芝麻受青枯雷尔菌氏诱导转录组分析
：由青枯雷尔氏菌引起的芝麻青枯病是我国南方芝麻的重要细菌性病害，严重影响了芝麻的产量和品质，解析该细菌的致病机制才有可能找到抗病策略。本研究利用RNA-seq技术对未受该菌侵染（S0）和受侵染后发病前期（S1），发病中期（S2）芝麻茎部转录组进行高通量测序，且每个时期做了两个生物学重复。质控后获得大量clean reads，按照有参考基因组测序流程和数据分析方法，进行reads mapping，之后再进行两两差异比较(S0_S1,S0_S2,S1_S2），结果得到4367个unigene在受青枯菌诱导后差异表达，三个比较组之间有213个共同差异基因，S2与S0间的差异表达基因最多，各比较组的差异表达基因中，下调的基因数目均比上调基因的数目要多。通过对差异基因的GO注释分析，各时期间差异基因在3大分类体系中的分布大致相同。上调基因GO功能富集主要为防卫反应，胁迫应答，氧化还原酶活性等。KEGG注释中，差异表达基因富集最多的是淀粉与蔗糖代谢，而且对应的下调基因是上调基因的2倍多。目前国内外关于青枯病相关的研究大多集中在马铃薯、番茄等经济作物或拟南芥、烟草等模式植物中，对于芝麻青枯病的研究很少，所以开展芝麻青枯病相关的研究具有重要意义，本实验结果为研究芝麻与青枯菌互作的分子机制提供了有力的数据基础和证据。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Keywords 3
引言 3
1.材料与方法 5
1.1 实验材料 5
1.2 测序材料准备 5
1.3 RNA的提取 5
1.4 总RNA样品质量检测 5
1.5 测序cDNA文库的构建 5
1.6生物信息学处理与分析 6
2.结果与分析 7
2.1 RNA样品制备的质量检测 7
2.2测序产品质控和mapping结果 7
2.3 差异表达分析 7
2.4 GO分类图 9
2.5 KEGG分析 11
2.6差异表达聚类分析 12
3讨论 12
致谢 13
参考文献 13
芝麻受青枯雷尔氏菌诱
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
导转录组分析
引言
引言
芝麻属胡麻科，为一年生草本植物，是世界上一种古老的含油量高的十分重要的油料作物，把其成为油料作物中的皇后[1]，其种子含油量为在55%左右，蛋白质含量在25%左右，并且含有丰富的维生素 E、芝麻酚 等天然的抗氧化物质。中国芝麻年种植位于世界首位，面积达 80 万公顷，总产量有75万吨。芝麻在我国的种植历史悠久，应用价值极高，被用于生活各种方面，市场需求极高，有着广阔的消费群体，我国许多的传统食品都用其作为原料。
青枯病俗语被称为“芝麻瘟”，由青枯雷尔氏菌引起的芝麻青枯病是我国南方芝麻的重要细菌性病害，根据统计，仅江西省樟树、都昌、进贤、丰城、鄱阳等5个芝麻主要生产地青枯病年发生面积约达9000 hm2。大多数田块的发病率在15%左右，情况严重的田块可达60% 或者更高。青枯病的连年发生严重影响了芝麻的产量和品质，给各地的芝麻产业造成了非常大的经济损失，严重制约了这一特色优势产业的不断发展[2]。芝麻正常情况下不会再幼苗期发病，到了生长中后期才会渐渐发现有青枯病的发生。刚发病时，会有暗绿色的病斑点出现在芝麻的茎杆上，之后随着病情的加重，深黑色的条状斑纹也会出现在茎杆上。有菌脓存在于植株的茎内外部，剖开茎部可观察到维管束组织为褐色并伴随有流出来的白色的菌脓，这些特征是辨别的主要标准，到最后病部会到达至茎的髓部，导致茎杆的空洞化，如果此时拔起病株可以看见植株根部也已经变为褐色[3]。目前主要通过农业防治和药剂防治来针对青枯病的发生，但结果都不太如人意。解析该细菌的分子致病机制以及芝麻的感病基因，可以提供新的抗病策略。
