六种中药提取物对德里腐霉抑制效果的研究
目 录
1 引言1
2 材料与方法3
2.1 供试材料与地点3
2.1.1 供试材料3
2.1.2 实验地点3
2 . 1 . 3 德里腐霉的制备和培养3
2.1.4试验方法4
2.2 试验设计4
2.2.1 对六种中药提取物的处理 4
2.2.2 六种中药提取物对德里腐霉抑制作用的初步探究与筛选5
2.2.3 六种中药提取物对德里腐霉抑制作用的二次筛选5
2.3 测定方法5
2.3.1 测定方法5
2.3.2 计算公式与软件5
3 结果与分析6
3.1 六种中药提取物对德里腐霉抑制作用初次筛选6
3.2 六种中药提取物对德里腐霉抑制作用的二次筛选6 4 讨论 10
结论11
致谢12
参考文献13
1 引言
腐霉是一类分布范围较广的重要菌物，可腐生、寄生或兼性寄生。主要分布在马来西亚、中国、巴布亚新几内亚、尼加拉瓜、印度、印度尼西亚、法国等地。世界上发现并报道的腐霉有200种左右，我国报道腐霉也已经达到58种。腐霉的寄主范围比较广，可寄生在很多植物上，能引起植物根颈腐、根腐、猝倒和苗腐等病害以及储藏期种子、水果和蔬菜等的腐烂，在国内国外都造成较大的损失。据目前统计报道，有80多种腐霉为植物重要的病原菌, 然而，有些腐霉种类如棘腐霉和寡雄腐霉等能杀死或抑制其他植物病原菌，具有生物防治的价值；还有些腐霉种类如终极腐霉、畸雌腐霉等 ，能分泌有益化合物，在工、农业和医药上具有重要的应用价值[]。
腐霉一般式是以腐霉形态学特征结合生理生化性状等 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
生物学特征来进行分类的。其中，形态学分类占腐霉分类的主要地位。典型的以形态学分类为主的腐霉分类方法是根据藏卵器的形状、着生方式、突起物的形状及其有无，卵孢子的大小、壁的厚度、雄器的来源(同丝生、异丝生、下位生)、是否充满藏卵器，数目、形状、位置，孢子囊的大小、形态、是否具有层出现象等比较稳定的形态特征作为主要分种的依据，菌丝膨大体的形状、有无，厚垣孢子的有无，有性生殖的配合方式(同宗配合、异宗配合) 最适、最低、最高生长温度作为分种的重要参考性状进行分类的。
中国对于腐霉的研究始于俞大绂 1934 年研究黄瓜猝倒病，他首次报道了第一个腐霉种瓜果腐霉 Pythium aphanidermatum (Yu TF,1934)。在此后的40多年中，他陆续研究报道了中国腐霉共15种。余永年自1961年始，对中国的腐霉进行了较全面的研究，至1973年已鉴定出40多种(其中 5 个为新种) ，1993 年报道了云南19个腐霉种(含1个新种和3个中国新记录种)和宁夏10个腐霉种(含 1个中国新记录种)(余永年,1993)[]，1998 年在《中国腐霉志》--霜霉目专著中描述了已报道的56种腐霉(余永年,1998)[]。 戴芳澜(1979)、张炳欣(1988)、沈杰（1994）、王政逸（1995,1996）、王国良等(2000)、蒋继志（1992）、王晓鸣（1994）、王家和（1997）等学者对我国部分省区的腐霉从种群消长、生态分布、致病性等各方面进行了研究报道[][]。谢焕儒(1976)对中国台湾腐霉进行了调查研究，报道了腐霉 27 种。赖传雅、袁高庆等对广西南宁地区的腐霉进行了调查，鉴定出腐霉 13 种并发表了2个新种镰雄腐霉 Py.falciform 和南宁腐霉 Py.nanningense ( 赖传雅，2000；袁高庆，2001，2003)[]。目前，中国已报道的腐霉共有58种。
