感染螺原体的蜜蜂肠道可培养细菌多样性研究
：蜜蜂作为世界范围内最重要的授粉昆虫，对农业生产发展和自然生态平衡有着举足轻重的影响。大量研究表明，蜜蜂肠道内的微生物种群变化与蜜蜂的健康状况密切相关，而导致青壮年蜜蜂在春季大量死亡的蜜蜂螺原体也主要作用于肠道。本研究运用分离培养、形态特征观察及16S rDNA序列分析的方法，对蜜蜂肠道可培养的细菌进行了分离与鉴定。试验中共分离纯化得到60株细菌，并从中挑选出菌落形态不同的22株进行16S rDNA序列分析。研究发现在感染螺原体的蜜蜂肠道内菌种丰富度更高，但不论是否有螺原体存在，蜜蜂肠道内的优势菌种基本相同。本研究比较了感染螺原体的蜜蜂和健康蜜蜂肠道细菌的多样性，将为进一步研究螺原体的致病机理提供重要信息。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1实验材料 2
1.1.2 主要实验试剂及其配制 2
1.1.3 主要实验用品与仪器 2
1.2方法 3
1.2.1样品的采集与处理3
1.2.2肠道菌分离培养与纯化3
1.2.3 肠道菌形态学鉴定.................................3
1.2.4 DNA提取...........4
1.2.5 肠道菌 16S rDNA基因扩增..............4
1.2.6 切胶回收..................................4
1.2.7 TA克隆.....................4
1.2.8 菌株保藏...........5
1.2.9 螺原体的分离检测...........5
1.2.10 螺原体的分子检测...........5
2结果与分析5
2.1蜜蜂肠道细菌分离、纯化6
2.2蜜蜂肠道部分分离菌株的分子鉴定7
2.2.1部分分离菌株DNA提取8
2.2.2部分分离菌
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
株的16S rDNA 扩增8
2.2.3 序列测定与分析.......................9
2.3 螺原体检测............................................. 10
2.3.1 螺原体分离培养与检测..10
2.3.2 螺原体的分子检测10
2.4 检测结果汇总与分析............. 11
2.5 蜜蜂肠道微生物分子生物学检测....................... 11
3总结与讨论 11
致谢12
参考文献13
感染螺原体的蜜蜂肠道可培养细菌多样性研究
引言
蜜蜂属于昆虫纲膜翅目细腰亚目针尾部蜜蜂总科蜜蜂科( Apidae) 蜜蜂亚科( Apinae)蜜蜂属(Apis) ，是以雌性个体为主的社会性群体生活昆虫[1]。作为世界范围内数量最多的授粉昆虫，蜜蜂的授粉量占全部农作物虫媒授粉量的80%，且每年全球直接源于昆虫授粉创造的经济价值大约有150亿美元，占全球整个农业生产经济收入的9.5％[2, 3]。此外，养蜂业所提供的包括营养品、保健品在内的各种产品也有着巨大的消费市场。因此，蜜蜂不仅是自然生态系统中极为重要的一环，也与人类的农业生产、经济发展有着密不可分的联系。然而，最近有明确证据表明包括野生生境和人工养殖环境在内的所有蜜蜂数量在近几年都呈下降的趋势。造成这一现象的可能原因包括：气候变化、农业化学品应用、物种入侵和病原菌感染等等[4]。
