抗虫抗除草剂转基因水稻T1C19杂草化潜力的研究
抗虫抗除草剂转基因水稻T1C19杂草化潜力的研究[20200614171937]
摘要：芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，可以分泌大量胞外蛋白，是重要的工业酶制剂生产菌株。能形成芽孢插入重复突变和置换等位基因是细菌定向诱变最常用的两种方法。但是这两种方法都会受到多种因素限制，从而影响后期对于突变株表型的观测。使用温敏质粒或自杀基因进行负筛选，可以很好避免这些限制。本研究利用的一个点突变形式的pheS编码高度保守的苯丙氨酰-tRNA合酶的α亚基的pheS*基因，通过PCR扩增加入枯草芽孢杆菌强启动子PgrosE-69，将它与pDG1730连接构建重组质粒，运用化学转化法导Bacillus subtilis 168中。结果表明，pheS*基因可以在Bacillus subtilis 168中稳定表达。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
关键字:pheS*；Bacillussubtilis168；负筛选
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1药品试剂2
1.1.2实验菌株2
1.1.3培养基2
1.1.4仪器3
1.1.5 pheS*基因3
1.2方法3
1.2.1pheS*基因的扩增3
1.2.2pheS*基因的测序4
1.2.3pheS*基因pDG1730质粒连接构建载体4
1.2.4pheS*基因转化Bacillus subtilis 1685
2结果与分析5
2.1pheS*基因的扩增5
2.2pheS*基因的测序验证6
2.3pheS*基因与pDG1730质粒连接构建载体6
2.4 pheS*基因转化Bacillus subtilis 168 8
3 讨论 10
致谢11
参考文献12
附录一 PgrosE-69序列13
附录二 pheS*基因序列14
pheS*基因的改造以及在Bacillus subtilis 168的表达
生物技术 余沛文
引言
传统的基因操作技术在进行基因插入表达通常会添加一个筛选标记基因，如氯霉素、红霉素等抗生素抗性基因。这样可以直观简便的观察到目的基因是否转入表达[1]。但是这样的方法也受到多种因素限制，在基因敲除时为了检测同源重组后被敲除目的基因的细胞，常采用温敏质粒或自杀基因进行负筛选[2]。目前常用的负筛选标记如下（表一） *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
[3]。
表一. 目前常用的负筛选标记及其作用机理
负筛选标记 功能描述
sacB 枯草芽孢杆菌基因，编码蔗糖6-果糖基转移酶，能将蔗糖转换成果聚糖，对细菌是有害的。
rpsL 编码核糖体作为链霉素目标的12S蛋白质亚基。
tetAR 提供四环素抗性和亲脂性化合物敏感性。
lacY 编码乳糖渗透酶，使细菌对硝基半乳糖苷敏感。
ccdB 编码细胞消亡蛋白，是一种具有强力毒性的细菌促旋酶。
芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，能形成芽孢，子囊中包含一个芽孢。可以分泌大量胞外蛋白，是重要的工业酶制剂生产菌株[4]。目前世界工业酶制剂产品的产值芽孢杆菌约占了8亿美元[5]。1958年，Spizizen发现Bacillus subtilis 168可以作为转化菌株，芽孢杆菌的遗传学工作得到深入发展[6]。Bacillus subtilis 168的全基因组测序已于1997年完成[7]。在基因组全部序列已知的情况下，Bacillus subtilis 168成为工业生产，实验研究不可或缺的重要模式菌株。
本研究选用pheS作为负筛选标记。pheS编码高度保守的苯丙氨酰-tRNA合酶的α亚基的基因。在先前的大肠杆菌研究中发现，在点突变后的pheS*将编码的第294位氨基酸由丙氨酸变为甘氨酸后，变异后的α亚基可以结合苯丙氨酸类似物，例如氯代苯丙氨酸。若核糖体使用氯代苯丙氨酸作为原料合成蛋白质，因正常氨基酸无法与氯代苯丙氨酸连接而导致蛋白质合成失败，从而使细胞致死[2]。不含pheS*基因的细菌不能使用氯代苯丙氨酸因而可以在含有氯代苯丙氨酸的培养基中存活。
