拟南芥carop11与nadph氧化酶rbohf相互作用调控ros产生和根毛发育的研究
：植物NADPH氧化酶，也被称为呼吸爆发氧化酶同系物（Rbohs），是重要的活性氧（ROS）生成系统。在本研究中，我们发现，激活型的CA-ROP11与 RbohF可发生相互作用，而RbohF中L336或L337氨基酸突变则会抑制其与CA-ROP11的互作。在烟草中，与CA-ROP11和突变型 RbohF的共同表达或DN-ROP11与野生型 RbohF的共同表达相比，CA-ROP11与野生型 RbohF的共同表达会促进ROS的产生。此外，CA-ROP11过度表达则会导致拟南芥中ROS的积累和根毛肿涨，而RbohF基因的敲除则能显著减少ROS的增加。上述研究表明，在根毛发育过程，ROP11通过和RbohF的相互作用调节ROS的产生和根毛发育。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1．2 基因型分析 2
1．3 半定量RTPCR和实时荧光定量PCR 2
1．4 酵母双杂交分析 2
1．5 体外pulldown实验 3
1．6 双分子荧光互补分析 3
1．7 DAB染色 3
1．7．1 农杆菌介导的N.benthamiana瞬时表达分析 3
1．7．2 DAB染色 3
1．8 GUS活性的组织化学检测 4
1．9 根毛分析 4
1．9．1 根毛分析 4
1．9．2 DPI处理 4
2 结果与分析 4
2．1 CAROP11直接与RbohF的N末端细胞质区域作用 4
2．2 CAROP11与RbohF结合位点的鉴定 5
2．3 CAROP11和RbohF的相互作用促进ROS的产生 6
2．4 在根毛的发育过程中由CAROP11介导产生的ROS的产量依赖于RbohF 7
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 10
拟南芥CAROP11与NADPH氧化
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
酶RbohF相互作用调控ROS产生和根毛发育的研究
引言
在真核细胞中，活性氧物种（ROS）是重要的信号分子[1]。植物NADPH氧化酶，也被称为呼吸爆发氧化酶同系物，是一种与哺乳动物嗜中性粒细胞gp91phox同源的氧化还原酶。拟南芥基因组有10个基因编码Rboh蛋白。根毛（RbohC）和初生根（RbohF）的发育都需要Rbohs[2]，植物的防御反应及脱落酸（ABA）诱导的气孔关闭也需要RbohD和RbohF[3]。
Rboh拥有6个跨膜蛋白结构域，在C末端区域[4]，它含有黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和NADPH结合域。在N末端区域，它含有两个与钙离子结合的EFhand结合域[4，5]，脂质结合基序[6]，被CDPKs 和CIPKs磷酸化的丝氨酸残基，及被Rac GTPase绑定的结构域[7]。
ROP蛋白是植物中参与一系列生理过程的Rho相关GTP酶[810]。ROPs的功能相当于分子开关，它存在于GTP结合的“开”状态和GDP结合的“关闭”状态。例如，被激活的ROP11能诱导皮层微管的解聚。相反，皮层微管可以促使ROP11从质膜上分离。这种活跃的ROP和皮层微管之间的相互作用促使微管产生不同的空间格局，从而决定了次生壁的形态和细胞形态。而且活性ROP11还可以破坏肌动蛋白细胞骨架和膜循环组织，导致根毛膨胀和叶表皮细胞变形[11]。ROP11还与调控钙参与的PH变化从而调节根毛生长。
RAC/ROP GTP酶和Rboh互作的研究表明CAOsRac1结合到 OsRbohB的N末端区域，而该结合对激活NADPH氧化酶的活性是很重要的[7]。然而，对RAC/ROP GTP酶和Rboh的相互作用的遗传学证据仍然缺乏。除此之外，这种作用的生理功能也尚不可知。在这项研究中，我们发现CAROP11与RbohF相互作用主要发生在N末端胞质区的L336或l337残基，而且这种相互作用促进了拟南芥根毛中ROS的生成。
1 材料和方法
1.1 植物材料
这次研究中使用的是拟南芥（哥伦比亚型）和烟草，它们将会在23°C下在生长箱中（12小时光照/12小时黑暗）。
1.2 基因型分析
ROP11 (At5G62880)的编码序列是从拟南芥叶片的cDNA中 PCR克隆并连接到相应的目的载体。
利用快速变化定向诱变试剂盒（Stratagene）来诱导ROP11中的定点突变。 Q66L型突变产生了ROP11的钙型——CAROP11，而D123A型突变产生则了显性失活ROP11突变体——DNROP11。
将CAROP11 和DNROP11插入到pSuper1300 载体。
重组体通过电穿孔进入根癌农杆菌（GV3101）。
通过花序浸渍法将根癌农杆菌转化进入野生型或RbohF突变型植物。
利用含有25μg／ml潮霉素的MS培养基筛选出转基因植物。T3代纯合株系用于后续实验。
1.3 半定量RTPCR和实时荧光定量PCR
根据制造商的说明利用Trizol试剂从幼苗中提取出总RNA。
采用cDNA合成试剂盒PrimeScript合成cDNA。
分别利用引物ROP11RT F/R 和 RbohFRT F/R对ROP11 和 RbohF进行半定量RTPCR，以此测定其在不同基因型中的转录水平。利用Actin2作为内部控制。
利用引物RbohFqRT F/R 对不同基因型中的RbohF进行实时荧光定量PCR。
1.4 酵母双杂交分析
II型ROP GTP酶的高变域包含一个独特的GCCG盒的序列。GCCG盒中的两个Cys残基通过S酰化反应来锚定蛋白质膜。因此，C末端的半胱氨酸丝氨酸突变是在CAROP11 和DNROP11突变体中进行的。RbohF的编码序列（At1g64060）是由拟南芥叶片中提取的cDNA克隆出来的[6]。利用快速变化的定点突变试剂盒（Stratagene）在RbohFN产生突变。
