转基因甘蓝型油菜c染色体基因向其与野芥菜回交后代（bc1f5bc2f4bc3f3）的渗入
：本文以抗草甘膦和抗草丁膦转基因油菜（Brassica napus）与野芥菜（wild B. juncea）的正反回交1代子4代、回交2代子3代以及回交3代子2代为实验材料，通过SSR手段，研究油菜中的C-染色体基因特异片段向其回交后代中的渗入情况。研究结果表明，2种转基因油菜的C-染色体基因特异片段在同种回交后代的不同个体的遗传规律不同。各回交后代中，抗草丁膦转基因油菜的C染色体基因特异片段向其回交后代渗入的频率要高于抗草甘膦转基因油菜。抗草甘膦和抗草丁膦油菜的C-染色体基因特异片段向其回交后代渗入的频率，在回交1代子4代分别为正向：10.46%和17.12%、反向：9.63%和12.04%；在回交2代子3代中分别为正向：8.04%和21.04%、反向：12.17%和28.24%；在回交3代子2代中分别为正向：12.41%和14.90%、反向：10.38%和13.69%。在正反回交1代子4代中，两种转基因油菜的C-染色体基因特异片段渗入的频率相差6.66%和2.77%，在正反向回交2代子3代中，相差13%和16.07%。在正向回交3代子3代中， 相差2.49%和3.31%。以上研究结果将为抗除草剂转基因油菜的安全性评估的深入开展提供依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 研究材料与方法3
1.1 实验材料 3
1.2 实验选用引物 3
2 实验方法4
2.1 DNA提取4
2.2 PCR反应4
2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳4
2.3.1 聚丙烯酰胺凝胶的配置4
2.3.2 电泳5
2.3.3 银染及显色5
2.4 数据统计5
3 结果与分析5
3.1 17对C染色体基因特异片段在回交1代子4代中被检测到的情况5
3.2 17对C染色体基因特异片段在回交2代子3代中被检测到的情况8
3.3 17对C染色体基因特异片段在回交3代子2代中被检测到的情况10
4 讨论12
致谢13
参考文献14
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/> 转基因甘蓝型油菜C染色体基因向其与野芥菜回交后代（BC1F5，BC2F4，BC3F3)的渗入
引言
芸薹属（Brassica）是十字花科植物中最为重要的一个属，包含许多蔬菜、油料及饲料等经济上有重要价值的作物。关于芸薹属内物种的亲缘关系，韩国学者禹长春在1936年提出了禹氏三角[1]，他认为芸薹（B.campestris，2n=20，AA）、黑芥（B. Nigra，2n=16，BB）和甘蓝（B. Oleracea，2n=18，CC）为芸薹属的基本种，在自然条件下，基本种之间通过杂交，得到芥菜（B. Juncea，2n=36，AABB）、甘蓝型油菜（B. Napus，2n=38，AACC）和埃塞俄比亚芥（B. Carinata，2n=34，BBCC）3个异源四倍体物种。其后，禹氏三角被很多科学家所证明。其中的甘蓝型油菜是三大类型油菜之一，具有角果长、种子大、无辛辣味、分枝数及结角数多、耐肥、产量和含油量高等其它类型油菜所缺少的优点。目前在各种油菜类型中以它的栽培应用最为广泛[2]。从染色体组成上看，甘蓝型油菜是由芸薹（AA，2n=20）与甘蓝（CC，2n=18）通过自然种间杂交后双二倍化进化而来的一种复合种。
利用转基因技术，人们把来自植物、动物或微生物的某些抗逆基因转入到甘蓝型油菜中，培育出了具有抗虫、抗病毒、抗除草剂等的转基因油菜[3]。在转基因油菜中又以抗除草剂转基因油菜的应用最为广泛，而抗除草剂转基因油菜的商业化种植可能导致抗性基因向近缘种发生漂移，从而带来生态风险。
