smetr2基因的克隆及其在盐胁迫下的表达模式分析
乙烯是一种非常重要的气体植物激素，在植株生长发育的各个阶段都发挥着不可或缺的作用。且作为一种逆境激素，乙烯还能够发挥信号分子的功能，参与应答盐胁迫。作为乙烯感知和信号转导过程中的关键信号因子之一，乙烯受体在植物响应盐胁迫的过程中十分重要。本文以实验室前期研究发现的茄子乙烯受体基因SmETR2为研究对象，采用PCR方法对其克隆，并分析了它在盐胁迫下的表达模式。序列分析显示，SmETR2基因的开放阅读框为2041 bp，编码681个氨基酸。基因表达分析表明，较低的盐浓度会诱导该基因表达，而高浓度盐胁迫则会抑制其表达。此外，外施乙烯同样会抑制SmETR2的表达，说明SmETR2在茄子响应盐胁迫的过程中发挥着不可或缺的作用。这些结果为进一步研究SmETR2耐盐的分子机制打下基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
一、材料与方法1
（一）材料与准备1
（二）生物信息学分析1
（三）基因克隆3
（四）基因的表达分析3
（五）过表达载体的构建4
二、结果与分析 4
（一）SmETR2基因全长的克隆及序列分析4
（二）SmETR2基因编码蛋白分析6
（三）SmETR2氨基酸序列的保守结构域预测6
（四）SmETR2蛋白质二级结构的预测6
（五）SmETR2 基因编码蛋白的三级结构6
（六）SmETR2氨基酸同源序列比对7
（七）SmETR2的系统发育分析10
（八）SmETR2基因的组织表达分析10
（九）pCMBIA1304 SmETR2表达载体的构建11
（十）盐胁迫和乙烯处理对SmETR2基因表达的影响11
三、讨论12
致谢13
参考文献14
SmETR2基因的克隆及其在盐胁迫下的表达模式分析
命基141 金嘉玉
引言
（一）材料与准备
1．植物材料
茄子品 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
种为“苏琦1号”（Solanum melongena L. cv. Suqi），我们的种子购自江苏省农科院，为当地普遍种植品种。挑选颗粒较为饱满的茄种，把它浸泡在1mg/mL的GA3中，37 ℃保温2天后，用纱布将种子表面的液体擦拭干净，再用蒸馏水冲洗几遍，再在37 ℃的蒸馏水中浸泡1天，然后用蒸馏水冲洗3遍，待其解除休眠后，用75%的酒精表面消毒30 s；弃去酒精，再用10%的次氯酸钠溶液消毒15分钟；弃去次氯酸钠溶液，用无菌水清洗35次；用无菌滤纸吸干苏琦茄种表面的无菌水，接种在200 mgL1Cef的固体MS培养基中。在28±2℃黑暗环境下培养5天，等其发芽时将其置于16 h 、28 ℃光照，8 h、20 ℃黑暗的条件下培养。待生长为4~5片真叶时，选择长势一致的茄子幼苗用于RNA的提取以及盐胁迫处理和乙烯处理。
2．菌株和载体
载体构建过程中用到的pMD19T克隆载体购于TaKaRa公司、表达载体pCMBIA1304、大肠杆菌DH5α和土壤农杆菌GV3101均为本实验室保存。
3．培养基
LB液体培养基、LB固体培养基、固体MS培养基。
（二）生物信息学分析
使用NCBI的BLAST程序对SmETR2 进行序列同源性比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。使用NCBI的ORFfinder(http://www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html)程序完成开放阅读框架预测。使用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）完成蛋白质一级结构的预测。使用PHYRE2Protein Homology/analogY Recognition Engine（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）完成蛋白质二级结构的预测。使用Smart（http://smart.emblheidelberg.de/）分析预测氨基酸序列的保守结构域。利用Hopfield神经网络（http://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）预测蛋白质的二级结构。由SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）实现蛋白质三级结构的预测。系统进化树由MEGA7.0程序构建，采用maximum likelihood作图。
（三）基因克隆
首先采用Trizol法从组培苗中提取总RNA，用反转录试剂盒(PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit)合成cDNA第1链，作为后续PCR扩增模板。根据SmETR2的序列利用 Primer5 软件设计扩增SmETR2全长序列的引物进行PCR扩增，SmETR2扩增次序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物在百分之一的琼脂糖凝胶中电泳，我们使用胶回收试剂盒的说明书将目的片段2100 bp回收，然后我们将SmETR2片段连接到T 载体，并用热激法转化入大肠杆菌 DH5α，经抗生素筛选以及PCR检测，最终将阳性克隆送至华大基因公司测序。
（四）基因的表达分析
1．茄子总RNA的提取
使用TakaRa RNA 提取专用试剂盒对苏琦茄苗各组织及乙烯和盐胁迫处理后的茄子幼苗不同时间段采样进行RNA提取。操作过程中所用到的枪头、eppendorf各规格离心管等，均用0.1%DEPC水于37 ℃浸泡过夜，使用121 ℃高温高压灭菌半小时，所使用的水为RNAasefree H2O。取5 ul溶解后的RNA加入loading buffer在15％琼脂糖凝胶上进行点样，150 v稳压下电泳15 min，检测RNA完整性。