蜜蜂爬蜂病是常见蜜蜂病害之一。它是由多种病原引起的青壮年蜜蜂爬行，对意大利蜜蜂等西方蜂影响尤为严重。因其多发生在3至5月间，故又称蜜蜂五月病。爬蜂病的主要病原体为螺原体，它属于细菌域(Bacteria)，厚壁菌门(Firmicutes)，柔膜菌纲(Mollicutes)，虫原体目(Entomoplasmatale)，螺原体科(Spiroplasmataceae)，螺原体属(Spiroplasma)。其直径一般为100 nm~ 250 nm, 菌体长度约2~ 5 um，多呈螺旋状，在适当的固体培养基上可形成煎蛋形或颗粒状菌落。螺原体没有鞭毛，但具运动性，可在液体培养基中能以旋转、波动和屈伸的方式运动[5, 6]。螺原体缺少细胞壁，但从系统发育学角度属于革兰氏阳性菌。目前，螺原体已被从多种节肢动物和植物中分离出来，并根据其血清学特性分为42 个血清组(包括15个血清亚组) 确立了38 个螺原体种[7]。昆虫是螺原体的主要宿主，他们主要入侵肠道，但一些种群将他们的栖息地扩大至了淋巴腺、卵巢脂肪层，甚至是皮下组织和唾液腺[8]。
螺原体最初由Dvais等在患矮化病的玉米汁液中发现并命名。1973年，Saligo等首次将柑桔僵化病螺原体培养成功并证明其致病性[9]。蜜蜂螺原体则最早发现于1976年，在美国贝茨维尔进行的关于蜜蜂病原体微生物的实验中被报道。20世纪80年代早期，蜜蜂螺原体在法国被从患有五月病症状的蜜蜂中大量发现。之后，大规模的蜜蜂死亡发生在美国和欧洲并吸引了大量对蜜蜂病原微生物的传染病学和致病机制研究。
我国有关螺原体的研究主要集中在20 世纪80年代和90 年代初。1988 年陈永萱教授等首次从患爬蜂病的蜜蜂体内分离到螺原体CH1, 并对其基本生物学性状、致病性和血清学特性进行了较为详细的研究。该分离菌株被鉴定为S. melliferum, 从此揭开了国内螺原体研究的序幕[10]。
蜜蜂体内存在的肠道微生物与蜜蜂正常的生理活动有着不可分割的联系，二者相互作用相互依存。微生物在寄主的消化、吸收、免疫、生物拮抗等很多方面都起着重要作用，肠道微生物的分布及种类直接影响到蜜蜂的健康。 因此，开展蜜蜂肠道微生物生态的研究对蜜蜂的养殖、保健和养蜂业的深度开发都有重要意义。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验材料
养蜂场养殖蜜蜂Apis mellifera，实验室保存菌种Spiroplasma melliferum。
1．1．2 主要实验试剂及其配制
A. 样品消毒试剂：1%次氯酸钠，75%乙醇 ，ddH2O。
B. 培养基：
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1实验材料 2
1.1.2 主要实验试剂及其配制 2
1.1.3 主要实验用品与仪器 2
1.2方法 3
1.2.1样品的采集与处理3
1.2.2肠道菌分离培养与纯化3
1.2.3 肠道菌形态学鉴定.................................3
1.2.4 DNA提取...........4
1.2.5 肠道菌 16S rDNA基因扩增..............4
1.2.6 切胶回收..................................4
1.2.7 TA克隆.....................4
1.2.8 菌株保藏...........5
1.2.9 螺原体的分离检测...........5
1.2.10 螺原体的分子检测...........5
2结果与分析5
2.1蜜蜂肠道细菌分离、纯化6
2.2蜜蜂肠道部分分离菌株的分子鉴定7
2.2.1部分分离菌株DNA提取8
2.2.2部分分离菌
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
株的16S rDNA 扩增8
2.2.3 序列测定与分析.......................9
2.3 螺原体检测............................................. 10
2.3.1 螺原体分离培养与检测..10
2.3.2 螺原体的分子检测10
