霍乱弧菌中高亲和力的锌转运蛋白基因、相应调控基因Zur
霍乱弧菌中高亲和力的锌转运蛋白基因、相应调控基因Zur[20200614172115]
摘要：高亲和力的锌离子结合蛋白依赖型（binding-protein-dependent）znu ACB转运蛋白是在锌离子含量很低培养环境中被诱导表达的，其对应的调节基因zur是在高浓度锌离子环境中表达的抑制子。本实验利用LB培养基中添加EDTA后再加入锌离子的方法研究znu。同时在霍乱弧菌中受到基因zur调控的除了znu ACB以外还有另一个ABC转运蛋白，但其离子特异性并不仅仅是锌离子。Luminescence的检测体系的实验结果证明了对应基因的调控表达关系，而乳鼠体内的竞争性定殖实验也证明了znu ACB转运蛋白对霍乱弧菌的定殖能力的重要性。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:锌离子；ABC转运蛋白；吸收；zur；znu
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言 2
1 材料与方法 3
1．1 菌株与质粒 3
1.2 培养基与培养条件 4
1.3 实验用酶及试剂 4
1.4 染色体总DNA的提取 4
1.5 质粒提取 4
1.6大肠杆菌电击感受态细胞的制备及转化 4
1.7 缺失菌株的构建 5
1.8 回复菌株的构建 7
1.9 Luminescence检测菌株的构建 7
1.10 缺失菌株对锌离子敏感性实验 8
1.11 乳鼠肠道定殖实验 8
2 结果与分析 9
2．1 缺失菌株对锌离子敏感性实验 9
2．2 Luminescence的检测Zinc uptake regulator(zur)对znu、vc2551的调控 10
2．3 缺失菌株与Wild type在体内的竞争性定殖 11
3 讨论 11
3．1 转运蛋白znu 和 vc2551-2555在LB培养基中对锌离子敏感性 11
3．2 转运蛋白znu 和 vc2551-2555在LB培养基中对锌离子敏感性 12
3．3 乳鼠肠道定殖能力检测 12
致谢 12
参考文献： 12
附录一 文中所用试剂配方 13
霍乱弧菌中高亲和力的锌转运蛋白基因、相应调控基因Zur
引言
引言 几乎对所有生物而言，锌离子是都是一种重要的微量元素。数量众多的酶 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
和蛋白都需要锌离子作为结构或者催化辅助因子。细胞内的锌稳态是由吸收和外派系统共同调节的【10】。在革兰氏阴性菌中，针对培养基中高（有毒害作用的）、中、低三种锌离子浓度，有三套针对锌离子的吸收与外排通道【3，4】。
在锌离子含量有限的培养条件下，高亲和力的锌离子结合蛋白依赖型（binding-protein-dependent）ABC转运蛋白被诱导表达。高亲和力锌离子转运蛋白（High-affinity zinc ABC transporter)最初在大肠杆菌中发现，同时也发现了ZnuABC是由Zur蛋白调控的（Patzer and Hantke,1998）【1,7】。之后在多种格兰仕阴性菌中都发现了Zn2+ABC转运蛋白，且他们都是由阻遏子（Zur reprossor）调节的。Zur属于离子调节蛋白Fur家族，以锌离子作为效应物（effector），以锌离子稳态作为调节通路。
一般而言锌离子的吸收和外排系统是由各自不同的调节蛋白分别进行转录调节，但是近几年有文献报道在黄单胞菌(Xanthomonas campestris)中发现Zur 不仅能作为阻遏子调节锌离子吸收系统，还能作为激活因子（activator）调节锌离子外排系统【2,6】。
而根据RegPrecise网页信息，在霍乱弧菌中, zur基因调控的不仅是ZnuABC transporter， 还有一个操纵子vc2551,vc2552,vc2553,vc2554,vc2555 也是表达一种离子转运蛋白【5,8】，所以本实验决定研究 vc2551-2555的缺失对锌离子的敏感性以确定其 达的转运蛋白与霍乱弧菌维持锌稳态相关【9】。同时也研究这个操纵子的一些生理表型以及它与zur之间的调控关系。
1 材料与方法
1．1 菌株与质粒
本章供试菌株、质粒及其特性见表1
表1 供试菌株及质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
Strains or Plasmids Characteristics Reference
E.coli strains
DH5λpir F-?D(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 supE44 relA1 λ::pir Lab strain
SM10λpir thi recA thr leu tonA lacY supE RP4±2-Tc::Mu λ::pir Lab strain
V.cholerae strains
C6706 LacZ+ El Tor biotype, Smr, LacZ+ Lab strain