青枯菌属于土壤病菌，一般情况下，青枯病菌是从植物根部和次生根的伤口或自然裂口入侵，接着在细胞间隙和内皮层快速繁殖造成植物发病。当植物生长时，在主根的表皮和次生根的根冠之间会形成一层鞘，青枯菌能够穿过这层鞘进入到皮层细胞的间隙，破坏掉细胞之间的中胶层，使细胞壁分解，变形并形成空腔，接着入侵木质部的薄壁组织，位于导管附近的细胞由于受到刺激会形成侵填体并转移进入导管中，在侵填体破裂后，释放出来的青枯菌进入导管，在导管内快速繁殖和扩张，从而引起植株萎蔫死亡[4]。有关青枯病菌移动至植物顶部的具体机制至今还不是非常了解，但是可以确定的是青枯菌通过Ⅲ型和Ⅱ型分泌系统产生胞外多糖（extracellular polysaccharide， EPS）是青枯菌移动至植物顶部的必要条件[5]。
Ⅲ型分泌系统（type III secretion system ，T3SS）是由hrp基因编码，其功能是将分泌因子包括很多致病因子分泌到细胞外[6]。在Ⅲ型分泌系统中，以转运蛋白为载体，将效应蛋白送入植物细胞发挥作用，其间要经过细菌的纤毛，肽聚糖组成的磷脂酸分子层，植物细胞膜外的细胞壁。在青枯雷尔氏菌中，已经鉴定出PopF1和PopF2两个Ⅲ型分泌系统转运蛋白，这两个蛋白在蛋白转运和致病性上有着重要的作用[7]。Ⅱ型分泌系统（type II secretion system ，T2SS）是一种常规的代谢途径，主要分布在革兰氏阴性细菌中，可以向细胞外分泌胞外酶，毒素，蛋白酶和毒性因子等多种蛋白。与Ⅱ型分泌系统相关的蛋白有14种左右，通过分泌途径转膜蛋白基因簇，经过2步把蛋白转移运输到细胞外。
转录组学研究相关的测序技术主要包括Sanger法测序，基因芯片和第二代测序技术。因为Sanger法测序的通量不能够满足转录组快速而深入的研究需求，测序的成本又比较高，基因芯片技术存在特异性低，灵敏度差，不适合低丰度基因的检测，价格昂贵等缺点，获得一种高速、全面、准确并且成本低的研究方法对于科学家来说十分迫切。第二代测序技术（next generation sequencing，NGS）就是在这样的背景下诞生，不仅继承了第一代测序技术的准确性的优点，同时增加了低成本和高通量的优点，为准确快速全面解析生物基因组信息提供了可靠的保障和技术的支持。目前为止，已经有3个比较成熟的商业测序平台，它们是Illumina公司的Solexa、ABI公司的SOLid测序平台和Roche公司的454测序平台。
转录组指的是在特定的细胞或组织在特定时间或状态下转录出来的所有RNA。转录组的概念中包含着时间和空间的范畴，相同的组织部位在不一样的生活环境和处于不同生长阶段下，其本身转录本的表达情况是不同的，与基因组有所不同[8]。
转录组测序（RNASeq）是将第二代测序技术用于转录组的研究中。这种研究方法是快速的和简单的。RNAseq是深度高通量测序，能够达到单核苷酸水平，快速获几乎所有的转录本，通过分析转录本的结构，发现新基因，研究非编码区域功能，开发编码区的分子标记等，可以发现寻找到很多信息。对有参考基因组的物种，转录组测序数据可以丰富基因组注释信息，对于没有参考基因组的非模式物种，可以进行 De novo Sequencing，是基因表达和转录组分析的重要手段，现已在生物学，医学和药物的研发中发挥重要作用[9]。芝麻的基础研究起步较晚，国内外关于芝麻青枯病的研究报道较少，本研究通过Illumina/Solexa测序技术对青枯雷尔氏菌诱导下的前期，中期芝麻茎部以及未处理对照芝麻茎部进行高通量转录组测序，map到芝麻基因组并进行序列信息比对，根据基因表达量不同，筛选出不同时期之间的差异表达基因，进行基因注释等分析来研究芝麻受青枯雷尔氏菌诱导后转录组变化，对芝麻抗青枯病研究发展起到重要作用。
