sirtuins蛋白家族作用机制及目的基因与线虫共生菌之间的互作影响[12]尚未完全明确，仍在进一步探索当中。
近年来有研究表明由鼠伤寒肠道沙门氏菌（salmonella enterica typhimurium）、绿脓假单胞菌（pseudomonas aeruginosa PAO）等致病菌饲喂的线虫可形成线虫共生菌，均有共生菌的线虫在存活率，繁殖率，群体数量增长量以及个体寿命等方面都远低于由正常大肠杆菌（E.coli OP50）饲喂的线虫[12]。而Sir基因的表达是否在一定程度上受到了致病菌的影响有待进一步探究，这也是此次试验的主要目的之一。
1 材料与方法
1．1 实验材料、试剂和仪器
1．1．1 主要实验材料 野生型崇明拟异小杆线虫、大肠杆菌OP50、沙雷氏菌186,187，S1。
1.1.2 主要实验试剂 Trizol（Invitrogen公司）、氯仿（分析纯）、异丙醇（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、37% 甲醛水溶液、100% 甘油、甲酰胺（分析纯）、二水合乙二胺四乙酸二钠（分析纯）、Tris饱和酚（Biosntech公司）、溴百里酚蓝（分析纯）、红四氮唑（分析纯）、溴酚蓝（分析纯）、无水乙酸钠（NaAc）（分析纯）、硫柳汞钠（分析纯）、10% 次氯酸钠溶液（分析纯）、DEPC（Ameresco公司）、MOPS（BioTime公司）、琼脂糖（agarose）（BIOWEST公司）、琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN公司）、DNaseI（RNase Free）试剂盒（CWBIO公司）、SuperQuick RT MasterMix（For Realtime PCR）试剂盒（CWBIO公司）、UltraSYBR Mixture（With ROX）试剂盒（CWBIO公司），Illumina gene expression sample prep kit试剂盒（Illumina公司）、氢氧化钠（分析纯）、氢氧化钾（分析纯）、胰蛋白胨、琼脂、酵母粉、氯化钙（分析纯）、氯化钠（分析纯）、胆固醇（分析纯）、硫酸镁（分析纯）、磷酸二氢钾（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯）、柠檬酸钠、次氯酸钠溶液等。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料、试剂和仪器 2
1.1.1 主要实验材料2
1.1.2 主要实验试剂2
1.1.3 主要实验仪器2
1.1.4 主要溶液配制2
1.2 无菌线虫制备 2
1.3 单菌线虫制备3
1.3.1细菌培养2
1.3.2 线虫培养2
1.4 RNA提取 3
1.5 RNA纯度及含量检测4
1.5.1 紫外分光光度检测4
1.5.2 非变性琼脂糖凝胶电泳检测4
1.6 RNA反转录cDNA4
1.7 荧光定量PCR4
1.7.1设计引物4
1.7.2 引物扩增验证4
1.7.3 荧光定量PCR4
1.8 数据分析 5
2 结果分析5
2.1 线虫培养结果5
2.1.1 无菌线虫培养结果5
2.1.2 单菌线虫培养结果5
2.2 RNA电泳与纯度鉴定6
2.2.1 紫外分光光度计检测RNA提取结果6
2.2.2 非变性琼脂糖凝胶电泳结果6
2.3 4种单菌组合反转录cDNA的18S定量引物扩增验证6
2.4 Sir基因定 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
量引物扩增验证 7
2.5 荧光定量PCR结果8
3 讨论 9
3.1 Sir基因在致病菌与非致病菌线虫组的不同表达9
3.2 Sir基因在共生致病菌与非共生致病菌线虫组的不同表达9
致谢10
参考文献10
图1 大肠杆菌OP50菌种涂布3
图2 显微镜下无菌崇明拟异小杆线虫5
图3 显微镜下单菌崇明拟异小杆线虫5
图4 线虫总RNA凝胶电泳图6
图5 4种处理的18S定量引物扩增验证7
图6 9322（Sir）定量引物验证7
图7 9322（Sir）基因与18s管家基因扩增曲线8
图8 9322（Sir）基因和18s管家基因溶解曲线8
