铜胁迫下osmsra2基因突变对水稻生长的影响以及osmsra2互作蛋白的筛选
生物体中的甲硫氨酸（Met）易被氧化形成甲硫氨酸亚砜（MetSO），导致蛋白活性被破坏，正常生理功能受到影响。甲硫氨酸亚砜还原酶（MSR）能够将MetSO还原为Met，恢复蛋白质的活性。本实验首先通过铜和甲基紫精梯度浓度实验，筛选出最佳的铜和胁迫处理浓度分别为25μM和0.1μM。在此基础上，在Cu胁迫和甲基紫精处理下，研究OsMSRA2基因突变对水稻根长、株高、叶绿素含量及根尖质膜完整性等生理指标的影响；实验结果显示，在Cu处理的条件下，野生型水稻株高根长生长受抑制，根尖细胞质膜完整性随Cu离子浓度上升而下降；OsMSRA2突变体株高根长表现出的受抑制情况更加严重。在MV处理下，野生型水稻株高根长生长也受到明显抑制，且随MV处理浓度上升，野生型叶尖部位叶绿素b含量呈现下降趋势。另外，为了明确MSRA2响应过量铜的机理，本文通过酵母双杂交技术筛选出一个可与MSRA2发生互作的蛋白MYBS1，该蛋白是转录因子MYB家族成员，其基因表达与MSR类似，受铜胁迫的强烈诱导。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 材料3
1.2 方法3
1.2.1 铜离子和甲基紫精浓度梯度胁迫处理3
1.2.1.1铜离子、甲基紫精梯度处理3
1.2.1.2 水稻总RNA提取并反转录获得cDNA5
1.2.1.3 生理功能验证5
1.2.2 酵母双杂交技术筛选与OsMSRA2互作的蛋白5
1.2.2.1 载体构建与大肠杆菌转化5
1.2.2.2 Bait酵母菌种构建7
1.2.2.3 Bait菌株自激活检测7
1.2.2.4 Bait菌株保藏8
1.2.2.5 文库筛选8
1.2.2.6 荧光定量PCR检测MSRA2插入突变体中MYBS1表达量8
2结果与分析9
2.1 Cu和MV处理浓度的筛选9
2.1.1 Cu和MV梯度处理对株高根长的影响9
2.1.2. Cu和MV处理对叶绿素含量的影响10< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
br /> 2.1.3 Cu处理对根尖细胞质膜完整性的影响10
2.2 Cu处理对野生型OsMSRA2突变体水稻幼苗生长的影响11
2.3 酵母双杂交技术筛选OsMSRA2互作蛋白12
2.3.1 酵母双杂互作蛋白筛选结果12
2.3.2 蛋白的点对点验证13
2.3.3 过量Cu对MYBS1基因的诱导14
3 讨论15
4 结论16
致谢16
参考文献16
铜胁迫下OsMSRA2基因突变对水稻生长的影响以及OsMSRA2互作蛋白的筛选
引言
引言
甲硫氨酸（methionine, Met）是构成人体的必需氨基酸之一,存在于多肽和蛋白质中，是重要的含硫氨基酸残基，它参与蛋白质合成，在生物体内扮演着十分重要的角色。甲硫氨酸対活性氧物质十分敏感，可以被过量活性氧（Reaction Oxygen Species, ROS），如过氧化氢、臭氧，氧化为甲硫氨酸R,S亚砜（MetR, SSO）[1]。成氧胁迫环境的因素有很多，盐、旱、重金属离子等均会产生大量对细胞有害的活性氧（ROS），主要包括单线态氧（1O2）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（OH）、氢氧根负离子（OH）、超氧阴离子自由基（O2）等。在正常情况下，ROS的产生和清除处于动态平衡的状态，不会对细胞产生损伤；但在胁迫条件下，平衡则会被打破，产生活性氧的大量积累，植物的细胞壁产生氧化损伤，胞内结构遭到破坏发生改变，叶绿体膨胀或崩裂，胞内大分子多糖、蛋白质、DNA等受到氧化损伤，导致植物体的生长发育受到影响[2]。生物体内的DNA修复系统可以修复发生氧化损伤的大分子，一旦蛋白质发生损伤，便被蛋白酶降解并再合成[3]。另外，侧链氨基酸的氧化修饰导致许多蛋白质的活性和构象的改变，含硫残留物由于其与活性氧（ROS）的高反应性而最容易受到氧化损伤。半胱氨酸可以被氧化成亚磺酸或亚磺酸形式，甲硫氨酸可以被氧化成甲硫氨酸亚砜（MetSO）。然而，这些修饰中的大部分通过硫醇还原酶的作用是可逆的。