将ROP11，CAROP11 和DNROP111插入到结合域载体（BD，pGBKT7）中。
将RbohCN, RbohDN, RbohFN和序列片段及突变体插入到激活结构域载体（AD，pGADT7）。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1．2 基因型分析 2
1．3 半定量RTPCR和实时荧光定量PCR 2
1．4 酵母双杂交分析 2
1．5 体外pulldown实验 3
1．6 双分子荧光互补分析 3
1．7 DAB染色 3
1．7．1 农杆菌介导的N.benthamiana瞬时表达分析 3
1．7．2 DAB染色 3
1．8 GUS活性的组织化学检测 4
1．9 根毛分析 4
1．9．1 根毛分析 4
1．9．2 DPI处理 4
2 结果与分析 4
2．1 CAROP11直接与RbohF的N末端细胞质区域作用 4
2．2 CAROP11与RbohF结合位点的鉴定 5
2．3 CAROP11和RbohF的相互作用促进ROS的产生 6
2．4 在根毛的发育过程中由CAROP11介导产生的ROS的产量依赖于RbohF 7
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 10
拟南芥CAROP11与NADPH氧化
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
酶RbohF相互作用调控ROS产生和根毛发育的研究
引言
在真核细胞中，活性氧物种（ROS）是重要的信号分子[1]。植物NADPH氧化酶，也被称为呼吸爆发氧化酶同系物，是一种与哺乳动物嗜中性粒细胞gp91phox同源的氧化还原酶。拟南芥基因组有10个基因编码Rboh蛋白。根毛（RbohC）和初生根（RbohF）的发育都需要Rbohs[2]，植物的防御反应及脱落酸（ABA）诱导的气孔关闭也需要RbohD和RbohF[3]。
Rboh拥有6个跨膜蛋白结构域，在C末端区域[4]，它含有黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和NADPH结合域。在N末端区域，它含有两个与钙离子结合的EFhand结合域[4，5]，脂质结合基序[6]，被CDPKs 和CIPKs磷酸化的丝氨酸残基，及被Rac GTPase绑定的结构域[7]。
ROP蛋白是植物中参与一系列生理过程的Rho相关GTP酶[810]。ROPs的功能相当于分子开关，它存在于GTP结合的“开”状态和GDP结合的“关闭”状态。例如，被激活的ROP11能诱导皮层微管的解聚。相反，皮层微管可以促使ROP11从质膜上分离。这种活跃的ROP和皮层微管之间的相互作用促使微管产生不同的空间格局，从而决定了次生壁的形态和细胞形态。而且活性ROP11还可以破坏肌动蛋白细胞骨架和膜循环组织，导致根毛膨胀和叶表皮细胞变形[11]。ROP11还与调控钙参与的PH变化从而调节根毛生长。
RAC/ROP GTP酶和Rboh互作的研究表明CAOsRac1结合到 OsRbohB的N末端区域，而该结合对激活NADPH氧化酶的活性是很重要的[7]。然而，对RAC/ROP GTP酶和Rboh的相互作用的遗传学证据仍然缺乏。除此之外，这种作用的生理功能也尚不可知。在这项研究中，我们发现CAROP11与RbohF相互作用主要发生在N末端胞质区的L336或l337残基，而且这种相互作用促进了拟南芥根毛中ROS的生成。
1 材料和方法
1.1 植物材料
这次研究中使用的是拟南芥（哥伦比亚型）和烟草，它们将会在23°C下在生长箱中（12小时光照/12小时黑暗）。
1.2 基因型分析
ROP11 (At5G62880)的编码序列是从拟南芥叶片的cDNA中 PCR克隆并连接到相应的目的载体。
利用快速变化定向诱变试剂盒（Stratagene）来诱导ROP11中的定点突变。 Q66L型突变产生了ROP11的钙型——CAROP11，而D123A型突变产生则了显性失活ROP11突变体——DNROP11。
将CAROP11 和DNROP11插入到pSuper1300 载体。
重组体通过电穿孔进入根癌农杆菌（GV3101）。
通过花序浸渍法将根癌农杆菌转化进入野生型或RbohF突变型植物。
利用含有25μg／ml潮霉素的MS培养基筛选出转基因植物。T3代纯合株系用于后续实验。
1.3 半定量RTPCR和实时荧光定量PCR
根据制造商的说明利用Trizol试剂从幼苗中提取出总RNA。
采用cDNA合成试剂盒PrimeScript合成cDNA。
分别利用引物ROP11RT F/R 和 RbohFRT F/R对ROP11 和 RbohF进行半定量RTPCR，以此测定其在不同基因型中的转录水平。利用Actin2作为内部控制。
利用引物RbohFqRT F/R 对不同基因型中的RbohF进行实时荧光定量PCR。
1.4 酵母双杂交分析
II型ROP GTP酶的高变域包含一个独特的GCCG盒的序列。GCCG盒中的两个Cys残基通过S酰化反应来锚定蛋白质膜。因此，C末端的半胱氨酸丝氨酸突变是在CAROP11 和DNROP11突变体中进行的。RbohF的编码序列（At1g64060）是由拟南芥叶片中提取的cDNA克隆出来的[6]。利用快速变化的定点突变试剂盒（Stratagene）在RbohFN产生突变。
将ROP11，CAROP11 和DNROP111插入到结合域载体（BD，pGBKT7）中。
将RbohCN, RbohDN, RbohFN和序列片段及突变体插入到激活结构域载体（AD，pGADT7）。
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