杂草稻rcrd基因的crisprcas9突变杂草稻rcrd基因的crisprcas9突变(附件)【字数：10865】
杂草稻（Oryza sativa f.spontanea）是一种具有恶性杂草特性的田间水稻，其重要识别特征之一是红色果皮,红色果皮是由Rc、Rd基因调控。本研究采用农杆菌介导的CRISPRR-Cas9遗传转化体系，对杂草稻的Rc、Rd基因进行了基因编辑研究。将重组质粒导入杂草稻成熟种子形成的愈伤组织中，通过四次筛选，获得了Rc、Rd基因过表达和被敲除的再生杂草稻植株。为下一步深入探究Rc、Rd基因对杂草稻适合度的影响奠定了基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法5
1.1 材料 5
1.1.1 植物材料5
1.1.2 质粒5
1.1.3 培养基5
1.1.4 主要试剂及抗生素5
1.1.5 主要试验仪器5
1.2 方法 5
1.2.1 种子脱壳3
1.2.2 种子消毒3
1.2.3 种子清洗3
1.2.4接种3
1.2.5 种子脱壳3
1.2.6 种子消毒3
1.2.7侵染5
1.2.8筛选与再生6
1.2.9 炼苗6
1.2.10 测序6
2 结果与分析6
2.1愈伤培养与继代7
2.1.1 愈伤组织的形成7
2.1.2 愈伤组织的继代培养7
2.2 筛选与分化7
2.2.1 三次筛选7
2.2.2 分化及生根培养10
2.2.3 炼苗、盆栽10
2.2.4测序11
3 讨论 11
致谢12
参考文献12
杂草稻Rc/Rd基因的CRISPRCas9突变
引言
引言杂草稻（Oryza sativa f. spontanea）是一种具有杂草特性的水稻，又称野稻、杂稻、再生稻。据联合国粮食与农业组织（FAO）的估计，杂草稻已经成为世界稻田的三大草害之一，其危害仅次于稗草（Echin *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
ochloa curusgalli）、千金子（Leptochloa chinensis (L.) Nees）【1】。杂草稻广泛分布于亚洲等50多个国家地区的水稻种植区，对水稻生产带来了不同的影响，部分地区杂草稻的发生已经严重影响到水稻产量和粮食的安全。据不完全统计，我国近年已经有超过333万hm2的稻田遭受杂草稻的危害，造成的水稻产量损失约34亿kg。在泰国，由于杂草稻的危害所带来的水稻减产高达100％【2】。
早在1846年美国就已有发现，当地居民因其果皮呈红褐色而称其为“红稻”（Red Rice）【3】。其外形和水稻极为相似，植株一般比较高大，田间常常很难进行鉴别。但由于杂草稻更具旺盛的生长能力，出穗比栽培稻早，边成熟边落粒，往往容易成为田间的恶性杂草【4】。一旦水稻田中出现杂草稻植株便很难根除，最为严重的是杂草稻的入侵可使得收获的正常稻米中含有少量的红褐色果皮的杂草稻稻米，从而降低稻米的商业价值，给农民造成巨大的经济损失；由于杂草稻植株高、出穗早等因素，致使稻田的栽培稻可能被杂草稻完全覆盖，据统计一旦杂草稻入侵率达到40%及以上时，可严重影响水稻的收获，甚至可能导致当年颗粒无收【5】。
与此同时，研究人员发现杂草稻由于长期处于野外环境中，在自然灾害和恶劣的不良环境的选择【6】，他们具有不少的优良性状。赵娜等【7】对辽宁省47个杂草稻品系进行了盐胁迫处理发现他们芽长的生长受盐浓度影响较小；丁国华等【8】采用盆栽试验发现在苗期相比于栽培稻，杂草稻具有较强的抗旱性；邹德堂等【9】认为黑龙江的杂草稻比普通的水稻更耐低温。陈惠哲等【10】发现丹东杂草稻种子能适应较严重的冻害；张丽丽等【11】实验证明，杂草稻（WR 0312）的吸胀种子发芽率和发芽势受盐碱胁迫下影响较小；高男等【12】认为北方杂草稻具有更强的耐低温发芽特性；李茂柏等【13】研究证明上海杂草稻种子相比栽培稻更易长久保存并保证一定的发芽率；Sun等【14】对142个杂草稻进行分析得出，Rc、Bh4、Phrl 基因对杂草稻种子的寿命影响显著。由于杂草稻与栽培稻的亲缘关系较近，且具有较好的亲和性，因此杂草稻的优良性状更易于在栽培稻的育种中直接利用，我们可以利用杂草稻的这些优良性状，进行水稻遗传改良和抗性育。
