PHR1转录因子对烟草磷吸收的影响
PHR1转录因子对烟草磷吸收的影响[20200614172007]
摘要：磷是植物生长过程中一个必需大量营养元素，它参与了植物生长代谢、生化合成、信号转导等一系列活动。磷素通常以正磷酸盐形式被植物吸收，但在土壤中多以无效态形式存在，而有效磷含量少，易流失，难以满足植物生长需要，从而造成植物普遍性缺磷现象。为应对缺磷胁迫，植物进化出一系列的生理和分子适应机制，如改变根系形态结构，与菌根真菌形成有益共生体系以及诱导和激活参与磷素吸收利用相关基因，特别是转录因子的表达。本文以前期克隆到的一个烟草PHR转录因子PHR1为研究对象，通过研究这两个基因的超表达和RNAi转基因材料在高磷和低磷营养液处理条件下对烟草的营养生长和磷素吸收的影响，初步揭示PHR转录因子是否调控烟草磷素营养的吸收利用。实验结果显示，PHR1基因在烟草叶片中表达强烈；在低磷条件下，抑制PHR1基因的表达显著影响烟草根系发生和植株生长，而在高磷条件下或增强PHR1基因的表达对植株生长和磷吸收无显著影响。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:PHR转录因子；烟草；磷素；基因表达
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2方法 3
1.2.1植物材料与生长条件3
1.2.2植株收获及表性观察3
1.2.3植株RNA提取及RT-PCR3
1.2.4实时定量荧光PCR4
1.2.5植物全磷测定 4
2结果与分析4
2.1表型分析4
2.2生理分析 5
2.3基因表达分析7
3讨论8
致谢8
参考文献9
附录A 植物组织中RNA的提取10
附录B RT-PCR（M-MLV反转录试剂盒）10
附录C 钼蓝比色法测定全磷含量 11
PHR转录因子对烟草磷吸收的影响
引言
引言
土壤中的磷大多数以无效态的形式存在，而能被植物吸收利用的有效态的磷含量通常在1μmol/L 左右，远不能满足植物获取充足磷营养的需求，这也是我国乃至全球农业生产中谷物产量的限制因素之一[1]。对于这个全球性的的缺磷问题，改善作物对磷素的吸收和利用在生态和经济方面都具有重要意义。研究植物对土壤中磷素吸收和利用的分子方面机理，挖掘如何高效吸收利用磷素营养的基因资源的方法,一直是全世界的重要研究方面。近年来,对于编码磷素转运蛋白的一系列基因的克隆及表达调控的研究,为了解高等植物复杂的磷素吸收和转运提供了大量的分子生物学基础[2]。
烟草作为模式植物无论是在基础研究还是应用研究都起了很大的作用，尤其是在遗传、繁育、生理、生化和后期 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
采收代谢方面。烟草种子数量多，品系之间特别容易杂交，尤其是它的染色体里有许多标记性基因，因此，是一种进行遗传学研究的绝佳研究材料。并且烟叶富含蛋白质，烟叶提取的蛋白可制作多种食品，有广泛用途，剩下的烟叶仍可用作卷烟原料。烟叶蛋白质比鸡蛋、乳酪和牛奶更适合人体吸收利用。而且烟草再生能力强，一年可多次收获，烟叶产量高，利用鲜烟叶提取蛋白，其亩产量可超过大豆，其他作物更无法相比。除此之外烟草对医疗研究也有重要作用，烟草硒蛋白对清除自由基、防护红细胞溶血、化学性肝损伤保护等方面都优于不含硒蛋白质，所以烟草硒蛋白有很好的发展前景。因此对深入研究烟草对磷吸收的分子机制有重要意义。
目前研究发现为了应对磷素缺乏的影响，植物在生长期的进化过程中形成了一系列的适应性机制如：植物应对缺磷状态做出了一系列适应性改变，如为了扩大根系吸收范围而使得侧根增多变长，根毛变长变密；植株矮小，生物量降低[3]；同时根系分泌有机酸降解难溶性磷供植物吸收；与根际微生物共生形成从枝菌根，通过微生物吸收营养[4]，以及诱导活化与磷吸收、运输和代谢相关基因的协同表达[5]。