2． cDNA第一条链的合成
cDNA合成体系参照大连TaKaRa宝生物工程有限公司说明书，步骤如下：在EP管中加入8 uL的目的RNA和2 uL的Oligo DT，70 ℃保温10 min后，冰上放置1 min，瞬时离心后加入以下各试剂：
组分
用量
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
一、材料与方法1
（一）材料与准备1
（二）生物信息学分析1
（三）基因克隆3
（四）基因的表达分析3
（五）过表达载体的构建4
二、结果与分析 4
（一）SmETR2基因全长的克隆及序列分析4
（二）SmETR2基因编码蛋白分析6
（三）SmETR2氨基酸序列的保守结构域预测6
（四）SmETR2蛋白质二级结构的预测6
（五）SmETR2 基因编码蛋白的三级结构6
（六）SmETR2氨基酸同源序列比对7
（七）SmETR2的系统发育分析10
（八）SmETR2基因的组织表达分析10
（九）pCMBIA1304 SmETR2表达载体的构建11
（十）盐胁迫和乙烯处理对SmETR2基因表达的影响11
三、讨论12
致谢13
参考文献14
SmETR2基因的克隆及其在盐胁迫下的表达模式分析
命基141 金嘉玉
引言
（一）材料与准备
1．植物材料
茄子品 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
种为“苏琦1号”（Solanum melongena L. cv. Suqi），我们的种子购自江苏省农科院，为当地普遍种植品种。挑选颗粒较为饱满的茄种，把它浸泡在1mg/mL的GA3中，37 ℃保温2天后，用纱布将种子表面的液体擦拭干净，再用蒸馏水冲洗几遍，再在37 ℃的蒸馏水中浸泡1天，然后用蒸馏水冲洗3遍，待其解除休眠后，用75%的酒精表面消毒30 s；弃去酒精，再用10%的次氯酸钠溶液消毒15分钟；弃去次氯酸钠溶液，用无菌水清洗35次；用无菌滤纸吸干苏琦茄种表面的无菌水，接种在200 mgL1Cef的固体MS培养基中。在28±2℃黑暗环境下培养5天，等其发芽时将其置于16 h 、28 ℃光照，8 h、20 ℃黑暗的条件下培养。待生长为4~5片真叶时，选择长势一致的茄子幼苗用于RNA的提取以及盐胁迫处理和乙烯处理。
2．菌株和载体
载体构建过程中用到的pMD19T克隆载体购于TaKaRa公司、表达载体pCMBIA1304、大肠杆菌DH5α和土壤农杆菌GV3101均为本实验室保存。
3．培养基
LB液体培养基、LB固体培养基、固体MS培养基。
（二）生物信息学分析
使用NCBI的BLAST程序对SmETR2 进行序列同源性比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。使用NCBI的ORFfinder(http://www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html)程序完成开放阅读框架预测。使用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）完成蛋白质一级结构的预测。使用PHYRE2Protein Homology/analogY Recognition Engine（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）完成蛋白质二级结构的预测。使用Smart（http://smart.emblheidelberg.de/）分析预测氨基酸序列的保守结构域。利用Hopfield神经网络（http://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）预测蛋白质的二级结构。由SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）实现蛋白质三级结构的预测。系统进化树由MEGA7.0程序构建，采用maximum likelihood作图。
（三）基因克隆
首先采用Trizol法从组培苗中提取总RNA，用反转录试剂盒(PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit)合成cDNA第1链，作为后续PCR扩增模板。根据SmETR2的序列利用 Primer5 软件设计扩增SmETR2全长序列的引物进行PCR扩增，SmETR2扩增次序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物在百分之一的琼脂糖凝胶中电泳，我们使用胶回收试剂盒的说明书将目的片段2100 bp回收，然后我们将SmETR2片段连接到T 载体，并用热激法转化入大肠杆菌 DH5α，经抗生素筛选以及PCR检测，最终将阳性克隆送至华大基因公司测序。
（四）基因的表达分析
1．茄子总RNA的提取
使用TakaRa RNA 提取专用试剂盒对苏琦茄苗各组织及乙烯和盐胁迫处理后的茄子幼苗不同时间段采样进行RNA提取。操作过程中所用到的枪头、eppendorf各规格离心管等，均用0.1%DEPC水于37 ℃浸泡过夜，使用121 ℃高温高压灭菌半小时，所使用的水为RNAasefree H2O。取5 ul溶解后的RNA加入loading buffer在15％琼脂糖凝胶上进行点样，150 v稳压下电泳15 min，检测RNA完整性。
2． cDNA第一条链的合成
cDNA合成体系参照大连TaKaRa宝生物工程有限公司说明书，步骤如下：在EP管中加入8 uL的目的RNA和2 uL的Oligo DT，70 ℃保温10 min后，冰上放置1 min，瞬时离心后加入以下各试剂：
组分
用量
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