PgrosE-69（序列见附录一）是枯草芽孢杆菌内强启动子，长128bp。可以大幅提高芽芽孢杆菌内基因的表达效率[8]。因此，可以将PgrosE-69分为三段设计成特异性极强的正向引物对pheS*基因进行特异性PCR扩增。通过三轮PCR扩增，将PgrosE-69启动子序列添加到pheS*基因基因前端，改造成能够在芽孢杆菌中表达的pheS*基因[9，10]。将改造后的pheS*基因与pDG1730质粒连接，构建重组质粒，运用化学转化法导Bacillus subtilis 168中进行培养[11，12]，加入氯代苯丙氨酸进行筛选。
本研究将初步摸索探究使用pheS*基因作为负筛选标记在Bacillus subtilis 168内进行筛选操作的基本流程，为后续pheS*基因负筛选以及Bacillus subtilis 168内其他负筛选标记的选择的理论研究以及实际应用奠定坚实基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品试剂
酵母粉、蛋白胨、琼脂、氯化钠、K2HPO4、KH2PO4、（NH4）2 SO4、柠檬酸钠、MgSO4 等，所有试剂均为分析纯。PCR扩增所用Phusion酶购自New England Biolabs生物公司。PCR产物加A尾所用Taq酶，EcoRI、BamHI、XhoI等限制性核酸内切酶，pDG1730，pUC 19T等质粒载体购自Takara生物公司。质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自捷瑞生物公司。
1.1.2 实验菌株
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
> E coli DH5α，Bacillus subtilis 168。
1.1.3 培养基
LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，加入ddH2O补至1L，pH值自然(121℃灭菌，30 min)；
LB固体培养基：酵母粉5g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂18g，加入ddH2O补至1L，pH值自然(121℃灭菌，30 min)。
10×最低盐溶液：K2HPO4 14g，KH2PO4 6g，（NH4）2 SO4 2g，柠檬酸钠1g，MgSO4 0.1g，加入ddH2O补至100mL。(121℃灭菌，30 min)。
色氨酸溶液：2mg/mL(115℃灭菌，40 min)。
酵母液：2mg/mL(115℃灭菌，40 min)。
GMI溶液：1×最低盐溶液95mL，50%葡萄糖1mL，5%水解络蛋白0.4mL，10%酵母液1mL，色氨酸2.5mL。
GMII溶液：1×最低盐溶液97.5mL，50%葡萄糖1mL，5%水解络蛋白0.08mL，10%酵母液0.04mL，色氨酸0.5mL,0.5M MgCl2 0.5mL，0.1M CaCl2 0.5mL。
YEG培养基：0.5%酵母粉，1%氯化钠，0.4%葡萄糖。
YEG p-Cl-Phe筛选培养基：YEG培养基，10mM p-Cl-Phe。
1.1.4 仪器
GSP-9050MBE隔水式恒温培养箱、THZ-C台式恒温振荡器、H1650-W小型高速离心机、AIRTECH超净工作台、DYY-8C型电泳仪、2720Thermal cycler PCR扩增仪。
1.1.5 pheS*基因
Solution I 5μL。
16℃过夜。
3. 讨论
本研究对常用负筛选标记基因pheS*的改造，通过设计特异性引物进行三轮PCR扩增在pheS*基因上游加入枯草芽胞杆菌强启动子PgrosE-69。再将目的基因与pDG1730质粒构建载体，转化导入Bacillus subtilis 168中，使pheS*基因在Bacillus subtilis 168中表达。通过实验可知，氯代苯丙氨酸对野生型Bacillus subtilis 168的生长有一定的抑制作用，但转入pheS*基因后，氯代苯丙氨酸对转基因菌株的抑制作用明显，说明pheS*基因在Bacillus subtilis 168中表达量较高。