近年来很多研究从功能基因组的角度，以模式作物拟南芥和水稻位研究对象，对磷胁迫诱导的差异基因表达谱、差异基因的功能类别、基因调控网络、非编码RNA以及植物激素参与的植物耐低磷调控机制等方面进行了一系列富有成效的研究，初步揭示了植物响应低磷胁迫的一些分子机制，发现低磷胁迫前后的基因变化涉及到几乎所有代谢途径，分离出了相关的磷转运子（如Pht1和Pht2家族基因）[6]、转录因子（如PHR1、PHR2、WRKY75）[7]等，并且解析了以PHR1转录因子为中心，包括小RNA（如miR399）在内的响应低磷信号的调控途径[8]。
但近年来的研究结果表明转录因子往往是以家族基因的形式存在，其成员的功能具有多样性，在不同作物中调控植物对低磷胁迫的响应方式和信号网络也有相当程度的差异性[9]。鉴于此，本课题以前期克隆到的一个烟草PHR转录因子为研究对象，通过超表达和RNAi转基因材料和野生型材料在高磷和低磷营养条件下的生理和分子反应差异，拟初步揭示PHR转录因子是否参与调控烟草的磷素营养吸收以及可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
供试作物：野生型烟草（云烟82）、烟草PHR1 超表达材料：OE3-1、OE4-1、OE1-2，以及烟草PHR1 RNAi材料：RNAi40-6、RNAi17-3、RNAi2-1。
1.2 方法
1.2.1 植物材料与生长条件
将烟草种子用75%乙醇浸泡45s消毒，用10%NaClO浸泡10min，然后用无菌水洗涤5-6次除去表面残留的NaClO，放在灭菌的吸水纸上吹干，吹干后点种在灭菌的MS培养基上，以上操作均在超净工作台完成，然后将平皿放入28℃组培室培养，待叶片展开，转入砂培。作物用完全营养液炼苗一周，然后用+P营养液和-P营养液进行处理一个月。烟草砂培营养液：高磷（+P）营养液的配方及浓度为：2 mM KNO3，1 mM NH4NO3，1 mM NaH2PO4，0.5 mM Ca(NO3)2，0.25 mM CaCl2 。低磷（-P）营养液的配方及浓度为：2 mM KNO3，1 mM NH4NO3，0.25 mM NaH2PO4，0.5 mM Ca( *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
NO3)2，0.25 mM CaCl2 。
1.2.2 植株收获采样及表型观察
收获采样时将植株在清水和去离子水中清洗干净除去沙土然后用吸水纸擦干，观察并且拍照记录植株大小以及根系形态。然后将地下部和地上部分开采样并分别记录鲜重。一部分样品采样后立即用液氮速冻并置于-70℃冰箱保存，以备提取RNA作表达量差异的分析。另一部分样品经105℃烘烤杀青30分钟后于70℃烘烤72小时称干重，分析生物量、根冠比以及一些其它的生理数据。
1.2.3 植株RNA的提取及RT-PCR
将存储在-70℃冰箱保存的植物样品根据附录一Ttizol试剂盒提取植物总RNA的方法提取植物RNA，测定RNA浓度后，反转录成cDNA，反转录操作根据M-MLV反转录试剂盒方法（附录二），最后用内参基因PCR观察反转录效果，PCR体系20μl体系：正反引物各0.5μl，PCR Mix10μl，模板1μl，ddH2O8μl。反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s，55℃退火30s,72℃延伸30s,共30个循环；72℃总体延伸7min.以备用于后续实时定量荧光PCR。
1.2.4 实时荧光定量PCR
将反转录的cDNA20倍稀释后根据实时荧光定量PCR试剂盒操作方法进行操作，定量PCR扩增仪及PCR用96孔板为Bio-Rad公司产品，反应体系为20 μl： TaKaRa SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μl，ROX Reference Dye 0.4μl，正向及反向引物各0.8μl，cDNA 模板1.5 μl，dd H2O 6.5μl。反应条件为：95℃预变性1min；PCR:95℃变性5 s，60℃退火30s共40个循环；95℃延伸15s，60℃30s，95℃15s。反应完成后，进行数据分析。
