拟南芥乙烯信号转导与应答通路中基因甲基化的生物信息学研究
：DNA甲基化修饰在多种生理活动中起重要作用，本实验用生物信息学的方法研究北半球30株野生型拟南芥乙烯信号通路涉及的16个基因不同区域甲基化位点分布情况，结果表明：拟南芥乙烯信号通路基因中，甲基化位点多分布在编码区和上游1000bp处，并且不同生态型的拟南芥甲基化分布存在差异。这说明乙烯信号通路基因可能受DNA甲基化调控。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）2
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.1.1参比序列3
1.1.2 目标序列3
1.2 方法 3
1.2.1获取拟南芥全基因组BSseq数据3
1.2.2查找拟南芥乙烯信号转导通路及其基因3
1.2.3获取乙烯信号通路基因序列4
1.2.4 Bismark软件序列比对获得各位点甲基化率4
1.2.5甲基化数据处理与分析4
2结果与分析4
2.1拟南芥乙烯信号通路基因4
2.2甲基化数据分析4
2.2.1甲基化位点多分布在编码区和上游1000bp处4
2.2.2同类基因在不同序列区域甲基化分布有差异5
2.2.3不同株野生型拟南芥相同基因甲基化分布存在差异5
3讨论6
3.1拟南芥乙烯信号通路基因可能通过甲基化机制调控6
3.2乙烯与其他途径的交叉反应可能共同决定了乙烯通路基因的甲基化状态7
3.3具体甲基化调控机制有待进一步实验验证7
致谢7
参考文献8
附录A Bismark软件本次实验运行使用的关键命令及参数9
附录B 各株野生型拟南芥中乙烯信号通路基因上游1000bp内甲基化位点数目10
拟南芥乙烯信号转导与应答通路中基因甲基化的生物信息学研究
引言
引言
DNA甲基化是存在于高等真核生物中重要的表观遗传机制，在植物基因组中，对称的CG位点、CHG位点和不对称的CHH位点均会发生5甲基胞嘧
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
啶甲基化修饰。对拟南芥基因组甲基化状态的分析获得了拟南芥甲基化图谱，整个基因组中CpG位点有24%被甲基化修饰，CHG和CHH位点分别为6.7%和1.7%[1]。DNA甲基化在多种生理活动中有重要作用——包括基因组印记[2]、转座元件沉默[3]、干细胞分化[4]、胚胎发育[5]等。在植物细胞中，DNA甲基化有两个重要作用——转座元件沉默和调控基因表达。在模式植物拟南芥中，DNA甲基化主要出现在散布的重复序列中，而局部串联或者反向的重复序列也常常被甲基化，转座子甲基化的减少通常会导致转座子的移动，体现了甲基化保护基因组的功能[6]。
在有些情况下，DNA甲基化也能调控基因的表达。FWA转录因子就是受DNA甲基化调控的例子，转录起始区域串联重复序列的甲基化导致了FWA基因只能在胚外内胚层表达而不能在植物的其他组织中表达。在植物细胞中，启动子区域的DNA甲基化通常抑制转录，但编码区的甲基化通常不影响基因表达[7]。最近的微阵列分析发现CG甲基化也能发生在基因的3’端，但是其功能未知[8]。
高通量测序技术和微阵列技术的发展使多样本和高分辨率的基因组甲基化作图成为可能，同时也对产生的大量数据的处理提出了挑战，目前DNA甲基化作图方法可分为三种：重亚硫酸盐高通量测序、重亚硫酸盐微阵列分析和基于DNA片段富集的方法[9]。本实验采用重亚硫酸盐高通量测序法，使用Babraham研究所开发的Bismark软件比对分析，从而可使甲基化作图达到单个碱基水平。Bismark软件具有比对速度快、支持双末端等特点[10]。
气态植物激素乙烯在植物生长发育以及应对生物和非生物胁迫中起着非常重要的作用：包括种子萌发、细胞伸长、果实成熟、器官衰老、细胞程序性死亡病原体攻击等[11] [12]。当对植物施加外源性的乙烯或者其前体1氨基环丙烷基羧酸（ACC）时，会诱发典型的“三重反应”。在模式植物拟南芥中表现为下胚轴和根细胞伸长的抑制、下胚轴横向膨胀和胚轴顶钩的过分弯曲[13]。根据反常的“三重反应”，研究人员筛选出很多拟南芥乙烯相关突变体。得益于对这些突变体的研究，从内质网膜上乙烯的感知到细胞核内转录调控的信号通路被发现[14]。郭红卫等将拟南芥对乙烯的响应分为三个层次，分别是早期事件、下游事件以及与其他信号之间的交互作用[15]。本文涉及的基因主要位于早期事件和下游事件。