图9 9322（Sir）基因在四个处理中的相对表达差异9
表1 18s与9322引物序列4
表2 96孔板定量涂板4
表3 RNA提取结果6
Sir基因在不同崇明拟异小杆线虫处理组中的差异表达
引言
Sir2（silence information regulator）是一种烟酰腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖型的组蛋白/非组蛋白去乙酰基化酶，广泛存在于从古细菌到哺乳动物中的多种动物中，具有高度保守的催化结构域[1]。不仅是重要的能量状态传感器，还在细胞抗胁迫方面发挥不可替代的作用，调控细胞以及生命体在饮食限制过环境胁迫条件下的生命进程[23]。
在侵染期昆虫病原线虫肠道中发现的线虫共生菌，是昆虫病原线虫的主要致病因子，兼性厌氧，不能从土壤中分离获得，分类属肠杆菌科（Enterobacteriaceae)[4]。昆虫病原线虫和其共生细菌能够产生毒素，许多研究相继发现杀虫蛋白（毒素）[5]，越来越多的研究者将目光关注到了昆虫病原线虫的共生菌资源，具进一步开发利用的价值。
研究发现Sir2在寿命调控中起重要作用，在线虫中过表达Sir的同源物sir2.1能够延长线虫50%的寿命[6]，已有研究试图敲除线虫sir2.1基因[7]，缺失型线虫的表型仍待进一步观察研究。人们发现热量限制(caloric?restriction)能使寿命延长，而在此过程中由sir基因表达产生的Sirtuin蛋白家族发挥了重要作用[810]。近年来的研究通过构建sir2.1缺失型秀丽线虫，发现秀丽线虫的衰老进程以及细胞凋亡程序都与sir2.1基因有十分密切的关系[11]，而sirtuins蛋白家族作用机制及目的基因与线虫共生菌之间的互作影响[12]尚未完全明确，仍在进一步探索当中。
近年来有研究表明由鼠伤寒肠道沙门氏菌（salmonella enterica typhimurium）、绿脓假单胞菌（pseudomonas aeruginosa PAO）等致病菌饲喂的线虫可形成线虫共生菌，均有共生菌的线虫在存活率，繁殖率，群体数量增长量以及个体寿命等方面都远低于由正常大肠杆菌（E.coli OP50）饲喂的线虫[12]。而Sir基因的表达是否在一定程度上受到了致病菌的影响有待进一步探究，这也是此次试验的主要目的之一。
1 材料与方法
1．1 实验材料、试剂和仪器
1．1．1 主要实验材料 野生型崇明拟异小杆线虫、大肠杆菌OP50、沙雷氏菌186,187，S1。
1.1.2 主要实验试剂 Trizol（Invitrogen公司）、氯仿（分析纯）、异丙醇（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、37% 甲醛水溶液、100% 甘油、甲酰胺（分析纯）、二水合乙二胺四乙酸二钠（分析纯）、Tris饱和酚（Biosntech公司）、溴百里酚蓝（分析纯）、红四氮唑（分析纯）、溴酚蓝（分析纯）、无水乙酸钠（NaAc）（分析纯）、硫柳汞钠（分析纯）、10% 次氯酸钠溶液（分析纯）、DEPC（Ameresco公司）、MOPS（BioTime公司）、琼脂糖（agarose）（BIOWEST公司）、琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN公司）、DNaseI（RNase Free）试剂盒（CWBIO公司）、SuperQuick RT MasterMix（For Realtime PCR）试剂盒（CWBIO公司）、UltraSYBR Mixture（With ROX）试剂盒（CWBIO公司），Illumina gene expression sample prep kit试剂盒（Illumina公司）、氢氧化钠（分析纯）、氢氧化钾（分析纯）、胰蛋白胨、琼脂、酵母粉、氯化钙（分析纯）、氯化钠（分析纯）、胆固醇（分析纯）、硫酸镁（分析纯）、磷酸二氢钾（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯）、柠檬酸钠、次氯酸钠溶液等。
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