摘要：磷是植物生长过程中一个必需大量营养元素，它参与了植物生长代谢、生化合成、信号转导等一系列活动。磷素通常以正磷酸盐形式被植物吸收，但在土壤中多以无效态形式存在，而有效磷含量少，易流失，难以满足植物生长需要，从而造成植物普遍性缺磷现象。为应对缺磷胁迫，植物进化出一系列的生理和分子适应机制，如改变根系形态结构，与菌根真菌形成有益共生体系以及诱导和激活参与磷素吸收利用相关基因，特别是转录因子的表达。本文以前期克隆到的一个烟草PHR转录因子PHR1为研究对象，通过研究这两个基因的超表达和RNAi转基因材料在高磷和低磷营养液处理条件下对烟草的营养生长和磷素吸收的影响，初步揭示PHR转录因子是否调控烟草磷素营养的吸收利用。实验结果显示，PHR1基因在烟草叶片中表达强烈；在低磷条件下，抑制PHR1基因的表达显著影响烟草根系发生和植株生长，而在高磷条件下或增强PHR1基因的表达对植株生长和磷吸收无显著影响。
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关键字:PHR转录因子；烟草；磷素；基因表达
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2方法 3
1.2.1植物材料与生长条件3
1.2.2植株收获及表性观察3
1.2.3植株RNA提取及RT-PCR3
1.2.4实时定量荧光PCR4
1.2.5植物全磷测定 4
2结果与分析4
2.1表型分析4
2.2生理分析 5
2.3基因表达分析7
3讨论8
致谢8
参考文献9
附录A 植物组织中RNA的提取10
附录B RT-PCR（M-MLV反转录试剂盒）10
附录C 钼蓝比色法测定全磷含量 11
PHR转录因子对烟草磷吸收的影响
引言
引言
土壤中的磷大多数以无效态的形式存在，而能被植物吸收利用的有效态的磷含量通常在1μmol/L 左右，远不能满足植物获取充足磷营养的需求，这也是我国乃至全球农业生产中谷物产量的限制因素之一[1]。对于这个全球性的的缺磷问题，改善作物对磷素的吸收和利用在生态和经济方面都具有重要意义。研究植物对土壤中磷素吸收和利用的分子方面机理，挖掘如何高效吸收利用磷素营养的基因资源的方法,一直是全世界的重要研究方面。近年来,对于编码磷素转运蛋白的一系列基因的克隆及表达调控的研究,为了解高等植物复杂的磷素吸收和转运提供了大量的分子生物学基础[2]。
烟草作为模式植物无论是在基础研究还是应用研究都起了很大的作用，尤其是在遗传、繁育、生理、生化和后期 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
采收代谢方面。烟草种子数量多，品系之间特别容易杂交，尤其是它的染色体里有许多标记性基因，因此，是一种进行遗传学研究的绝佳研究材料。并且烟叶富含蛋白质，烟叶提取的蛋白可制作多种食品，有广泛用途，剩下的烟叶仍可用作卷烟原料。烟叶蛋白质比鸡蛋、乳酪和牛奶更适合人体吸收利用。而且烟草再生能力强，一年可多次收获，烟叶产量高，利用鲜烟叶提取蛋白，其亩产量可超过大豆，其他作物更无法相比。除此之外烟草对医疗研究也有重要作用，烟草硒蛋白对清除自由基、防护红细胞溶血、化学性肝损伤保护等方面都优于不含硒蛋白质，所以烟草硒蛋白有很好的发展前景。因此对深入研究烟草对磷吸收的分子机制有重要意义。
目前研究发现为了应对磷素缺乏的影响，植物在生长期的进化过程中形成了一系列的适应性机制如：植物应对缺磷状态做出了一系列适应性改变，如为了扩大根系吸收范围而使得侧根增多变长，根毛变长变密；植株矮小，生物量降低[3]；同时根系分泌有机酸降解难溶性磷供植物吸收；与根际微生物共生形成从枝菌根，通过微生物吸收营养[4]，以及诱导活化与磷吸收、运输和代谢相关基因的协同表达[5]。