在乙烯信号通路中，其中ETR1、ETR2、ERS1、ERS2、EIN4是乙烯受体，他们在氨基端即乙烯结合端同源性最高，与他们具有相似的乙烯结合能力一致[16]。CTR1的氨基端能与乙烯受体的羧基端结合，是乙烯反应的负调控元件[17]。EIN2是位于受体/CTR1复合物下游的乙烯反应的正调控元件[18]。EIN3是植物特有的转录因子，EIN3和EIL1是调节乙烯反应主要的转录因子[19]，而EIL1和EIL2在植物特定生长时期或特定组织中可能介导乙烯反应。生化反应表明EIN3和EIL1能直接结合到ERF1基因启动子部位。EBF1和EBF2是两类能调节EIN3蛋白稳定性的Fbox蛋白[20]。
植物激素信号转导和染色体修饰是网络状而不是线性的，多种调控通路和激素信号通路同时作用于染色体的甲基化修饰，因此很少文章报道激素信号与甲基化调控之间的关系[21]。但拟南芥基因组中有24%的CpG位点被甲基化修饰，植物激素信号转导很有可能受甲基化修饰调控。
本实验旨在用生物信息学方法初步探讨乙烯信号转导涉及主要基因是否受到甲基化调控。初步了解拟南芥中甲基化位点分布的规律，同时为筛选受甲基化调控基因提供一种简单、快速而又相对准确的方法，为后期的实验提供借鉴。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 参比序列 北半球30株的野生型拟南芥全基因组的亚硫酸氢盐序列（bisulfite sequencing）作为参比序列（reference genome）。
1．1．2 目标序列 即希望获得甲基化位点分布情况的序列，本实验为拟南芥乙烯信号转导通路涉及基因序列，分别包括上游1000bp、下游1000bp、5’端非编码区、3’端非编码区、cds区（编码区）序列。
1．2 实验方法
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）2
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.1.1参比序列3
1.1.2 目标序列3
1.2 方法 3
1.2.1获取拟南芥全基因组BSseq数据3
1.2.2查找拟南芥乙烯信号转导通路及其基因3
1.2.3获取乙烯信号通路基因序列4
1.2.4 Bismark软件序列比对获得各位点甲基化率4
1.2.5甲基化数据处理与分析4
2结果与分析4
2.1拟南芥乙烯信号通路基因4
2.2甲基化数据分析4
2.2.1甲基化位点多分布在编码区和上游1000bp处4
2.2.2同类基因在不同序列区域甲基化分布有差异5
2.2.3不同株野生型拟南芥相同基因甲基化分布存在差异5
3讨论6
3.1拟南芥乙烯信号通路基因可能通过甲基化机制调控6
3.2乙烯与其他途径的交叉反应可能共同决定了乙烯通路基因的甲基化状态7
3.3具体甲基化调控机制有待进一步实验验证7
致谢7
参考文献8
附录A Bismark软件本次实验运行使用的关键命令及参数9
附录B 各株野生型拟南芥中乙烯信号通路基因上游1000bp内甲基化位点数目10
拟南芥乙烯信号转导与应答通路中基因甲基化的生物信息学研究
引言
引言
DNA甲基化是存在于高等真核生物中重要的表观遗传机制，在植物基因组中，对称的CG位点、CHG位点和不对称的CHH位点均会发生5甲基胞嘧
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