我国是油菜的主要生产国，也是油菜作物的发源地之一，油菜的野生近缘种较多，其中野芥菜以其极强的入侵性和适应性最受关注[4]。野芥菜是十字花科芸薹属一年或两年生草本植物。为西北地区夏收作物的恶性杂草[5]，现已扩散到长江流域地区，在农田及荒地中广泛分布。2009年，Huangfu等，通过ISSR分子标记技术，推断野芥菜为芥菜型油菜的逸生种，且部分种群已对草甘膦产生了抗性[6]。如果抗除草剂基因渗入到野芥菜基因中，使之具有除草剂抗性，将会增强其对生态环境产生的不良影响，因此需要重视转基因油菜的抗性基因向野芥菜的渗入。
基因渗入（Introgression）是指两个基因库间的基因流动。转基因油菜（AACC）与野芥菜（AABB）除具有一个共同的A基因组外，由于A基因组与C基因组具有部分同源性，二者间能够发生基因重组[78]，因此转基因油菜C染色体基因也有可能会向野芥菜的渗入，而渗入的程度可能会对后代的适合度即后代在不同环境中的生存和竞争能力产生影响[9]。因此弄清抗除草剂转基因油菜的C染色体基因特异片段向野芥菜的渗入情况对深入开展转基因油菜与野芥菜的回交后代的适合度研究具有重要意义。
国外许多研究表明，甘蓝型油菜和芥菜能在田间环境下自然杂交[1012]。我国陈玉卿对十字花科芸薹属6 个种的种间杂交亲和性研究表明，甘蓝型油菜(作父本) 与芥菜型油菜、白菜型油菜、黑芥、埃塞俄比亚芥、甘蓝的亲和性依次递减[13]。浦惠明等（2005）[14]和宋小玲等（2007）[4]报道抗除草剂转基因油菜的抗性基因能漂移到野芥菜中产生F1。同时转基因油菜和野芥菜后代适合度的研究也较为深入[15]。但缺乏抗性油菜的C染色体基因特异片段在连续多世代中渗入的深入研究。
本课题组已完成抗草甘膦和抗草丁膦转基因油菜C染色体基因特异片段与野芥菜回交1代子23代，回交2代子2代，回交3代子1代的基因渗入研究，本试验在此基础上，进行回交1代子4代，回交2代子3代，回交3代子2代的研究。旨在通过研究抗草甘膦和抗草丁膦C染色体基因特异片段在其与野芥菜回交后代的传递频率，分析两种转基因油菜C染色体基因特异片段向野芥菜渗入的可能性及存在的差异，为我国转基因油菜向野芥菜的基因漂移提供更深入的资料。
1 材料与方法
1．1 实验材料
本次实验在前人实验的基础上进行，选取去年的回交代套袋自交产生的子代为研究对象（表1）。2014年在大学牌楼实验基地播种，在幼苗长出后，用所抗除草剂进行抗性筛选，对存活的含有抗性基因的植株进行叶片采集，选择新鲜幼嫩的植物叶片作为实验材料。
表1 实验材料
Table 1 Experimental materials
材料名称
个数
抗草甘膦
正交
回交一代子四代（BC1mF5R）
63
回交二代子三代（BC2mF4R）
49
回交三代子二代（BC3mF3R）
64
反交
回交一代子四代（BC1pF5R）
66
回交二代子三代（BC2pF4R）
58
回交三代子二代（BC3pF3R）
34
抗草丁膦
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 研究材料与方法3
1.1 实验材料 3
1.2 实验选用引物 3
2 实验方法4
2.1 DNA提取4
2.2 PCR反应4
2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳4
2.3.1 聚丙烯酰胺凝胶的配置4
2.3.2 电泳5
2.3.3 银染及显色5
2.4 数据统计5
3 结果与分析5
3.1 17对C染色体基因特异片段在回交1代子4代中被检测到的情况5
3.2 17对C染色体基因特异片段在回交2代子3代中被检测到的情况8
3.3 17对C染色体基因特异片段在回交3代子2代中被检测到的情况10
4 讨论12
致谢13
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引言