C6706 LacZ- El Tor biotype, Smr, LacZ- Lab strain
Dznu vc2081,vc2082,vc2083 in-frame deletion in C6706 LacZ-, Smr This study This study This study This study This study This study
Dzur vc0378 in-fr *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
ame deletion in C6706 LacZ-, Smr
Dvc2551~2555 vc2551, vc2552, vc2553, vc2554, vc2555 in-frame deletion in C6706 LacZ-, Smr
Dznu/Dvc2551~2555 vc2551, vc2552, vc2553, vc2554, vc2555 in-frame deletion in Dznu LacZ-, Smr
CDzur Complemented strain Pbad24-zur in Dzur Ampr, Smr
CH1 CH2 CH3 pBBRLux-2081 in C6706, Cmr, Smr pBBRLux-2082 in C6706, Cmr, Smr pBBRLux-2551 in C6706, Cmr, Smr This Study This Study This Study
CH_1 CH_2 CH_3 pBBRLux-2081 in Dzur, Cmr, Smr pBBRLux-2082 in Dzur , Cmr, Smr pBBRLux-2551 in Dzur, Cmr, Smr This Study This Study This Study
CH1_R CH2_R CH3_R pBBRLux-2081 in CDzur, Cmr, Smr, Ampr pBBRLux-2082 in CDzur, Cmr, Smr, Ampr pBBRLux-2551 in CDzur, Cmr, Smr, Ampr This Study This Study This Study
znu-1 5ATAGCGGCCGCCGTTCCCGGAGTTAAGCTCAA 3 NotI
MgCl2（25mmol/l） 1.6 μl
VC2082-SpeI 5 GCGACTAGTGCCATGGAATAGAACTCATTTG 3
摘要：高亲和力的锌离子结合蛋白依赖型（binding-protein-dependent）znu ACB转运蛋白是在锌离子含量很低培养环境中被诱导表达的，其对应的调节基因zur是在高浓度锌离子环境中表达的抑制子。本实验利用LB培养基中添加EDTA后再加入锌离子的方法研究znu。同时在霍乱弧菌中受到基因zur调控的除了znu ACB以外还有另一个ABC转运蛋白，但其离子特异性并不仅仅是锌离子。Luminescence的检测体系的实验结果证明了对应基因的调控表达关系，而乳鼠体内的竞争性定殖实验也证明了znu ACB转运蛋白对霍乱弧菌的定殖能力的重要性。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:锌离子；ABC转运蛋白；吸收；zur；znu
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言 2
1 材料与方法 3
1．1 菌株与质粒 3
1.2 培养基与培养条件 4
1.3 实验用酶及试剂 4
1.4 染色体总DNA的提取 4
1.5 质粒提取 4
1.6大肠杆菌电击感受态细胞的制备及转化 4
1.7 缺失菌株的构建 5
1.8 回复菌株的构建 7
1.9 Luminescence检测菌株的构建 7
1.10 缺失菌株对锌离子敏感性实验 8
1.11 乳鼠肠道定殖实验 8
2 结果与分析 9
2．1 缺失菌株对锌离子敏感性实验 9
2．2 Luminescence的检测Zinc uptake regulator(zur)对znu、vc2551的调控 10
2．3 缺失菌株与Wild type在体内的竞争性定殖 11
3 讨论 11
3．1 转运蛋白znu 和 vc2551-2555在LB培养基中对锌离子敏感性 11
3．2 转运蛋白znu 和 vc2551-2555在LB培养基中对锌离子敏感性 12
3．3 乳鼠肠道定殖能力检测 12
致谢 12
参考文献： 12
附录一 文中所用试剂配方 13
霍乱弧菌中高亲和力的锌转运蛋白基因、相应调控基因Zur
引言
引言 几乎对所有生物而言，锌离子是都是一种重要的微量元素。数量众多的酶 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
和蛋白都需要锌离子作为结构或者催化辅助因子。细胞内的锌稳态是由吸收和外派系统共同调节的【10】。在革兰氏阴性菌中，针对培养基中高（有毒害作用的）、中、低三种锌离子浓度，有三套针对锌离子的吸收与外排通道【3，4】。