卢学根以自来水作为溶剂, 对艾叶提取物中的抑菌物质的提取条件进行了研究, 有结果分析得到了最佳提取条件。将该物质对几种常见的食品微生物进行抑菌活性实验, 发现艾叶提取物中的抑菌物质对细菌的抑制效果明显, 酵母次之, 对霉菌效果一般[]。时维静、路振香和李立顺用K-B 纸片扩散法对大肠杆菌、绿脓杆菌、副伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌和进行抑菌试验。结果:白头翁不同提取物、白头翁汤的组成药物对以上细菌均有抑菌作用。结论:白头翁中的原白头翁素抑菌效果最好[]。杨勇、叶小利和李学刚认为黄连中黄连生物碱均为黄连的抗菌活性成分, 抑菌谱相同, 但抑菌活性有较大差异；4种黄连生物碱对耐药金葡菌的耐药性具有消除作用[]。云宝仪, 周 磊, 谢鲲鹏, 汪业菊, 谢明杰认为黄芩中黄芩素对金黄色葡萄球菌有显著抑制作用, 其抑菌作用是通过影响细胞膜的通透性,抑制菌体内蛋白质合成, 抑制细菌代谢和DNA 拓扑异构酶等多靶点来实现的[]。郑津辉, 王威, 黄辉研究证明浓度为0.556 g/ L 的苦参黄酮类化合物对大肠杆菌、葡萄球菌抑菌圈直径分别为8.0 , 11.1 mm , 对啤酒酵母菌和产黄青霉的抑菌圈直径分别为10.0, 11.9 mm ;苦参黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、啤酒酵母菌、产黄青霉、黑曲霉的最小抑菌浓度分别为5 .6 ×10 -3 , 0 .56 , 0 .28, 0.56 ,0 .56 g/ L.由此得出结论, 苦参中黄酮类化合物对细菌和真菌都有抑制作用, 对 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
革兰氏阳性菌的作用强于革兰氏阴性菌, 对单细胞真菌作用强于丝状真菌[].周宝利，尚 淼，孟思达，陈志霞，李兴宝，李沛瑶认为蛇床子不同溶剂提取物对供试菌种均表现出抗菌效果，并筛选出最佳提取溶剂为乙醇（φ＝95%），其抑菌率达到76.92%[]。蛇床子、苦参、艾叶、黄芩、黄连和白头翁中药抑菌效果都有研究，但是六种中药提取物对德里腐霉的抑制效果的研究很少。
植物病害一直是使农作物产量降低的重要因素，而且大多数人使用传统的化学药剂防治，病菌慢慢地产生了抗药性，导致防治效果逐年下降[]，而且农药残留对人、畜和环境都有危害。此外，由于施药主要以果实为中心，也造成大量果实的农药污染[]。利用天然植物提取物的抑菌作用来防治作物真菌性病害，是近年来国内外研究的热点[]。中药提取物抑制有害生物生长的方法，具有无毒、无害、无污染和不易产生抗药性等优点，因此本实验主要尝试使用蛇床子、苦参、艾叶、黄芩、黄连和白头翁六种中药提取物对德里腐霉的生长的抑制作用。其目的是通过生防效果研究，减少植物病害，提高作物产量。
2 材料与方法
2.1 供试材料与地点
2.1.1 供试材料
供试菌种：德里腐霉（Pythium, deliense ,meurs）
（本实验室保存）
供试中药：蛇床子（成熟果实）
苦参（根）
艾叶（叶）
黄芩（根）
黄连（根茎）
白头翁（根）
（上述六种中药提取物均由本校制药专业老师以及学生提供）
2.1.2 实验地点：2016年校内试验基地。
2.1.3 德里腐霉的制备和培养：
（1）、PDA 培养基的制备：PDA培养基是人们对马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即Potato Dextrose Agar （Medium），依次对应马铃薯、葡萄糖、琼脂的英文。
1 引言1
2 材料与方法3
