某地区几种植原体病害的鉴定与植原体分类研究
本文从南京中山陵地区采集到具有疑似植原体感染症状的国槐、长春花、野茼蒿等植物样本，分别对这些样本进行植物总DNA提取，再依据植原体的16S rDNA的通用引物，以从样本叶脉中提取所得DNA为模板，进行直接PCR扩增（R16mF2/R16mR1）和巢式PCR扩增（R16F2n/R16R2），对扩增所得片段进行核酸序列测序和同源性分析。结果表明，采集所得的三种样本植物均被植原体感染。经系统发育学分析发现，国槐丛枝植原体属于16S rⅤ-B组，长春花变叶病植原体属于16S rⅠ-B组，野茼蒿变叶病植原体属于16S rⅡ-A组。最后对这些寄生在不同植物上的植原体进行相关命名。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.2样品DNA提取 2
1.3直接PCR与巢式PCR3
1.3.1直接PCR扩增3
1.3.2巢式PCR(NestedPCR)扩增3
1.3.3电泳3
1.4 PCR产物回收与克隆4
1.5目的片段的测序与序列同源性比较4
2 结果与分析 4
2.1感病植株症状4
2.2样本植株植原体16S rDNA的PCR扩增结果 5
2.3样本植株中植原体16S rDNA的序列同源性比对及系统发育学分析5
3讨论 6
致谢7
参考文献7
南京地区几种植原体病害的鉴定与植原体分类研究
引言
植原体(phytoplasma)，原称类菌原体（简称MLO），由日本学者土居养二发现于20世纪60年代末，发现初始仅能确定其是一类与细菌相似、但无细胞壁的原核生物[1]。后经研究发现植原体分布十分广泛，多存在于植物韧皮和昆虫体内，传播途径较单一，一般由携带植原体的昆虫取食植物韧皮部后互相传播，植物感染植原体后会出现一些病害症状如丛枝、黄化、变叶病等，导致感染植株枯萎死亡并且会在该种群中迅速传染，这对农作物生产和林业发展具有重要危害[2]。因此，对植原体病害的鉴定以及进行一个系统全面的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
种类分类显得尤为重要。
国槐（Sophora japonica），又叫槐树，原产于我国境内，是一种高大的落叶豆科乔木，广泛分布于中国北部一带。其具有喜光且稍耐荫的特点，在寒冷气候中也能生存，根系十分发达，故适应能力很强，即使在某些盐碱地也能存活下来[3]，所以在国内国槐经常被用作良好的行道树。因此，对国槐进行相关的植原体病害研究就显得尤为重要了。在南京地区也发现了具有病害症状的国槐，通过对病原体的进一步确定和分类，可以为防治国槐病害提供相关理论帮助。
长春花（Catharanthus roseus），人们又叫它金盏草、四时春等，是一种小型的亚灌木，由茎以上至叶被有微毛。长春花不仅是一种美丽的观赏性花卉，也是一种重要的中草药植物，在中草药学上它具有多种疗效如止血消肿、去除炎症、镇定安眠、通便利尿等，在亚热带地区更是作为一种经济型作物种植。但研究发现长春花极容易被植原体所感染[4]，导致植株发育不正常，故在实验室中我们常把长春花作为植原体病原的富集植物。以长春花作为植原体研究的模式植物，不仅为我们提供了良好的实验才俩，还有利我们更深入了解植原体病害。
野茼蒿（Gynura crepidioides），在南方地区人们又把它叫做革命菜、凉干菜、昭和草等。在植物学分类上，一般将其归为菊科野茼蒿属，是一种一年生直立草本植物，原产地在热带非洲，目前广泛分布于江苏、江西、浙江等地，在南京地区也十分常见。由于其具有适应力强、繁殖快等特点，成为一种农业上常见的杂草，在路边田野间随处可见，对农作物生长有一定的危害性[5]。通过研究野茼蒿的植原体病害情况，我们可以从中找出治理该杂草的相关方法，促进当地农业发展。目前，国内外已有相关野茼蒿植原体病害的报道。
由于植原体始终不能在体外进行人工培养, 因而无法根据传统的细菌分类学方法确定其分类地位，这使得植原体研究和所致病害防治受到了阻碍[6]。从20世纪80年代末开始，植原体分类研究引入了分子生物学技术，这使得近年来植原体分类研究取得了巨大进展。