2.4 检测结果汇总与分析............. 11
2.5 蜜蜂肠道微生物分子生物学检测....................... 11
3总结与讨论 11
致谢12
参考文献13
感染螺原体的蜜蜂肠道可培养细菌多样性研究
引言
蜜蜂属于昆虫纲膜翅目细腰亚目针尾部蜜蜂总科蜜蜂科( Apidae) 蜜蜂亚科( Apinae)蜜蜂属(Apis) ，是以雌性个体为主的社会性群体生活昆虫[1]。作为世界范围内数量最多的授粉昆虫，蜜蜂的授粉量占全部农作物虫媒授粉量的80%，且每年全球直接源于昆虫授粉创造的经济价值大约有150亿美元，占全球整个农业生产经济收入的9.5％[2, 3]。此外，养蜂业所提供的包括营养品、保健品在内的各种产品也有着巨大的消费市场。因此，蜜蜂不仅是自然生态系统中极为重要的一环，也与人类的农业生产、经济发展有着密不可分的联系。然而，最近有明确证据表明包括野生生境和人工养殖环境在内的所有蜜蜂数量在近几年都呈下降的趋势。造成这一现象的可能原因包括：气候变化、农业化学品应用、物种入侵和病原菌感染等等[4]。
蜜蜂爬蜂病是常见蜜蜂病害之一。它是由多种病原引起的青壮年蜜蜂爬行，对意大利蜜蜂等西方蜂影响尤为严重。因其多发生在3至5月间，故又称蜜蜂五月病。爬蜂病的主要病原体为螺原体，它属于细菌域(Bacteria)，厚壁菌门(Firmicutes)，柔膜菌纲(Mollicutes)，虫原体目(Entomoplasmatale)，螺原体科(Spiroplasmataceae)，螺原体属(Spiroplasma)。其直径一般为100 nm~ 250 nm, 菌体长度约2~ 5 um，多呈螺旋状，在适当的固体培养基上可形成煎蛋形或颗粒状菌落。螺原体没有鞭毛，但具运动性，可在液体培养基中能以旋转、波动和屈伸的方式运动[5, 6]。螺原体缺少细胞壁，但从系统发育学角度属于革兰氏阳性菌。目前，螺原体已被从多种节肢动物和植物中分离出来，并根据其血清学特性分为42 个血清组(包括15个血清亚组) 确立了38 个螺原体种[7]。昆虫是螺原体的主要宿主，他们主要入侵肠道，但一些种群将他们的栖息地扩大至了淋巴腺、卵巢脂肪层，甚至是皮下组织和唾液腺[8]。
螺原体最初由Dvais等在患矮化病的玉米汁液中发现并命名。1973年，Saligo等首次将柑桔僵化病螺原体培养成功并证明其致病性[9]。蜜蜂螺原体则最早发现于1976年，在美国贝茨维尔进行的关于蜜蜂病原体微生物的实验中被报道。20世纪80年代早期，蜜蜂螺原体在法国被从患有五月病症状的蜜蜂中大量发现。之后，大规模的蜜蜂死亡发生在美国和欧洲并吸引了大量对蜜蜂病原微生物的传染病学和致病机制研究。
我国有关螺原体的研究主要集中在20 世纪80年代和90 年代初。1988 年陈永萱教授等首次从患爬蜂病的蜜蜂体内分离到螺原体CH1, 并对其基本生物学性状、致病性和血清学特性进行了较为详细的研究。该分离菌株被鉴定为S. melliferum, 从此揭开了国内螺原体研究的序幕[10]。
蜜蜂体内存在的肠道微生物与蜜蜂正常的生理活动有着不可分割的联系，二者相互作用相互依存。微生物在寄主的消化、吸收、免疫、生物拮抗等很多方面都起着重要作用，肠道微生物的分布及种类直接影响到蜜蜂的健康。 因此，开展蜜蜂肠道微生物生态的研究对蜜蜂的养殖、保健和养蜂业的深度开发都有重要意义。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验材料
养蜂场养殖蜜蜂Apis mellifera，实验室保存菌种Spiroplasma melliferum。
1．1．2 主要实验试剂及其配制
A. 样品消毒试剂：1%次氯酸钠，75%乙醇 ，ddH2O。
B. 培养基：
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