摘要：芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，可以分泌大量胞外蛋白，是重要的工业酶制剂生产菌株。能形成芽孢插入重复突变和置换等位基因是细菌定向诱变最常用的两种方法。但是这两种方法都会受到多种因素限制，从而影响后期对于突变株表型的观测。使用温敏质粒或自杀基因进行负筛选，可以很好避免这些限制。本研究利用的一个点突变形式的pheS编码高度保守的苯丙氨酰-tRNA合酶的α亚基的pheS*基因，通过PCR扩增加入枯草芽孢杆菌强启动子PgrosE-69，将它与pDG1730连接构建重组质粒，运用化学转化法导Bacillus subtilis 168中。结果表明，pheS*基因可以在Bacillus subtilis 168中稳定表达。
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关键字:pheS*；Bacillussubtilis168；负筛选
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1药品试剂2
1.1.2实验菌株2
1.1.3培养基2
1.1.4仪器3
1.1.5 pheS*基因3
1.2方法3
1.2.1pheS*基因的扩增3
1.2.2pheS*基因的测序4
1.2.3pheS*基因pDG1730质粒连接构建载体4
1.2.4pheS*基因转化Bacillus subtilis 1685
2结果与分析5
2.1pheS*基因的扩增5
2.2pheS*基因的测序验证6
2.3pheS*基因与pDG1730质粒连接构建载体6
2.4 pheS*基因转化Bacillus subtilis 168 8
3 讨论 10
致谢11
参考文献12
附录一 PgrosE-69序列13
附录二 pheS*基因序列14
pheS*基因的改造以及在Bacillus subtilis 168的表达
生物技术 余沛文
引言
传统的基因操作技术在进行基因插入表达通常会添加一个筛选标记基因，如氯霉素、红霉素等抗生素抗性基因。这样可以直观简便的观察到目的基因是否转入表达[1]。但是这样的方法也受到多种因素限制，在基因敲除时为了检测同源重组后被敲除目的基因的细胞，常采用温敏质粒或自杀基因进行负筛选[2]。目前常用的负筛选标记如下（表一） *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
[3]。
表一. 目前常用的负筛选标记及其作用机理
负筛选标记 功能描述
sacB 枯草芽孢杆菌基因，编码蔗糖6-果糖基转移酶，能将蔗糖转换成果聚糖，对细菌是有害的。
rpsL 编码核糖体作为链霉素目标的12S蛋白质亚基。
tetAR 提供四环素抗性和亲脂性化合物敏感性。
lacY 编码乳糖渗透酶，使细菌对硝基半乳糖苷敏感。
ccdB 编码细胞消亡蛋白，是一种具有强力毒性的细菌促旋酶。
芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，能形成芽孢，子囊中包含一个芽孢。可以分泌大量胞外蛋白，是重要的工业酶制剂生产菌株[4]。目前世界工业酶制剂产品的产值芽孢杆菌约占了8亿美元[5]。1958年，Spizizen发现Bacillus subtilis 168可以作为转化菌株，芽孢杆菌的遗传学工作得到深入发展[6]。Bacillus subtilis 168的全基因组测序已于1997年完成[7]。在基因组全部序列已知的情况下，Bacillus subtilis 168成为工业生产，实验研究不可或缺的重要模式菌株。
本研究选用pheS作为负筛选标记。pheS编码高度保守的苯丙氨酰-tRNA合酶的α亚基的基因。在先前的大肠杆菌研究中发现，在点突变后的pheS*将编码的第294位氨基酸由丙氨酸变为甘氨酸后，变异后的α亚基可以结合苯丙氨酸类似物，例如氯代苯丙氨酸。若核糖体使用氯代苯丙氨酸作为原料合成蛋白质，因正常氨基酸无法与氯代苯丙氨酸连接而导致蛋白质合成失败，从而使细胞致死[2]。不含pheS*基因的细菌不能使用氯代苯丙氨酸因而可以在含有氯代苯丙氨酸的培养基中存活。