1.材料与方法
1.1 实验材料
青枯病菌为我国江西芝麻发病植株分离得到的菌种，实验所用芝麻品种为E1180。
1.2 测序材料准备
种植芝麻E1180于光照培养箱，光照12 h，60%lux，40到50天幼苗时用伤根灌注法接青枯病菌，分别对未接菌的芝麻茎部和对发病时23片真叶和35对叶时的芝麻茎部取样，然后迅速放于70℃超低温冰箱中冷冻，用于后续的提取RNA，每个时期做两个生物学重复。样品名称分别为S0，S1，S2。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Keywords 3
引言 3
1.材料与方法 5
1.1 实验材料 5
1.2 测序材料准备 5
1.3 RNA的提取 5
1.4 总RNA样品质量检测 5
1.5 测序cDNA文库的构建 5
1.6生物信息学处理与分析 6
2.结果与分析 7
2.1 RNA样品制备的质量检测 7
2.2测序产品质控和mapping结果 7
2.3 差异表达分析 7
2.4 GO分类图 9
2.5 KEGG分析 11
2.6差异表达聚类分析 12
3讨论 12
致谢 13
参考文献 13
芝麻受青枯雷尔氏菌诱
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
导转录组分析
引言
引言
芝麻属胡麻科，为一年生草本植物，是世界上一种古老的含油量高的十分重要的油料作物，把其成为油料作物中的皇后[1]，其种子含油量为在55%左右，蛋白质含量在25%左右，并且含有丰富的维生素 E、芝麻酚 等天然的抗氧化物质。中国芝麻年种植位于世界首位，面积达 80 万公顷，总产量有75万吨。芝麻在我国的种植历史悠久，应用价值极高，被用于生活各种方面，市场需求极高，有着广阔的消费群体，我国许多的传统食品都用其作为原料。
青枯病俗语被称为“芝麻瘟”，由青枯雷尔氏菌引起的芝麻青枯病是我国南方芝麻的重要细菌性病害，根据统计，仅江西省樟树、都昌、进贤、丰城、鄱阳等5个芝麻主要生产地青枯病年发生面积约达9000 hm2。大多数田块的发病率在15%左右，情况严重的田块可达60% 或者更高。青枯病的连年发生严重影响了芝麻的产量和品质，给各地的芝麻产业造成了非常大的经济损失，严重制约了这一特色优势产业的不断发展[2]。芝麻正常情况下不会再幼苗期发病，到了生长中后期才会渐渐发现有青枯病的发生。刚发病时，会有暗绿色的病斑点出现在芝麻的茎杆上，之后随着病情的加重，深黑色的条状斑纹也会出现在茎杆上。有菌脓存在于植株的茎内外部，剖开茎部可观察到维管束组织为褐色并伴随有流出来的白色的菌脓，这些特征是辨别的主要标准，到最后病部会到达至茎的髓部，导致茎杆的空洞化，如果此时拔起病株可以看见植株根部也已经变为褐色[3]。目前主要通过农业防治和药剂防治来针对青枯病的发生，但结果都不太如人意。解析该细菌的分子致病机制以及芝麻的感病基因，可以提供新的抗病策略。
青枯菌属于土壤病菌，一般情况下，青枯病菌是从植物根部和次生根的伤口或自然裂口入侵，接着在细胞间隙和内皮层快速繁殖造成植物发病。当植物生长时，在主根的表皮和次生根的根冠之间会形成一层鞘，青枯菌能够穿过这层鞘进入到皮层细胞的间隙，破坏掉细胞之间的中胶层，使细胞壁分解，变形并形成空腔，接着入侵木质部的薄壁组织，位于导管附近的细胞由于受到刺激会形成侵填体并转移进入导管中，在侵填体破裂后，释放出来的青枯菌进入导管，在导管内快速繁殖和扩张，从而引起植株萎蔫死亡[4]。有关青枯病菌移动至植物顶部的具体机制至今还不是非常了解，但是可以确定的是青枯菌通过Ⅲ型和Ⅱ型分泌系统产生胞外多糖（extracellular polysaccharide， EPS）是青枯菌移动至植物顶部的必要条件[5]。