2.1 供试材料与地点3
2.1.1 供试材料3
2.1.2 实验地点3
2 . 1 . 3 德里腐霉的制备和培养3
2.1.4试验方法4
2.2 试验设计4
2.2.1 对六种中药提取物的处理 4
2.2.2 六种中药提取物对德里腐霉抑制作用的初步探究与筛选5
2.2.3 六种中药提取物对德里腐霉抑制作用的二次筛选5
2.3 测定方法5
2.3.1 测定方法5
2.3.2 计算公式与软件5
3 结果与分析6
3.1 六种中药提取物对德里腐霉抑制作用初次筛选6
3.2 六种中药提取物对德里腐霉抑制作用的二次筛选6 4 讨论 10
结论11
致谢12
参考文献13
1 引言
腐霉是一类分布范围较广的重要菌物，可腐生、寄生或兼性寄生。主要分布在马来西亚、中国、巴布亚新几内亚、尼加拉瓜、印度、印度尼西亚、法国等地。世界上发现并报道的腐霉有200种左右，我国报道腐霉也已经达到58种。腐霉的寄主范围比较广，可寄生在很多植物上，能引起植物根颈腐、根腐、猝倒和苗腐等病害以及储藏期种子、水果和蔬菜等的腐烂，在国内国外都造成较大的损失。据目前统计报道，有80多种腐霉为植物重要的病原菌, 然而，有些腐霉种类如棘腐霉和寡雄腐霉等能杀死或抑制其他植物病原菌，具有生物防治的价值；还有些腐霉种类如终极腐霉、畸雌腐霉等 ，能分泌有益化合物，在工、农业和医药上具有重要的应用价值[]。
腐霉一般式是以腐霉形态学特征结合生理生化性状等 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
生物学特征来进行分类的。其中，形态学分类占腐霉分类的主要地位。典型的以形态学分类为主的腐霉分类方法是根据藏卵器的形状、着生方式、突起物的形状及其有无，卵孢子的大小、壁的厚度、雄器的来源(同丝生、异丝生、下位生)、是否充满藏卵器，数目、形状、位置，孢子囊的大小、形态、是否具有层出现象等比较稳定的形态特征作为主要分种的依据，菌丝膨大体的形状、有无，厚垣孢子的有无，有性生殖的配合方式(同宗配合、异宗配合) 最适、最低、最高生长温度作为分种的重要参考性状进行分类的。
中国对于腐霉的研究始于俞大绂 1934 年研究黄瓜猝倒病，他首次报道了第一个腐霉种瓜果腐霉 Pythium aphanidermatum (Yu TF,1934)。在此后的40多年中，他陆续研究报道了中国腐霉共15种。余永年自1961年始，对中国的腐霉进行了较全面的研究，至1973年已鉴定出40多种(其中 5 个为新种) ，1993 年报道了云南19个腐霉种(含1个新种和3个中国新记录种)和宁夏10个腐霉种(含 1个中国新记录种)(余永年,1993)[]，1998 年在《中国腐霉志》--霜霉目专著中描述了已报道的56种腐霉(余永年,1998)[]。 戴芳澜(1979)、张炳欣(1988)、沈杰（1994）、王政逸（1995,1996）、王国良等(2000)、蒋继志（1992）、王晓鸣（1994）、王家和（1997）等学者对我国部分省区的腐霉从种群消长、生态分布、致病性等各方面进行了研究报道[][]。谢焕儒(1976)对中国台湾腐霉进行了调查研究，报道了腐霉 27 种。赖传雅、袁高庆等对广西南宁地区的腐霉进行了调查，鉴定出腐霉 13 种并发表了2个新种镰雄腐霉 Py.falciform 和南宁腐霉 Py.nanningense ( 赖传雅，2000；袁高庆，2001，2003)[]。目前，中国已报道的腐霉共有58种。