很长时间以来，科学界针对植原体的检测主要局限于依靠观察植原体的相关生物学特性、制定一些化学反应方法、借用电子显微镜技术直接观察或和抗生素敏感性相结合等方法，不难看出以上所提到的检测方法不仅会浪费大量的人力物力，而且其科研上的灵敏度、可靠性和特异性等方面也存在着很大争议。本课题采用核酸分子杂交和PCR等技术对植原体进行鉴定分类研究，具有耗时短、成本低、操作简易、准确性高等特点，对于快速准确鉴定常见植原体有很大帮助，可以广泛推广到日常实验中。
本研究从南京当地具有病害症状的国槐、长春花、野茼蒿中采样，通过植物ＤＮＡ提取、直接PCR扩增、巢式PCR扩增、测序、同源性分析等技术手段，对这几种常见的植原体病害进行鉴定并确定其系统发育学地位，这对找出植物病害原因从而制定相应的救治方法具有很大的理论帮助。
1 材料与方法
1．1 材料
表现丛枝症状的国槐样本采自南京中山植物园，表现变叶症状的长春花样本采自南京中山植物园，表现典型变叶症状的野茼蒿样本采自南京下马坊草坪。
1．2 样本DNA提取
具体实验步骤参照Lee等[7]的提取方法，其实验室基本操作步骤是：样品组织充分研磨→加入提取缓冲液→抽提→沉淀DNA。
该种提取方法也被叫做CTAB法[8](cetyl triethyammonium bromide，十六烷基三乙基溴化铵)：
将现配好的CTAB提取缓冲液（其中包含2% CTAB、100 mmol/L TrisHCl，pH8.0、1.4 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA、0.2%(v/v)β巯基乙醇）在60℃温箱中预热几分钟。
用称量天平称取大约0.5 g的植物新鲜组织（本研究采用叶脉），剪碎，在液氮中充分研磨。
用移液枪加入1.0 mL提取缓冲液，震荡充分混匀后，在60℃温箱中保温3060 min，期间取出轻摇23次。
加入相当于原溶液0.5倍体积的苯酚，轻摇混匀5 min。
再加入0.5倍体积的氯仿/异戊醇，轻摇混匀5min，将离心机设定12,000 r/min离心10 min。
用移液枪小心吸出上清（尽量吸出上清避免吸入沉淀），在上清液中加入1倍体积冷的异丙醇，沉淀DNA。
再12,000 r/min离心15 min，沉淀DNA，倒掉上清，用75%乙醇洗涤沉淀。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.2样品DNA提取 2
1.3直接PCR与巢式PCR3
1.3.1直接PCR扩增3
1.3.2巢式PCR(NestedPCR)扩增3
1.3.3电泳3
1.4 PCR产物回收与克隆4
1.5目的片段的测序与序列同源性比较4
2 结果与分析 4
2.1感病植株症状4
2.2样本植株植原体16S rDNA的PCR扩增结果 5
2.3样本植株中植原体16S rDNA的序列同源性比对及系统发育学分析5
3讨论 6
致谢7
参考文献7
南京地区几种植原体病害的鉴定与植原体分类研究
引言
植原体(phytoplasma)，原称类菌原体（简称MLO），由日本学者土居养二发现于20世纪60年代末，发现初始仅能确定其是一类与细菌相似、但无细胞壁的原核生物[1]。后经研究发现植原体分布十分广泛，多存在于植物韧皮和昆虫体内，传播途径较单一，一般由携带植原体的昆虫取食植物韧皮部后互相传播，植物感染植原体后会出现一些病害症状如丛枝、黄化、变叶病等，导致感染植株枯萎死亡并且会在该种群中迅速传染，这对农作物生产和林业发展具有重要危害[2]。因此，对植原体病害的鉴定以及进行一个系统全面的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
种类分类显得尤为重要。
国槐（Sophora japonica），又叫槐树，原产于我国境内，是一种高大的落叶豆科乔木，广泛分布于中国北部一带。其具有喜光且稍耐荫的特点，在寒冷气候中也能生存，根系十分发达，故适应能力很强，即使在某些盐碱地也能存活下来[3]，所以在国内国槐经常被用作良好的行道树。因此，对国槐进行相关的植原体病害研究就显得尤为重要了。在南京地区也发现了具有病害症状的国槐，通过对病原体的进一步确定和分类，可以为防治国槐病害提供相关理论帮助。