遗传转化技术是通过载体、化学或物理的方法把目的基因转入宿主中，经过选择与分离筛选所需要性状，从而获得特定抗性基因、品质优良、产量高的新的植物品种的一种技术。水稻遗传转化技术术的突破发生在 20 世纪 80 年代，科学家通过形成原生质体体系将外源基因导入到水稻中，形成水稻转基因的“直接转化法”【15】。1986 年，Baba等将农杆菌原生质球与水稻原生质体通过 PEG 法介导融合，获得的水稻愈伤组织能够在不含激素的基础培养基上生长，而且有些愈伤组织还能合成胭脂碱。这种方法被称为“PEG 介导法”，后来又形成“电激法”、“脂质体介导法”、“基因枪法”等水稻转基因方法，但这些方法存在诸多缺点，比如实验成本高、转化的成功率低，插入基因在后代中易丢失等【16】。
80年代末期，根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）转化细胞或转基因植株方法出现，将目的基因插入到经过改造的TDNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。因为根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段TDNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将TDNA插入到植物基因组中【17】。但由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，因此它在单子叶植物上的遗传转化研究落后于双子叶植物。直到20世纪90年代，Chan等【18】获得了根瘤农杆菌介导的转基因植株，并发表文献提供了部分分子层面的证据。1994年，Hiei【19】等首次实现对粳稻的高频转化，转化率达到 28.6%，并从分子水平和遗传学角度阐述外源基因的稳定插入、表达和遗传的原理。随着对农杆菌侵染机制的了解和转化技术的提升，科研人员选取更合适的部位（如幼胚）做为外植体；在遗传转化体系中添加乙酰丁香酮(AS)激活 Vir 活基因；使用广谱为农杆菌菌株；选用更有效的启动子；使用潮霉素作为筛选剂等，逐步提高根瘤农杆菌对水稻等单子叶植物的转化效率，从而实现了根癌农杆菌对粳稻的高频转化，转化率一般在30%以上，但根瘤农杆菌对籼稻的转化频率仅10%左右。直到黄健秋等【20】建立了一套根癌农杆菌介导的水稻高效转化和转基因植株的高频再生系统，实现了籼稻转化植株产生率37.8%和粳稻的产生率69.0%。至此，农杆菌介导的水稻遗传转化技术成熟，实现了农杆菌介导水稻植株的高频转化，也为杂草稻转基因的研究奠定了基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法5
1.1 材料 5
1.1.1 植物材料5
1.1.2 质粒5
1.1.3 培养基5
1.1.4 主要试剂及抗生素5
1.1.5 主要试验仪器5
1.2 方法 5
1.2.1 种子脱壳3
1.2.2 种子消毒3
1.2.3 种子清洗3
1.2.4接种3
1.2.5 种子脱壳3
1.2.6 种子消毒3
1.2.7侵染5
1.2.8筛选与再生6
1.2.9 炼苗6
1.2.10 测序6
2 结果与分析6
2.1愈伤培养与继代7
2.1.1 愈伤组织的形成7
2.1.2 愈伤组织的继代培养7
2.2 筛选与分化7
2.2.1 三次筛选7
2.2.2 分化及生根培养10
2.2.3 炼苗、盆栽10
2.2.4测序11
3 讨论 11
致谢12
参考文献12
杂草稻Rc/Rd基因的CRISPRCas9突变
引言
引言杂草稻（Oryza sativa f. spontanea）是一种具有杂草特性的水稻，又称野稻、杂稻、再生稻。据联合国粮食与农业组织（FAO）的估计，杂草稻已经成为世界稻田的三大草害之一，其危害仅次于稗草（Echin *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
ochloa curusgalli）、千金子（Leptochloa chinensis (L.) Nees）【1】。杂草稻广泛分布于亚洲等50多个国家地区的水稻种植区，对水稻生产带来了不同的影响，部分地区杂草稻的发生已经严重影响到水稻产量和粮食的安全。据不完全统计，我国近年已经有超过333万hm2的稻田遭受杂草稻的危害，造成的水稻产量损失约34亿kg。在泰国，由于杂草稻的危害所带来的水稻减产高达100％【2】。