卢学根以自来水作为溶剂, 对艾叶提取物中的抑菌物质的提取条件进行了研究, 有结果分析得到了最佳提取条件。将该物质对几种常见的食品微生物进行抑菌活性实验, 发现艾叶提取物中的抑菌物质对细菌的抑制效果明显, 酵母次之, 对霉菌效果一般[]。时维静、路振香和李立顺用K-B 纸片扩散法对大肠杆菌、绿脓杆菌、副伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌和进行抑菌试验。结果:白头翁不同提取物、白头翁汤的组成药物对以上细菌均有抑菌作用。结论:白头翁中的原白头翁素抑菌效果最好[]。杨勇、叶小利和李学刚认为黄连中黄连生物碱均为黄连的抗菌活性成分, 抑菌谱相同, 但抑菌活性有较大差异；4种黄连生物碱对耐药金葡菌的耐药性具有消除作用[]。云宝仪, 周 磊, 谢鲲鹏, 汪业菊, 谢明杰认为黄芩中黄芩素对金黄色葡萄球菌有显著抑制作用, 其抑菌作用是通过影响细胞膜的通透性,抑制菌体内蛋白质合成, 抑制细菌代谢和DNA 拓扑异构酶等多靶点来实现的[]。郑津辉, 王威, 黄辉研究证明浓度为0.556 g/ L 的苦参黄酮类化合物对大肠杆菌、葡萄球菌抑菌圈直径分别为8.0 , 11.1 mm , 对啤酒酵母菌和产黄青霉的抑菌圈直径分别为10.0, 11.9 mm ;苦参黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、啤酒酵母菌、产黄青霉、黑曲霉的最小抑菌浓度分别为5 .6 ×10 -3 , 0 .56 , 0 .28, 0.56 ,0 .56 g/ L.由此得出结论, 苦参中黄酮类化合物对细菌和真菌都有抑制作用, 对 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
革兰氏阳性菌的作用强于革兰氏阴性菌, 对单细胞真菌作用强于丝状真菌[].周宝利，尚 淼，孟思达，陈志霞，李兴宝，李沛瑶认为蛇床子不同溶剂提取物对供试菌种均表现出抗菌效果，并筛选出最佳提取溶剂为乙醇（φ＝95%），其抑菌率达到76.92%[]。蛇床子、苦参、艾叶、黄芩、黄连和白头翁中药抑菌效果都有研究，但是六种中药提取物对德里腐霉的抑制效果的研究很少。
植物病害一直是使农作物产量降低的重要因素，而且大多数人使用传统的化学药剂防治，病菌慢慢地产生了抗药性，导致防治效果逐年下降[]，而且农药残留对人、畜和环境都有危害。此外，由于施药主要以果实为中心，也造成大量果实的农药污染[]。利用天然植物提取物的抑菌作用来防治作物真菌性病害，是近年来国内外研究的热点[]。中药提取物抑制有害生物生长的方法，具有无毒、无害、无污染和不易产生抗药性等优点，因此本实验主要尝试使用蛇床子、苦参、艾叶、黄芩、黄连和白头翁六种中药提取物对德里腐霉的生长的抑制作用。其目的是通过生防效果研究，减少植物病害，提高作物产量。
2 材料与方法
2.1 供试材料与地点
2.1.1 供试材料
供试菌种：德里腐霉（Pythium, deliense ,meurs）
（本实验室保存）
供试中药：蛇床子（成熟果实）
苦参（根）
艾叶（叶）
黄芩（根）
黄连（根茎）
白头翁（根）
（上述六种中药提取物均由本校制药专业老师以及学生提供）
2.1.2 实验地点：2016年校内试验基地。
2.1.3 德里腐霉的制备和培养：
（1）、PDA 培养基的制备：PDA培养基是人们对马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即Potato Dextrose Agar （Medium），依次对应马铃薯、葡萄糖、琼脂的英文。
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