氧化形式的半胱氨酸被硫氧还蛋白，谷氧还蛋白和硫氧还蛋白还原，而甲硫氨酸亚砜需要通过氧化还原活性半胱氨酸被甲硫氨酸亚砜还原酶（MSR）还原成甲硫氨酸[4]。即当Met被氧化后，则会激活一套高效的机制，MSR基因表达量的上升，其编码的甲硫氨酸亚砜还原酶将游离型或肽型的MetR,SSO还原为Met。甲硫氨酸亚砜还原酶（methionine sulfoxide reductase，MSR）基因家族是广泛存在于生物体内的、编码抗氧化胁迫还原酶的一组基因，其功能是在生物受到过量ROS暴露的环境中，将因氧化而降低或丧失了原有生物学活性的、含甲硫氨酸的蛋白质还原，使其恢复活性。
水稻中共有7个OsMSRs基因，这7个OsMSRs在水稻植株中的表达定位不同：在根、茎、叶中，OsMSRA2.1的表达量都比较高，其中在叶中表达量最高，而在种子中的表达量较低；OsMSRA4、OsMSRB1.1和OsMSRB1.2则是在茎和叶中表达量较高，而在根、种子中表达量则较低；在根中，OsMSRA5的表达量最高；在叶中，OsMSRB5的表达量最高[5]。在水稻中，重金属铜（Cu）的积累可以引起过量活性氧的积累造成氧化胁迫，而Cu的短期积累可导致水稻体内甲硫氨酸亚砜还原酶（MSR）的表达量被抑制；而长时间的铜胁迫则会导致甲硫氨酸亚砜还原酶的表达量显著上调，并适应性的参与到抗氧化胁迫过程中，降低细胞受Cu污染的损伤影响[1]。越来越多的研究表明，MSR基因参与多种胁迫响应，谷胱甘肽S转移酶GSTF2、GSTF3和GSTF7通过AtMSRB7将其激活参与氧化胁迫[6], 大豆GsMSRB5a通过与Ca2+/CAM依赖性的激酶GsCBRLK互作调控ROS信号，响应盐胁迫[7]。
前期的实验结果表明，甲基紫精（MV）胁迫处理也会引起水稻中OsMSRA2.1和OsMSRB5的表达量上调，并且在植株的根部细胞中格外明显。OsMSRA2.1基因包含两个外显子和一个内含子，基因总长度为2056bp，基因CDS长为564 bp，表达的蛋白质编码了188个氨基酸，基因位于水稻的4号染色体上（如图1所示）。在本实验室之前的研究中，将OsMSRA2.1和OsMSRB5的基因片段分别通过酶切酶联与原核表达载体pET30a相连，获得质粒pET30aMSRA2.1和pET30aMSRB5，然后将质粒各自转化到大肠杆菌中，用一定浓度的Cu和甲基紫精处理，实验结果得出结论，重组型菌株的生长状态比对照菌株好很多，由此证明OsMSRA2.1和OsMSRB5基因在较高浓度Cu和甲基紫精环境中起到了重要的保护效应[1]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 材料3
1.2 方法3
1.2.1 铜离子和甲基紫精浓度梯度胁迫处理3
1.2.1.1铜离子、甲基紫精梯度处理3
1.2.1.2 水稻总RNA提取并反转录获得cDNA5
1.2.1.3 生理功能验证5
1.2.2 酵母双杂交技术筛选与OsMSRA2互作的蛋白5
1.2.2.1 载体构建与大肠杆菌转化5
1.2.2.2 Bait酵母菌种构建7
1.2.2.3 Bait菌株自激活检测7
1.2.2.4 Bait菌株保藏8
1.2.2.5 文库筛选8
1.2.2.6 荧光定量PCR检测MSRA2插入突变体中MYBS1表达量8
2结果与分析9
2.1 Cu和MV处理浓度的筛选9
2.1.1 Cu和MV梯度处理对株高根长的影响9
2.1.2. Cu和MV处理对叶绿素含量的影响10< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
br /> 2.1.3 Cu处理对根尖细胞质膜完整性的影响10
2.2 Cu处理对野生型OsMSRA2突变体水稻幼苗生长的影响11
2.3 酵母双杂交技术筛选OsMSRA2互作蛋白12
2.3.1 酵母双杂互作蛋白筛选结果12
2.3.2 蛋白的点对点验证13
2.3.3 过量Cu对MYBS1基因的诱导14
3 讨论15
4 结论16
致谢16
参考文献16
铜胁迫下OsMSRA2基因突变对水稻生长的影响以及OsMSRA2互作蛋白的筛选
引言
引言