长春花（Catharanthus roseus），人们又叫它金盏草、四时春等，是一种小型的亚灌木，由茎以上至叶被有微毛。长春花不仅是一种美丽的观赏性花卉，也是一种重要的中草药植物，在中草药学上它具有多种疗效如止血消肿、去除炎症、镇定安眠、通便利尿等，在亚热带地区更是作为一种经济型作物种植。但研究发现长春花极容易被植原体所感染[4]，导致植株发育不正常，故在实验室中我们常把长春花作为植原体病原的富集植物。以长春花作为植原体研究的模式植物，不仅为我们提供了良好的实验才俩，还有利我们更深入了解植原体病害。
野茼蒿（Gynura crepidioides），在南方地区人们又把它叫做革命菜、凉干菜、昭和草等。在植物学分类上，一般将其归为菊科野茼蒿属，是一种一年生直立草本植物，原产地在热带非洲，目前广泛分布于江苏、江西、浙江等地，在南京地区也十分常见。由于其具有适应力强、繁殖快等特点，成为一种农业上常见的杂草，在路边田野间随处可见，对农作物生长有一定的危害性[5]。通过研究野茼蒿的植原体病害情况，我们可以从中找出治理该杂草的相关方法，促进当地农业发展。目前，国内外已有相关野茼蒿植原体病害的报道。
由于植原体始终不能在体外进行人工培养, 因而无法根据传统的细菌分类学方法确定其分类地位，这使得植原体研究和所致病害防治受到了阻碍[6]。从20世纪80年代末开始，植原体分类研究引入了分子生物学技术，这使得近年来植原体分类研究取得了巨大进展。
很长时间以来，科学界针对植原体的检测主要局限于依靠观察植原体的相关生物学特性、制定一些化学反应方法、借用电子显微镜技术直接观察或和抗生素敏感性相结合等方法，不难看出以上所提到的检测方法不仅会浪费大量的人力物力，而且其科研上的灵敏度、可靠性和特异性等方面也存在着很大争议。本课题采用核酸分子杂交和PCR等技术对植原体进行鉴定分类研究，具有耗时短、成本低、操作简易、准确性高等特点，对于快速准确鉴定常见植原体有很大帮助，可以广泛推广到日常实验中。
本研究从南京当地具有病害症状的国槐、长春花、野茼蒿中采样，通过植物ＤＮＡ提取、直接PCR扩增、巢式PCR扩增、测序、同源性分析等技术手段，对这几种常见的植原体病害进行鉴定并确定其系统发育学地位，这对找出植物病害原因从而制定相应的救治方法具有很大的理论帮助。
1 材料与方法
1．1 材料
表现丛枝症状的国槐样本采自南京中山植物园，表现变叶症状的长春花样本采自南京中山植物园，表现典型变叶症状的野茼蒿样本采自南京下马坊草坪。
1．2 样本DNA提取
具体实验步骤参照Lee等[7]的提取方法，其实验室基本操作步骤是：样品组织充分研磨→加入提取缓冲液→抽提→沉淀DNA。
该种提取方法也被叫做CTAB法[8](cetyl triethyammonium bromide，十六烷基三乙基溴化铵)：
将现配好的CTAB提取缓冲液（其中包含2% CTAB、100 mmol/L TrisHCl，pH8.0、1.4 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA、0.2%(v/v)β巯基乙醇）在60℃温箱中预热几分钟。
用称量天平称取大约0.5 g的植物新鲜组织（本研究采用叶脉），剪碎，在液氮中充分研磨。
用移液枪加入1.0 mL提取缓冲液，震荡充分混匀后，在60℃温箱中保温3060 min，期间取出轻摇23次。
加入相当于原溶液0.5倍体积的苯酚，轻摇混匀5 min。
再加入0.5倍体积的氯仿/异戊醇，轻摇混匀5min，将离心机设定12,000 r/min离心10 min。
用移液枪小心吸出上清（尽量吸出上清避免吸入沉淀），在上清液中加入1倍体积冷的异丙醇，沉淀DNA。
再12,000 r/min离心15 min，沉淀DNA，倒掉上清，用75%乙醇洗涤沉淀。
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