啶甲基化修饰。对拟南芥基因组甲基化状态的分析获得了拟南芥甲基化图谱，整个基因组中CpG位点有24%被甲基化修饰，CHG和CHH位点分别为6.7%和1.7%[1]。DNA甲基化在多种生理活动中有重要作用——包括基因组印记[2]、转座元件沉默[3]、干细胞分化[4]、胚胎发育[5]等。在植物细胞中，DNA甲基化有两个重要作用——转座元件沉默和调控基因表达。在模式植物拟南芥中，DNA甲基化主要出现在散布的重复序列中，而局部串联或者反向的重复序列也常常被甲基化，转座子甲基化的减少通常会导致转座子的移动，体现了甲基化保护基因组的功能[6]。
在有些情况下，DNA甲基化也能调控基因的表达。FWA转录因子就是受DNA甲基化调控的例子，转录起始区域串联重复序列的甲基化导致了FWA基因只能在胚外内胚层表达而不能在植物的其他组织中表达。在植物细胞中，启动子区域的DNA甲基化通常抑制转录，但编码区的甲基化通常不影响基因表达[7]。最近的微阵列分析发现CG甲基化也能发生在基因的3’端，但是其功能未知[8]。
高通量测序技术和微阵列技术的发展使多样本和高分辨率的基因组甲基化作图成为可能，同时也对产生的大量数据的处理提出了挑战，目前DNA甲基化作图方法可分为三种：重亚硫酸盐高通量测序、重亚硫酸盐微阵列分析和基于DNA片段富集的方法[9]。本实验采用重亚硫酸盐高通量测序法，使用Babraham研究所开发的Bismark软件比对分析，从而可使甲基化作图达到单个碱基水平。Bismark软件具有比对速度快、支持双末端等特点[10]。
气态植物激素乙烯在植物生长发育以及应对生物和非生物胁迫中起着非常重要的作用：包括种子萌发、细胞伸长、果实成熟、器官衰老、细胞程序性死亡病原体攻击等[11] [12]。当对植物施加外源性的乙烯或者其前体1氨基环丙烷基羧酸（ACC）时，会诱发典型的“三重反应”。在模式植物拟南芥中表现为下胚轴和根细胞伸长的抑制、下胚轴横向膨胀和胚轴顶钩的过分弯曲[13]。根据反常的“三重反应”，研究人员筛选出很多拟南芥乙烯相关突变体。得益于对这些突变体的研究，从内质网膜上乙烯的感知到细胞核内转录调控的信号通路被发现[14]。郭红卫等将拟南芥对乙烯的响应分为三个层次，分别是早期事件、下游事件以及与其他信号之间的交互作用[15]。本文涉及的基因主要位于早期事件和下游事件。
在乙烯信号通路中，其中ETR1、ETR2、ERS1、ERS2、EIN4是乙烯受体，他们在氨基端即乙烯结合端同源性最高，与他们具有相似的乙烯结合能力一致[16]。CTR1的氨基端能与乙烯受体的羧基端结合，是乙烯反应的负调控元件[17]。EIN2是位于受体/CTR1复合物下游的乙烯反应的正调控元件[18]。EIN3是植物特有的转录因子，EIN3和EIL1是调节乙烯反应主要的转录因子[19]，而EIL1和EIL2在植物特定生长时期或特定组织中可能介导乙烯反应。生化反应表明EIN3和EIL1能直接结合到ERF1基因启动子部位。EBF1和EBF2是两类能调节EIN3蛋白稳定性的Fbox蛋白[20]。
植物激素信号转导和染色体修饰是网络状而不是线性的，多种调控通路和激素信号通路同时作用于染色体的甲基化修饰，因此很少文章报道激素信号与甲基化调控之间的关系[21]。但拟南芥基因组中有24%的CpG位点被甲基化修饰，植物激素信号转导很有可能受甲基化修饰调控。
本实验旨在用生物信息学方法初步探讨乙烯信号转导涉及主要基因是否受到甲基化调控。初步了解拟南芥中甲基化位点分布的规律，同时为筛选受甲基化调控基因提供一种简单、快速而又相对准确的方法，为后期的实验提供借鉴。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 参比序列 北半球30株的野生型拟南芥全基因组的亚硫酸氢盐序列（bisulfite sequencing）作为参比序列（reference genome）。
1．1．2 目标序列 即希望获得甲基化位点分布情况的序列，本实验为拟南芥乙烯信号转导通路涉及基因序列，分别包括上游1000bp、下游1000bp、5’端非编码区、3’端非编码区、cds区（编码区）序列。
1．2 实验方法
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