甲硫氨酸（methionine, Met）是构成人体的必需氨基酸之一,存在于多肽和蛋白质中，是重要的含硫氨基酸残基，它参与蛋白质合成，在生物体内扮演着十分重要的角色。甲硫氨酸対活性氧物质十分敏感，可以被过量活性氧（Reaction Oxygen Species, ROS），如过氧化氢、臭氧，氧化为甲硫氨酸R,S亚砜（MetR, SSO）[1]。成氧胁迫环境的因素有很多，盐、旱、重金属离子等均会产生大量对细胞有害的活性氧（ROS），主要包括单线态氧（1O2）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（OH）、氢氧根负离子（OH）、超氧阴离子自由基（O2）等。在正常情况下，ROS的产生和清除处于动态平衡的状态，不会对细胞产生损伤；但在胁迫条件下，平衡则会被打破，产生活性氧的大量积累，植物的细胞壁产生氧化损伤，胞内结构遭到破坏发生改变，叶绿体膨胀或崩裂，胞内大分子多糖、蛋白质、DNA等受到氧化损伤，导致植物体的生长发育受到影响[2]。生物体内的DNA修复系统可以修复发生氧化损伤的大分子，一旦蛋白质发生损伤，便被蛋白酶降解并再合成[3]。另外，侧链氨基酸的氧化修饰导致许多蛋白质的活性和构象的改变，含硫残留物由于其与活性氧（ROS）的高反应性而最容易受到氧化损伤。半胱氨酸可以被氧化成亚磺酸或亚磺酸形式，甲硫氨酸可以被氧化成甲硫氨酸亚砜（MetSO）。然而，这些修饰中的大部分通过硫醇还原酶的作用是可逆的。氧化形式的半胱氨酸被硫氧还蛋白，谷氧还蛋白和硫氧还蛋白还原，而甲硫氨酸亚砜需要通过氧化还原活性半胱氨酸被甲硫氨酸亚砜还原酶（MSR）还原成甲硫氨酸[4]。即当Met被氧化后，则会激活一套高效的机制，MSR基因表达量的上升，其编码的甲硫氨酸亚砜还原酶将游离型或肽型的MetR,SSO还原为Met。甲硫氨酸亚砜还原酶（methionine sulfoxide reductase，MSR）基因家族是广泛存在于生物体内的、编码抗氧化胁迫还原酶的一组基因，其功能是在生物受到过量ROS暴露的环境中，将因氧化而降低或丧失了原有生物学活性的、含甲硫氨酸的蛋白质还原，使其恢复活性。
水稻中共有7个OsMSRs基因，这7个OsMSRs在水稻植株中的表达定位不同：在根、茎、叶中，OsMSRA2.1的表达量都比较高，其中在叶中表达量最高，而在种子中的表达量较低；OsMSRA4、OsMSRB1.1和OsMSRB1.2则是在茎和叶中表达量较高，而在根、种子中表达量则较低；在根中，OsMSRA5的表达量最高；在叶中，OsMSRB5的表达量最高[5]。在水稻中，重金属铜（Cu）的积累可以引起过量活性氧的积累造成氧化胁迫，而Cu的短期积累可导致水稻体内甲硫氨酸亚砜还原酶（MSR）的表达量被抑制；而长时间的铜胁迫则会导致甲硫氨酸亚砜还原酶的表达量显著上调，并适应性的参与到抗氧化胁迫过程中，降低细胞受Cu污染的损伤影响[1]。越来越多的研究表明，MSR基因参与多种胁迫响应，谷胱甘肽S转移酶GSTF2、GSTF3和GSTF7通过AtMSRB7将其激活参与氧化胁迫[6], 大豆GsMSRB5a通过与Ca2+/CAM依赖性的激酶GsCBRLK互作调控ROS信号，响应盐胁迫[7]。
前期的实验结果表明，甲基紫精（MV）胁迫处理也会引起水稻中OsMSRA2.1和OsMSRB5的表达量上调，并且在植株的根部细胞中格外明显。OsMSRA2.1基因包含两个外显子和一个内含子，基因总长度为2056bp，基因CDS长为564 bp，表达的蛋白质编码了188个氨基酸，基因位于水稻的4号染色体上（如图1所示）。在本实验室之前的研究中，将OsMSRA2.1和OsMSRB5的基因片段分别通过酶切酶联与原核表达载体pET30a相连，获得质粒pET30aMSRA2.1和pET30aMSRB5，然后将质粒各自转化到大肠杆菌中，用一定浓度的Cu和甲基紫精处理，实验结果得出结论，重组型菌株的生长状态比对照菌株好很多，由此证明OsMSRA2.1和OsMSRB5基因在较高浓度Cu和甲基紫精环境中起到了重要的保护效应[1]。
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