Ⅲ型分泌系统（type III secretion system ，T3SS）是由hrp基因编码，其功能是将分泌因子包括很多致病因子分泌到细胞外[6]。在Ⅲ型分泌系统中，以转运蛋白为载体，将效应蛋白送入植物细胞发挥作用，其间要经过细菌的纤毛，肽聚糖组成的磷脂酸分子层，植物细胞膜外的细胞壁。在青枯雷尔氏菌中，已经鉴定出PopF1和PopF2两个Ⅲ型分泌系统转运蛋白，这两个蛋白在蛋白转运和致病性上有着重要的作用[7]。Ⅱ型分泌系统（type II secretion system ，T2SS）是一种常规的代谢途径，主要分布在革兰氏阴性细菌中，可以向细胞外分泌胞外酶，毒素，蛋白酶和毒性因子等多种蛋白。与Ⅱ型分泌系统相关的蛋白有14种左右，通过分泌途径转膜蛋白基因簇，经过2步把蛋白转移运输到细胞外。
转录组学研究相关的测序技术主要包括Sanger法测序，基因芯片和第二代测序技术。因为Sanger法测序的通量不能够满足转录组快速而深入的研究需求，测序的成本又比较高，基因芯片技术存在特异性低，灵敏度差，不适合低丰度基因的检测，价格昂贵等缺点，获得一种高速、全面、准确并且成本低的研究方法对于科学家来说十分迫切。第二代测序技术（next generation sequencing，NGS）就是在这样的背景下诞生，不仅继承了第一代测序技术的准确性的优点，同时增加了低成本和高通量的优点，为准确快速全面解析生物基因组信息提供了可靠的保障和技术的支持。目前为止，已经有3个比较成熟的商业测序平台，它们是Illumina公司的Solexa、ABI公司的SOLid测序平台和Roche公司的454测序平台。
转录组指的是在特定的细胞或组织在特定时间或状态下转录出来的所有RNA。转录组的概念中包含着时间和空间的范畴，相同的组织部位在不一样的生活环境和处于不同生长阶段下，其本身转录本的表达情况是不同的，与基因组有所不同[8]。
转录组测序（RNASeq）是将第二代测序技术用于转录组的研究中。这种研究方法是快速的和简单的。RNAseq是深度高通量测序，能够达到单核苷酸水平，快速获几乎所有的转录本，通过分析转录本的结构，发现新基因，研究非编码区域功能，开发编码区的分子标记等，可以发现寻找到很多信息。对有参考基因组的物种，转录组测序数据可以丰富基因组注释信息，对于没有参考基因组的非模式物种，可以进行 De novo Sequencing，是基因表达和转录组分析的重要手段，现已在生物学，医学和药物的研发中发挥重要作用[9]。芝麻的基础研究起步较晚，国内外关于芝麻青枯病的研究报道较少，本研究通过Illumina/Solexa测序技术对青枯雷尔氏菌诱导下的前期，中期芝麻茎部以及未处理对照芝麻茎部进行高通量转录组测序，map到芝麻基因组并进行序列信息比对，根据基因表达量不同，筛选出不同时期之间的差异表达基因，进行基因注释等分析来研究芝麻受青枯雷尔氏菌诱导后转录组变化，对芝麻抗青枯病研究发展起到重要作用。
1.材料与方法
1.1 实验材料
青枯病菌为我国江西芝麻发病植株分离得到的菌种，实验所用芝麻品种为E1180。
1.2 测序材料准备
种植芝麻E1180于光照培养箱，光照12 h，60%lux，40到50天幼苗时用伤根灌注法接青枯病菌，分别对未接菌的芝麻茎部和对发病时23片真叶和35对叶时的芝麻茎部取样，然后迅速放于70℃超低温冰箱中冷冻，用于后续的提取RNA，每个时期做两个生物学重复。样品名称分别为S0，S1，S2。
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