早在1846年美国就已有发现，当地居民因其果皮呈红褐色而称其为“红稻”（Red Rice）【3】。其外形和水稻极为相似，植株一般比较高大，田间常常很难进行鉴别。但由于杂草稻更具旺盛的生长能力，出穗比栽培稻早，边成熟边落粒，往往容易成为田间的恶性杂草【4】。一旦水稻田中出现杂草稻植株便很难根除，最为严重的是杂草稻的入侵可使得收获的正常稻米中含有少量的红褐色果皮的杂草稻稻米，从而降低稻米的商业价值，给农民造成巨大的经济损失；由于杂草稻植株高、出穗早等因素，致使稻田的栽培稻可能被杂草稻完全覆盖，据统计一旦杂草稻入侵率达到40%及以上时，可严重影响水稻的收获，甚至可能导致当年颗粒无收【5】。
与此同时，研究人员发现杂草稻由于长期处于野外环境中，在自然灾害和恶劣的不良环境的选择【6】，他们具有不少的优良性状。赵娜等【7】对辽宁省47个杂草稻品系进行了盐胁迫处理发现他们芽长的生长受盐浓度影响较小；丁国华等【8】采用盆栽试验发现在苗期相比于栽培稻，杂草稻具有较强的抗旱性；邹德堂等【9】认为黑龙江的杂草稻比普通的水稻更耐低温。陈惠哲等【10】发现丹东杂草稻种子能适应较严重的冻害；张丽丽等【11】实验证明，杂草稻（WR 0312）的吸胀种子发芽率和发芽势受盐碱胁迫下影响较小；高男等【12】认为北方杂草稻具有更强的耐低温发芽特性；李茂柏等【13】研究证明上海杂草稻种子相比栽培稻更易长久保存并保证一定的发芽率；Sun等【14】对142个杂草稻进行分析得出，Rc、Bh4、Phrl 基因对杂草稻种子的寿命影响显著。由于杂草稻与栽培稻的亲缘关系较近，且具有较好的亲和性，因此杂草稻的优良性状更易于在栽培稻的育种中直接利用，我们可以利用杂草稻的这些优良性状，进行水稻遗传改良和抗性育。
遗传转化技术是通过载体、化学或物理的方法把目的基因转入宿主中，经过选择与分离筛选所需要性状，从而获得特定抗性基因、品质优良、产量高的新的植物品种的一种技术。水稻遗传转化技术术的突破发生在 20 世纪 80 年代，科学家通过形成原生质体体系将外源基因导入到水稻中，形成水稻转基因的“直接转化法”【15】。1986 年，Baba等将农杆菌原生质球与水稻原生质体通过 PEG 法介导融合，获得的水稻愈伤组织能够在不含激素的基础培养基上生长，而且有些愈伤组织还能合成胭脂碱。这种方法被称为“PEG 介导法”，后来又形成“电激法”、“脂质体介导法”、“基因枪法”等水稻转基因方法，但这些方法存在诸多缺点，比如实验成本高、转化的成功率低，插入基因在后代中易丢失等【16】。
80年代末期，根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）转化细胞或转基因植株方法出现，将目的基因插入到经过改造的TDNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。因为根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段TDNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将TDNA插入到植物基因组中【17】。但由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，因此它在单子叶植物上的遗传转化研究落后于双子叶植物。直到20世纪90年代，Chan等【18】获得了根瘤农杆菌介导的转基因植株，并发表文献提供了部分分子层面的证据。1994年，Hiei【19】等首次实现对粳稻的高频转化，转化率达到 28.6%，并从分子水平和遗传学角度阐述外源基因的稳定插入、表达和遗传的原理。随着对农杆菌侵染机制的了解和转化技术的提升，科研人员选取更合适的部位（如幼胚）做为外植体；在遗传转化体系中添加乙酰丁香酮(AS)激活 Vir 活基因；使用广谱为农杆菌菌株；选用更有效的启动子；使用潮霉素作为筛选剂等，逐步提高根瘤农杆菌对水稻等单子叶植物的转化效率，从而实现了根癌农杆菌对粳稻的高频转化，转化率一般在30%以上，但根瘤农杆菌对籼稻的转化频率仅10%左右。直到黄健秋等【20】建立了一套根癌农杆菌介导的水稻高效转化和转基因植株的高频再生系统，实现了籼稻转化植株产生率37.8%和粳稻的产生率69.0%。至此，农杆菌介导的水稻遗传转化技术成熟，实现了农杆菌介导水稻植株的高频转化，也为杂草稻转基因的研究奠定了基础。
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