芸薹属（Brassica）是十字花科植物中最为重要的一个属，包含许多蔬菜、油料及饲料等经济上有重要价值的作物。关于芸薹属内物种的亲缘关系，韩国学者禹长春在1936年提出了禹氏三角[1]，他认为芸薹（B.campestris，2n=20，AA）、黑芥（B. Nigra，2n=16，BB）和甘蓝（B. Oleracea，2n=18，CC）为芸薹属的基本种，在自然条件下，基本种之间通过杂交，得到芥菜（B. Juncea，2n=36，AABB）、甘蓝型油菜（B. Napus，2n=38，AACC）和埃塞俄比亚芥（B. Carinata，2n=34，BBCC）3个异源四倍体物种。其后，禹氏三角被很多科学家所证明。其中的甘蓝型油菜是三大类型油菜之一，具有角果长、种子大、无辛辣味、分枝数及结角数多、耐肥、产量和含油量高等其它类型油菜所缺少的优点。目前在各种油菜类型中以它的栽培应用最为广泛[2]。从染色体组成上看，甘蓝型油菜是由芸薹（AA，2n=20）与甘蓝（CC，2n=18）通过自然种间杂交后双二倍化进化而来的一种复合种。
利用转基因技术，人们把来自植物、动物或微生物的某些抗逆基因转入到甘蓝型油菜中，培育出了具有抗虫、抗病毒、抗除草剂等的转基因油菜[3]。在转基因油菜中又以抗除草剂转基因油菜的应用最为广泛，而抗除草剂转基因油菜的商业化种植可能导致抗性基因向近缘种发生漂移，从而带来生态风险。
我国是油菜的主要生产国，也是油菜作物的发源地之一，油菜的野生近缘种较多，其中野芥菜以其极强的入侵性和适应性最受关注[4]。野芥菜是十字花科芸薹属一年或两年生草本植物。为西北地区夏收作物的恶性杂草[5]，现已扩散到长江流域地区，在农田及荒地中广泛分布。2009年，Huangfu等，通过ISSR分子标记技术，推断野芥菜为芥菜型油菜的逸生种，且部分种群已对草甘膦产生了抗性[6]。如果抗除草剂基因渗入到野芥菜基因中，使之具有除草剂抗性，将会增强其对生态环境产生的不良影响，因此需要重视转基因油菜的抗性基因向野芥菜的渗入。
基因渗入（Introgression）是指两个基因库间的基因流动。转基因油菜（AACC）与野芥菜（AABB）除具有一个共同的A基因组外，由于A基因组与C基因组具有部分同源性，二者间能够发生基因重组[78]，因此转基因油菜C染色体基因也有可能会向野芥菜的渗入，而渗入的程度可能会对后代的适合度即后代在不同环境中的生存和竞争能力产生影响[9]。因此弄清抗除草剂转基因油菜的C染色体基因特异片段向野芥菜的渗入情况对深入开展转基因油菜与野芥菜的回交后代的适合度研究具有重要意义。
国外许多研究表明，甘蓝型油菜和芥菜能在田间环境下自然杂交[1012]。我国陈玉卿对十字花科芸薹属6 个种的种间杂交亲和性研究表明，甘蓝型油菜(作父本) 与芥菜型油菜、白菜型油菜、黑芥、埃塞俄比亚芥、甘蓝的亲和性依次递减[13]。浦惠明等（2005）[14]和宋小玲等（2007）[4]报道抗除草剂转基因油菜的抗性基因能漂移到野芥菜中产生F1。同时转基因油菜和野芥菜后代适合度的研究也较为深入[15]。但缺乏抗性油菜的C染色体基因特异片段在连续多世代中渗入的深入研究。
本课题组已完成抗草甘膦和抗草丁膦转基因油菜C染色体基因特异片段与野芥菜回交1代子23代，回交2代子2代，回交3代子1代的基因渗入研究，本试验在此基础上，进行回交1代子4代，回交2代子3代，回交3代子2代的研究。旨在通过研究抗草甘膦和抗草丁膦C染色体基因特异片段在其与野芥菜回交后代的传递频率，分析两种转基因油菜C染色体基因特异片段向野芥菜渗入的可能性及存在的差异，为我国转基因油菜向野芥菜的基因漂移提供更深入的资料。
1 材料与方法
1．1 实验材料
本次实验在前人实验的基础上进行，选取去年的回交代套袋自交产生的子代为研究对象（表1）。2014年在大学牌楼实验基地播种，在幼苗长出后，用所抗除草剂进行抗性筛选，对存活的含有抗性基因的植株进行叶片采集，选择新鲜幼嫩的植物叶片作为实验材料。
表1 实验材料
Table 1 Experimental materials
材料名称
个数
抗草甘膦
正交
回交一代子四代（BC1mF5R）
63
回交二代子三代（BC2mF4R）
49
回交三代子二代（BC3mF3R）
64
反交
回交一代子四代（BC1pF5R）
66
回交二代子三代（BC2pF4R）
58
回交三代子二代（BC3pF3R）
34
抗草丁膦
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