在锌离子含量有限的培养条件下，高亲和力的锌离子结合蛋白依赖型（binding-protein-dependent）ABC转运蛋白被诱导表达。高亲和力锌离子转运蛋白（High-affinity zinc ABC transporter)最初在大肠杆菌中发现，同时也发现了ZnuABC是由Zur蛋白调控的（Patzer and Hantke,1998）【1,7】。之后在多种格兰仕阴性菌中都发现了Zn2+ABC转运蛋白，且他们都是由阻遏子（Zur reprossor）调节的。Zur属于离子调节蛋白Fur家族，以锌离子作为效应物（effector），以锌离子稳态作为调节通路。
一般而言锌离子的吸收和外排系统是由各自不同的调节蛋白分别进行转录调节，但是近几年有文献报道在黄单胞菌(Xanthomonas campestris)中发现Zur 不仅能作为阻遏子调节锌离子吸收系统，还能作为激活因子（activator）调节锌离子外排系统【2,6】。
而根据RegPrecise网页信息，在霍乱弧菌中, zur基因调控的不仅是ZnuABC transporter， 还有一个操纵子vc2551,vc2552,vc2553,vc2554,vc2555 也是表达一种离子转运蛋白【5,8】，所以本实验决定研究 vc2551-2555的缺失对锌离子的敏感性以确定其 达的转运蛋白与霍乱弧菌维持锌稳态相关【9】。同时也研究这个操纵子的一些生理表型以及它与zur之间的调控关系。
1 材料与方法
1．1 菌株与质粒
本章供试菌株、质粒及其特性见表1
表1 供试菌株及质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
Strains or Plasmids Characteristics Reference
E.coli strains
DH5λpir F-?D(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 supE44 relA1 λ::pir Lab strain
SM10λpir thi recA thr leu tonA lacY supE RP4±2-Tc::Mu λ::pir Lab strain
V.cholerae strains
C6706 LacZ+ El Tor biotype, Smr, LacZ+ Lab strain
C6706 LacZ- El Tor biotype, Smr, LacZ- Lab strain
Dznu vc2081,vc2082,vc2083 in-frame deletion in C6706 LacZ-, Smr This study This study This study This study This study This study
Dzur vc0378 in-fr *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
ame deletion in C6706 LacZ-, Smr
Dvc2551~2555 vc2551, vc2552, vc2553, vc2554, vc2555 in-frame deletion in C6706 LacZ-, Smr
Dznu/Dvc2551~2555 vc2551, vc2552, vc2553, vc2554, vc2555 in-frame deletion in Dznu LacZ-, Smr
CDzur Complemented strain Pbad24-zur in Dzur Ampr, Smr
CH1 CH2 CH3 pBBRLux-2081 in C6706, Cmr, Smr pBBRLux-2082 in C6706, Cmr, Smr pBBRLux-2551 in C6706, Cmr, Smr This Study This Study This Study
CH_1 CH_2 CH_3 pBBRLux-2081 in Dzur, Cmr, Smr pBBRLux-2082 in Dzur , Cmr, Smr pBBRLux-2551 in Dzur, Cmr, Smr This Study This Study This Study
CH1_R CH2_R CH3_R pBBRLux-2081 in CDzur, Cmr, Smr, Ampr pBBRLux-2082 in CDzur, Cmr, Smr, Ampr pBBRLux-2551 in CDzur, Cmr, Smr, Ampr This Study This Study This Study
znu-1 5ATAGCGGCCGCCGTTCCCGGAGTTAAGCTCAA 3 NotI
MgCl2（25mmol/l） 1.6 μl
VC2082-SpeI 5 GCGACTAGTGCCATGGAATAGAACTCATTTG 3
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