近年来很多研究从功能基因组的角度，以模式作物拟南芥和水稻位研究对象，对磷胁迫诱导的差异基因表达谱、差异基因的功能类别、基因调控网络、非编码RNA以及植物激素参与的植物耐低磷调控机制等方面进行了一系列富有成效的研究，初步揭示了植物响应低磷胁迫的一些分子机制，发现低磷胁迫前后的基因变化涉及到几乎所有代谢途径，分离出了相关的磷转运子（如Pht1和Pht2家族基因）[6]、转录因子（如PHR1、PHR2、WRKY75）[7]等，并且解析了以PHR1转录因子为中心，包括小RNA（如miR399）在内的响应低磷信号的调控途径[8]。
但近年来的研究结果表明转录因子往往是以家族基因的形式存在，其成员的功能具有多样性，在不同作物中调控植物对低磷胁迫的响应方式和信号网络也有相当程度的差异性[9]。鉴于此，本课题以前期克隆到的一个烟草PHR转录因子为研究对象，通过超表达和RNAi转基因材料和野生型材料在高磷和低磷营养条件下的生理和分子反应差异，拟初步揭示PHR转录因子是否参与调控烟草的磷素营养吸收以及可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
供试作物：野生型烟草（云烟82）、烟草PHR1 超表达材料：OE3-1、OE4-1、OE1-2，以及烟草PHR1 RNAi材料：RNAi40-6、RNAi17-3、RNAi2-1。
1.2 方法
1.2.1 植物材料与生长条件
将烟草种子用75%乙醇浸泡45s消毒，用10%NaClO浸泡10min，然后用无菌水洗涤5-6次除去表面残留的NaClO，放在灭菌的吸水纸上吹干，吹干后点种在灭菌的MS培养基上，以上操作均在超净工作台完成，然后将平皿放入28℃组培室培养，待叶片展开，转入砂培。作物用完全营养液炼苗一周，然后用+P营养液和-P营养液进行处理一个月。烟草砂培营养液：高磷（+P）营养液的配方及浓度为：2 mM KNO3，1 mM NH4NO3，1 mM NaH2PO4，0.5 mM Ca(NO3)2，0.25 mM CaCl2 。低磷（-P）营养液的配方及浓度为：2 mM KNO3，1 mM NH4NO3，0.25 mM NaH2PO4，0.5 mM Ca( *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
NO3)2，0.25 mM CaCl2 。
1.2.2 植株收获采样及表型观察
收获采样时将植株在清水和去离子水中清洗干净除去沙土然后用吸水纸擦干，观察并且拍照记录植株大小以及根系形态。然后将地下部和地上部分开采样并分别记录鲜重。一部分样品采样后立即用液氮速冻并置于-70℃冰箱保存，以备提取RNA作表达量差异的分析。另一部分样品经105℃烘烤杀青30分钟后于70℃烘烤72小时称干重，分析生物量、根冠比以及一些其它的生理数据。
1.2.3 植株RNA的提取及RT-PCR
将存储在-70℃冰箱保存的植物样品根据附录一Ttizol试剂盒提取植物总RNA的方法提取植物RNA，测定RNA浓度后，反转录成cDNA，反转录操作根据M-MLV反转录试剂盒方法（附录二），最后用内参基因PCR观察反转录效果，PCR体系20μl体系：正反引物各0.5μl，PCR Mix10μl，模板1μl，ddH2O8μl。反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s，55℃退火30s,72℃延伸30s,共30个循环；72℃总体延伸7min.以备用于后续实时定量荧光PCR。
1.2.4 实时荧光定量PCR
将反转录的cDNA20倍稀释后根据实时荧光定量PCR试剂盒操作方法进行操作，定量PCR扩增仪及PCR用96孔板为Bio-Rad公司产品，反应体系为20 μl： TaKaRa SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μl，ROX Reference Dye 0.4μl，正向及反向引物各0.8μl，cDNA 模板1.5 μl，dd H2O 6.5μl。反应条件为：95℃预变性1min；PCR:95℃变性5 s，60℃退火30s共40个循环；95℃延伸15s，60℃30s，95℃15s。反应完成后，进行数据分析。
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