PgrosE-69（序列见附录一）是枯草芽孢杆菌内强启动子，长128bp。可以大幅提高芽芽孢杆菌内基因的表达效率[8]。因此，可以将PgrosE-69分为三段设计成特异性极强的正向引物对pheS*基因进行特异性PCR扩增。通过三轮PCR扩增，将PgrosE-69启动子序列添加到pheS*基因基因前端，改造成能够在芽孢杆菌中表达的pheS*基因[9，10]。将改造后的pheS*基因与pDG1730质粒连接，构建重组质粒，运用化学转化法导Bacillus subtilis 168中进行培养[11，12]，加入氯代苯丙氨酸进行筛选。
本研究将初步摸索探究使用pheS*基因作为负筛选标记在Bacillus subtilis 168内进行筛选操作的基本流程，为后续pheS*基因负筛选以及Bacillus subtilis 168内其他负筛选标记的选择的理论研究以及实际应用奠定坚实基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品试剂
酵母粉、蛋白胨、琼脂、氯化钠、K2HPO4、KH2PO4、（NH4）2 SO4、柠檬酸钠、MgSO4 等，所有试剂均为分析纯。PCR扩增所用Phusion酶购自New England Biolabs生物公司。PCR产物加A尾所用Taq酶，EcoRI、BamHI、XhoI等限制性核酸内切酶，pDG1730，pUC 19T等质粒载体购自Takara生物公司。质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自捷瑞生物公司。
1.1.2 实验菌株
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
> E coli DH5α，Bacillus subtilis 168。
1.1.3 培养基
LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，加入ddH2O补至1L，pH值自然(121℃灭菌，30 min)；
LB固体培养基：酵母粉5g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂18g，加入ddH2O补至1L，pH值自然(121℃灭菌，30 min)。
10×最低盐溶液：K2HPO4 14g，KH2PO4 6g，（NH4）2 SO4 2g，柠檬酸钠1g，MgSO4 0.1g，加入ddH2O补至100mL。(121℃灭菌，30 min)。
色氨酸溶液：2mg/mL(115℃灭菌，40 min)。
酵母液：2mg/mL(115℃灭菌，40 min)。
GMI溶液：1×最低盐溶液95mL，50%葡萄糖1mL，5%水解络蛋白0.4mL，10%酵母液1mL，色氨酸2.5mL。
GMII溶液：1×最低盐溶液97.5mL，50%葡萄糖1mL，5%水解络蛋白0.08mL，10%酵母液0.04mL，色氨酸0.5mL,0.5M MgCl2 0.5mL，0.1M CaCl2 0.5mL。
YEG培养基：0.5%酵母粉，1%氯化钠，0.4%葡萄糖。
YEG p-Cl-Phe筛选培养基：YEG培养基，10mM p-Cl-Phe。
1.1.4 仪器
GSP-9050MBE隔水式恒温培养箱、THZ-C台式恒温振荡器、H1650-W小型高速离心机、AIRTECH超净工作台、DYY-8C型电泳仪、2720Thermal cycler PCR扩增仪。
1.1.5 pheS*基因
Solution I 5μL。
16℃过夜。
3. 讨论
本研究对常用负筛选标记基因pheS*的改造，通过设计特异性引物进行三轮PCR扩增在pheS*基因上游加入枯草芽胞杆菌强启动子PgrosE-69。再将目的基因与pDG1730质粒构建载体，转化导入Bacillus subtilis 168中，使pheS*基因在Bacillus subtilis 168中表达。通过实验可知，氯代苯丙氨酸对野生型Bacillus subtilis 168的生长有一定的抑制作用，但转入pheS*基因后，氯代苯丙氨酸对转基因菌株的抑制作用明显，说明pheS*基因在Bacillus subtilis 168中表达量较高。
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